Đánh giá sự biểu hiện của gen AtZAT12 trên cây Arabidopsis chuyển gen

Trong nghiên cứu này, các dòng chuyển gen ZAT12 được điều khiển bởi promoter của chính gen ZAT12. Mục tiêu của nghiên cứu là tạo được các dòng chuyển gen AtZAT12 biểu hiện cao (ZAT12 Ox) đáp ứng lại với stress oxy hóa liên quan đến hấp thụ Fe.

Vietnam J Agri Sci 2020, Vol 18, No 8: 545-552 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2020, 18(8): 545-552 www.vnua.edu.vn ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN AtZAT12 TRÊN CÂY ARABIDOPSIS CHUYỂN GEN Lê Thị Tuyết Châm*, Vũ Ngọc Thắng, Vũ Thị Thúy Hằng, Trần Anh Tuấn Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: lttcham@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 26.05.2020 Ngày chấp nhận đăng: 20.07.2020 TÓM TẮT ZAT12 yếu tố phiên mã đáp ứng stress có biểu tăng cao chịu số stress oxy hóa, lạnh nhiệt… ZAT12 liên kết đáp ứng thiếu sắt với stress oxy hóa thơng qua tương tác trực tiếp điều hịa âm tính với yếu tố phiên mã FIT Trong nghiên cứu này, dòng chuyển gen ZAT12 điều khiển promoter gen ZAT12 Mục tiêu nghiên cứu tạo dòng chuyển gen AtZAT12 biểu cao (ZAT12 Ox) đáp ứng lại với stress oxy hóa liên quan đến hấp thụ Fe Chúng tơi tiến hành chọn lọc dịng ZAT12 Ox phương pháp quan sát hạt phát huỳnh quang, đọc trình tự PCR Các dịng đồng hợp tử đánh giá sinh trưởng, biểu mức phiên mã dịch mã Kết chọn dòng dương tính T0 (kí hiệu CH1-1, 1-4, 110 1-14) có sinh trưởng khác biệt, sinh trưởng dòng CH1-1 bị ức chế Trong điều kiện thiếu Fe, dịng ZAT12 Ox có biểu tăng cao, không tăng thêm xử lý thêm với H2O2 Sự biểu gen mức độ dịch mã quan sát thấy dòng CH1-4 Western Blot Từ khóa: ZAT12 Ox, điều kiện thiếu Fe, biểu cao Evaluation of AtZAT12 Gene Expression in Transgenic Arabidopsis ABSTRACT ZAT12 is one of the transcription factors response to abiotic stress, which has had higher expression of ZAT12 under oxidative, cold, and heat stress etc ZAT12 links iron deficiency and oxidative stress responses through direct interaction with and negative regulation of FIT However, in this study, ZAT12 was regulated by ZAT12 native promoter This study aimed to generate ZAT12 with overexpression (ZAT12 Ox) in response to oxidative stress and Fe uptake The attempts of this study were further selected the transgene lines containing 2x35S::ZAT12 by observing the dry seed under fluorescent microscope gene sequencing and PCR The growth and gene expression as well as ZAT12 protein regulation of 2x35S::ZAT12 lines (ZAT12 Ox) were evaluated As the results showed, the positive lines (CH1-1, 1-4, 1-10 and 1-14 lines) with different growth were generated, of which the growth of CH1-1 line was inhibited Expression of AtZAT12 gene induced to response to Fe deficiency, but not to H2O2 supplemented treatment ZAT12 protein of CH1-4 line also detected by Western Blot Keywords: ZAT12 Ox, overexpression, Fe deficiency ĐẶT VẤN ĐỀ Thực vật phải đối mặt với stress môi trường biến đổi gây ra, nên chúng phát huy hết tiềm di truyền chúng Tùy thuộc vào tác động (cấp tính hay lâu dài) thời gian bị stress, thực vật phát triển chương trình cụ thể để đáp ứng với tín hiệu nhận cấp độ khác (Dinneny & cs., 2008) Sắt (Fe) số nguyên tố vi lượng cần thiết cho phát triển thực vật tìm thấy nhóm Fe-S, nhóm nhân heme (Marschner, 1995) Mặc dù cần thiết, Fe hạn chế phát triển thực vật xuất hàm lượng thấp thiếu hụt q nhiều độc tính Sự thiếu hụt Fe dẫn đến triệu chứng thiếu diệp lục non (Marschner, 1995) ảnh hưởng đến máy quang hợp cuối ảnh hưởng đến 545 Đánh giá biểu gen AtZAT12 câY Arabidopsis chuyển gen suất trồng Để ứng phó, thực vật phát triển mạng lưới kiểm soát tốt hấp thu, sử dụng, cân bên chí thải độc có q nhiều Fe dẫn đến tạo gốc tự (ROS) thơng qua phản ứng Fenton ROS tác động lớn đến lipit, protein, ADN cách gây peroxyd hóa lipit, biến tính protein đột biến ADN (Mittler, 2002) Một số nghiên cứu cho thấy biểu yếu tố phiên mã chứa kẽm đáp ứng với stress- AtZAT12 tăng cao chịu số stress stress oxy hóa, lạnh nhiệt… (Iida & cs., 2000; Vogel & cs., 2005; Rizhsky & cs., 2004; Davletovaa,b & cs., 2005) Đây yếu tố phiên mã có chứa motif EAR hoạt động chất ức chế biểu gen Sử dụng kỹ thuật lai nấm men, Le & cs (2016) chứng minh motif EAR cần thiết cho tương tác hai yếu tố phiên mã FIT ZAT12 FIT yếu tố phiên mã trung tâm điều khiển trình hấp thụ sắt hai mầm Le & cs (2016) kết luận ZAT12 liên kết đáp ứng thiếu sắt với stress oxy hóa thơng qua tương tác trực tiếp điều hịa âm tính với FIT (Le & cs., 2016) Trong nghiên cứu này, dòng Arabiopsis chuyển gen ZAT12 biểu cao tạo điều hòa promoter 35S đánh giá sinh trưởng, biểu mức phiên mã dịch mã Kết làm sáng tỏ trình hấp thụ sắt stress oxy hóa điều kiện biểu cao gen AtZAT12 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Cấu trúc HA3-ZAT12 xây dựng để nghiên cứu hoạt động protein ZAT12 sau biến nạp vào Arabidopsis Sau biến nạp dòng T3 đồng hợp tử chọn lọc đánh giá sinh trưởng đánh giá biểu gen mức phiên mã dịch mã Cấu trúc biểu cao HA3-ZAT12 tạo theo công nghệ Gateway (Hình 1) Đầu tiên gen ZAT12 khuếch đại gắn đầu trình tự attB1 attB2 Sản phẩm sau tinh gắn vào vectơ pDONR207 nhờ phản ứng BP Các vectơ chưa gắn gen chuyển mang gen gây chết vị trí gắn, nơi chèn gen đích sau Do đó, vi khuẩn mang vectơ có gen đích gắn vào sống sót Sau trình tự tiếp tục chuyển vào vectơ biểu pALLIGATOR nhờ phản ứng LR để thu cấu trúc cuối p2xCaMV35S::HA3-ZAT12 2.2 Chọn lọc dòng mang gen chuyển sau biến nạp Quá trình biến nạp Arabidopsis thaliana Col-0 thực theo phương pháp nhúng hoa (Clough & Bent, 1998) Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens nuôi cấy môi trường LB (Luria-Bertain) qua đêm 28C, 225 vòng/phút bổ sung thêm kháng sinh Rifampicin, Carbenicillin Spectinomycin Ngày bước ni cấy 500ml mơi trường có chứa acetosyringone loại kháng sinh tương tự nuôi cấy trước Nuôi cấy giữ 28C, 225 vịng/phút giá trị OD dịch nuôi cấy đạt 0,8-1 Vi khuẩn thu đưa vào môi trường xâm nhiễm (bao gồm 10mM MgCl, 10mM MES 100 AcM Acetosyringone, 1% Sucrose, 0,5% Silwet) Dịch vi khuẩn ủ nhiệt độ phòng trước biến nạp Ghi chú: Biểu gen GFP thúc đẩy promoter pAT2S3 sử dụng để chọn lọc hạt biến đổi gen sau biến nạp Hình Cấu trúc T-ADN mang gen HA3 -ZAT12 gZAT12 chèn vào phía sau HA3 vectơ đích pALLIGATOR2 546 Lê Thị Tuyết Châm, Vũ Ngọc Thắng, Vũ Thị Thúy Hằng, Trần Anh Tuấn Cây Arabidopsis bốn tuần tuổi có nụ hoa kín nhúng 30 giây vào dịch huyền phù Agrobacteria tương ứng đưa trở lại phòng nuôi điều kiện ngày dài Cây che chụp nhựa 24 để tăng độ ẩm trồng thêm hai tuần điều kiện ngày dài, trước thu hoạch Hạt biến đổi gen lựa chọn kính hiển vi huỳnh quang để chọn lọc hạt mang vector p ALLIGATOR (hạt chuyển gen cho thấy huỳnh quang GFP, gen GFP có T-ADN (Hình 1) ADN chuyển gen tách chiết gửi đọc trình tự sau chọn lọc PCR với cặp mồi sau attB1HA3 (5`GGGGACAAGTTTGTACAAAAA AGCAGGCTCCATGGCATACCCATACGACG T-3`) ZAT12 genotyping 3’ (5`TTCAAATT GTCCACC ATCCCTAG 3`) Cây chuyển gen sau nhân lên với hệ T3 tự thụ để thu dòng đồng hợp tử Mỗi hệ chọn dịng dương tính phương pháp PCR 2.3 Đánh giá sinh trưởng dòng chuyển gen AtZAT12 có biểu cao Để đánh giá sinh trưởng, hạt chuyển gen dương tính hệ T2 thu được khử trùng bề mặt theo phương pháp mô tả Jakoby & cs (2004) Các hạt đánh giá sinh trưởng thông qua hai hệ thống sinh trưởng sau: - Trong hệ thống sinh trưởng in vitro đĩa thạch Hoagland (Hoagland, 1920) không bổ sung sắt, hạt đặt đĩa vuông điều kiện 21C/19C chu kỳ 16 sáng, tối (điều kiện dài ngày) buồng sinh trưởng thực vật CLF Plant Climatics (CLF, Đức) - Trong hệ thống sinh trưởng đất, qua hệ thống sinh trưởng in vitro môi trường thạch Hoagland chuyển để trồng đất điều kiện dài ngày Trước thu hoạch mẫu cho thí nghiệm đánh giá biểu gen mức phiên mã dịch mã mang gen chuyển đánh giá sinh trưởng thông qua phát triển rễ 2.4 Đánh giá biểu gen AtZAT12 mức độ phiên mã kỹ thuật RealTime PCR Mẫu rễ ngày tuổi (thế hệ T3) sinh trưởng môi trường thạch Hoagland điều kiện không bổ sung sắt xử lý H2O2 (100mM) 1h dùng để tách chiết ARN (theo hướng dẫn SpectrumTM Total RNA Kit, Sigma-Alrich) Thí nghiệm đánh giá biểu gen AtZAT12 sơ ban đầu sử dụng mẫu rễ 30 ngày tuổi sinh trưởng đất điều kiện đủ Fe Tách chiết ARN tổng hợp cADN: ARN tổng số chiết xuất từ khoảng 100mg mẫu Mẫu nghiền thành bột đồng hóa nitơ lỏng tách chiết theo Kit ARN tổng số (SpectrumTM Plant Total RNA Kit, Sigma-Aldrich, Đức) Sau đó, đo nồng độ ARN 1g ARN tổng số sử dụng để tổng hợp cADN theo Kit (Fermentas, Đức) Để giảm thiểu lây nhiễm cADN mẫu, mẫu ARN tổng số xử lý với DNAaseI Sản phẩm cuối cADN pha loãng 1:10 trước thực phản ứng RT-PCR Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bao gồm 10l Takara Premix, 0,2l Primer 5’; 0,2l Primer 3’; 0,1l SYBR green; & 10l cADN Chu trình nhiệt sau: 95C, phút; (95C, 10 giây, 58C 18 giây, 72C, 18 giây) × 40 chu kỳ; 72C, phút; phân tích độ sản phẩm 55-95C giữ mẫu 12C Kết phân tích phần mềm iQ5 (Biorad, Đức) 2.5 Đánh giá biểu gen AtZAT12 mức độ dịch mã kỹ thuật Western Blot Rễ ngày tuổi (thế hệ T3) sinh trưởng đĩa thạch Hoagland dòng CH1-4 thu để thực kỹ thuật Western blot Kỹ thuật thực theo quy trình chuẩn mơ tả Sambrook & cs (1989) Protein tổng số tách chiết có chứa protein HA3-FIT tách gel SDS 10% Quá trình xử lý kháng thể sơ cấp HA sử dụng hệ thống ID SNAP (Millipore, Mỹ) nhà sản xuất Để phát kháng thể thứ cấp kết hợp với peroxidase, sử dụng dụng cụ ECL phim (Amersham, Mỹ) 547 Đánh giá biểu gen AtZAT12 câY Arabidopsis chuyển gen 14 Riêng dịng khơng thu cá thể T3 không hoa sau chết Chúng tơi tiếp tục chọn lọc PCR hệ T1, T2, T3 để thu dòng chuyển gen đồng hợp tử Kết cho thấy gen chuyển AtZAT12 trì hệ T3 2.6 Phân tích kết Số liệu thu thập xử lý phần mềm Excel, plasmid editor (http://biology labs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape) Bio-Rad iQ5 (www.bio-rad-iq5.software.informer.com/) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.2 Đánh giá sinh trưởng dòng chuyển gen AtZAT12 biểu cao 3.1 Chọn lọc dòng Arabidopsis chuyển gen sau biến nạp Đánh giá sinh trưởng dòng chuyển gen dương tính hệ thống sinh trưởng in vitro cho thấy: dịng 10 có sinh trưởng kém, nhỏ so với đối chứng Col-0; dòng 14 có sinh trưởng bình thường giống đối chứng Col-0 (Hình 4) Trong hệ thống trồng đất, dòng sinh trưởng kém, 1-2 hoa T1, hệ không hoa, chết Các dòng 4, 10 14 sinh trưởng tương đương đối chứng Col-0 Theo Le & cs (2016), ZAT12 ức chế phiên mã yếu tố FITmột yếu tố phiên mã trung tâm điều hịa q trình hấp thụ sắt thực vật Khi yếu tố phiên mã ZAT12 có biểu cao dẫn đến ức chế q trình phiên mã FIT, từ ảnh hưởng đến hấp thụ Fe sinh trưởng Sau biến nạp, hạt thu tiến hành chọn lọc hệ T0 dựa phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế: mồi nằm vùng HA3 mồi nằm gen đích ZAT12 (có kích thước ~ 672bp) Kết chọn lọc sau biến nạp kỹ thuật PCR thể hình Ở T0, dịng dương tính dịng kí hiệu 1, 4, 10 14 có kích thước giống dự tính ~672bp Kết hợp với việc đọc trình tự cho thấy cấu trúc HA3-ZAT12 có hướng đọc theo khung đọc Từ dịng đó, tiếp tục chọn lọc hệ T1, T2 T3 để thu dòng chuyển gen đồng hợp tử (Bảng 1) Ở T3, 30 cá thể đồng hợp tử chọn từ dòng 4, 10 M 10 11 12 13 14 15 16 500bp Ghi chú: M: băng chuẩn điện di (GeneRuler TM 100bp Plus DNA ladder); 1-14: dòng chuyển gen T0, 15: đối chứng, vectơ pAlligator 2-ZAT12; 16: đối chứng, vectơ p35S:: ZAT12 Hình Ảnh chọn lọc dịng chuyển gen ZAT12 biểu cao PCR Arabisopsis hệ T0 Bảng Các dòng Arabidopsis dương tính thu sau hệ chọn lọc T1-T3 dòng chuyển gen AtZAT12 biểu cao Tên dòng Ký hiệu dòng Thế hệ T0 (số cá thể) Thế hệ T1 (số cá thể) Thế hệ T2 (số cá thể) Thế hệ T3 (số cá thể) Đồng hợp tử/dị hợp tử Số dòng đồng hợp tử mang gen chuyển CH1-1 10 x x x CH1-4 30 30 30 Đồng hợp tử 10 CH1-10 10 30 30 Đồng hợp tử 14 CH1-14 30 30 30 Đồng hợp tử 548 Lê Thị Tuyết Châm, Vũ Ngọc Thắng, Vũ Thị Thúy Hằng, Trần Anh Tuấn Ghi chú: Các giếng đánh dấu từ 1-20 cá thể dòng hệ T3 Đối chứng (-) ký hiệu H2O đối chứng không chuyển gen ký hiệu WT (Còn 10 cá thể khác cho kết dương tính kích thước gel đủ cho 24 giếng nên kết 10 cá thể chạy gel khác) Hình Kết chọn lọc đại diện cho dòng biểu cao HA3-ZAT12 PCR hệ T3 2x35S::HA3::cZAT12 Col-0 CH1-4 2x35S::HA3::cZAT12 CH1-10 CH1-1 C Ghi chú: Bên trái dòng chuyển gen CH1-1; Bên phải làcây đối chứng Col-0 (ký hiệu C) Hình Sự sinh trưởng dòng chuyển gen 1, 4, 10 hệ thống sinh trưởng in vitro đĩa vuông 3.3 Kết đánh giá biểu gen AtZAT12 mức độ phiên mã Sự biểu gen AtZAT12 tăng lên bị stress oxy hóa, lạnh, nhiệt… (Iida & cs., 2000; Vogel & cs., 2005; Rizhsky & cs., 2004; Davletovaa,b & cs., 2005) Để đánh giá biểu gen AtZAT12 dịng ZAT12 Ox, chúng tơi sử dụng kỹ thuật Real time PCR để đánh giá biểu gen rễ thân Do dòng CH1-1 sinh trưởng nên không thu đủ lượng để tách ARN Do 549 Đánh giá biểu gen AtZAT12 câY Arabidopsis chuyển gen kết trình bày biểu gen AtZAT12 ba mẫu rễ dòng 1, 10 hai mẫu dòng 10 (Hình 5) Kết cho thấy dịng số biểu gen AtZAT12 đối chứng Col-0 rễ thân Dòng 10 có biểu gen AtZAT12 thấp tương đương với đối chứng Col-0 rễ thân Trong dịng có biểu vượt trội so với đối chứng rễ, kiểu hình sinh trưởng so với dòng 10 Do hệ thống sinh trưởng chưa cho thấy biểu cao dòng ZAT12 Ox, ngoại trừ dòng số Căn vào công bố trước Le & cs (2016) biểu AtZAT12 điều kiện thiếu Fe kéo dài, tiến hành thí nghiệm hệ thống sinh trưởng ngày điều kiện thiếu sắt xử lý H2O2 Kết thí nghiệm đánh giá biểu gen AtZAT12 AtFIT thể hình Rễ Thân 140 ZAT12 14000 absolute Giá trị biểu hiệnexpression gen tuyệt đối absolute expression Giá trị biểu gen tuyệt đối 16000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 Col-0 CH 1-1 CH1-4 CH 1-10 ZAT12 120 100 80 60 40 20 Col-0 CH1-4 CH1-10 Ghi chú: Hình bên trái biểu rễ dòng: đối chứng dòng (CH1- 1), dòng (CH 1- 4) dòng 10 (CH 1-10) Hình bên phải kết biểu dòng 10 Col-0: đối chứng Hình Sự biểu gen AtZAT12 rễ thân dòng biểu ZAT12 Ox sinh trưởng đất kỹ thuật Real-time PCR Ghi chú: Cây ngày tuổi sinh trưởng điều kiện thiếu Fe xử lý H2O2 (100mM) thu mẫu rễ cho tách chiết ARN để thực Real time PCR Trục hồnh mơ tả tên dịng điều kiện thí nghiệm: có xử lý H2O2 (kí hiệu: tên dịng, H2O2); khơng xử lý H2O2 (kí hiệu: tên dịng, H2O) Hình Sự biểu gen AtZAT12 gen AtFIT rễ dòng ZAT12 Ox (thế hệ T3) sinh trưởng in vitro kỹ thuật Real-time PCR 550 Lê Thị Tuyết Châm, Vũ Ngọc Thắng, Vũ Thị Thúy Hằng, Trần Anh Tuấn Col-0 CH1-4 25kDa Col-0 Col-0 CH1-4 Col-0 * Ghi chú: Protein ZAT12 phát có kích thước tương đương với dự đốn (đánh dấu * màu đỏ) Hình Biểu gen AtZAT12 mức dịch mã phát kỹ thuật Western Blot (sử dụng kháng thể sơ cấp kháng HA) Các dịng ZAT12 Ox kích hoạt tăng biểu điều kiện đối chứng, dường ngược lại điều kiện xử lý H2O2 (Hình 6) Sự biểu gen AtFIT cho kết ngược lại Kết tương tự với kết công bố trước Le & cs (2016) Trong điều kiện stress thiếu Fe vai trị H2O2 khơng cịn nhân tố gây stress thơng thường 3.4 Kết đánh giá biểu gen AtZAT12 mức độ dịch mã Để đánh giá biểu gen AtZAT12 mức độ dịch mã, dòng chuyển gen ZAT12 Ox biểu cao gắn hemagglutinine (HA) dễ dàng theo dõi hàm lượng protein nhờ kỹ thuật Western Blot sử dụng kháng thể đơn dòng thương mại kháng HA (Lee & cs., 2007) Dòng biến đổi gen số 4, chứa 3HA (p2xCaMV35S::HA3-ZAT12) sử dụng để đánh giá Protein ZAT12 biểu dịng CH 1-4 với kích thước dự tính xấp xỉ 25kDa (đánh dấu * màu đỏ) Như gen ZAT12 dòng chuyển gen hoạt động tạo sản phẩm protein Thế thí nghiệm sau việc tăng biểu điều kiện thiếu hụt Fe (-Fe) xử lý H2O2 chưa có khác biệt Dường có chế kiểm sốt hàm lượng protein tế bào chúng bị phân hủy chúng không cần thiết THẢO LUẬN ZAT12 yếu tố phiên mã liên quan đến mạng lưới tín hiệu đáp ứng lại stress bất thuận Trong nghiên cứu chúng tơi thấy ZAT12 có biểu đáp ứng lại -Fe, dường lại không đáp ứng với H2O2 Kết tương ứng với kết cơng bố trước Le & cs (2016) cho thấy điều kiện thiếu sắt làm tăng hàm lượng gốc tự nên gen ZAT12 biểu để đáp ứng với điều kiện stress Tuy nhiên, có thêm H2O2 biểu không tăng cao dường cần lượng gốc tự đủ để kích hoạt biểu gen ZAT12 Xu & cs (2017) phiên mã ZAT12 tăng cao Arabidopsis với có mặt gốc tự O2− (Xu & cs., 2017).Và FIT- yếu tố phiên mã trung tâm trình hấp thụ Fe dường bị ức chế biểu ZAT12 tăng cao hệ thống sinh trưởng in vitro ngày điều kiện thiếu Fe Kết tương ứng với cơng bố trước Le & cs (2016) Về mặt kiểu hình, dường biểu cao ZAT12 dẫn đến kiểu hình khác Các dịng CH1-1 có kiểu hình khác biệt hồn tồn so với dịng cịn lại, tương tự kết công bố nghiên cứu Iida & cs (2000) Trong nghiên cứu này, dòng chuyển gen ZAT12 biểu cao có nhỏ, cong, cuống ngăn hướng xuống Trong nghiên cứu Vogel & cs (2004), cho thấy kiểu hình chuyển gen ZAT12 biểu cao có bất thường kiểu xanh đen tròn hơn, dày hơn, hàm lượng chlorophyll khối lượng tươi chuyển gen cao 1,5-1,8 lần Nghiên cứu này, chưa cho thấy mức độ biểu cao protein ZAT12 dòng biểu cao 35S::ZAT12 Kết protein ZAT12 thường bị phân hủy qua đường ubiquitin hàm lượng H2O2 có mặt tế 551 Đánh giá biểu gen AtZAT12 câY Arabidopsis chuyển gen bào tăng cao Do cần tìm điều kiện biểu để thu số lượng lớn protein ZAT12 KẾT LUẬN Các dòng biểu cao 35S::ZAT12 có kiểu hình khác biệt, dịng CH1-1 cho kiểu hình ức chế sinh trưởng Biểu ZAT12 mức phiên mã bốn dịng khác nhau, dịng CH1-1 biểu mức độ cao Trong điều kiện thiếu Fe dịng 35S::ZAT12 có biểu tăng cao, xử lý thêm với H2O2 biểu khơng tăng thêm LỜI CẢM ƠN Chúng xin trân trọng cảm ơn GS.TS Petra Bauer thành viên Phịng thí nghiệm Thực vật, Trường Đại học Tổng hợp Saarland, Cộng hòa liên bang Đức tạo điều kiện giúp chúng tơi hồn thành nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Clough S.J & Bent A.F (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of Arabidopsis thaliana The Plant journal: for cell and molecular biology 16(6): 735-743 Davletovaa S., Schlauch K., Coutu J & Mittler R (2005) The zinc-finger protein ZAT12 plays a central role in reactive oxygen and abiotic stress signaling in Arabidopsis Plant physiology 139(2): 847-856 Davletovab S., Rizhsky L., Liang H., Shengquang Z., Oliver D.J., Coutu J., Shulaev V., Schlauch K & Mittler R (2005) Cytosolic ascorbate peroxidase is a central component of the reactive oxygen gene network of Arabidopsis The plant cell 17(1): 268-281 Dinneny J.R., Long T.A., Wang J.Y., Jung J.W., Mace D., Pointer S., Barron C., Brady S.M., Schiefelbein J & Benfey P.N (2008) Cell identity mediates the 552 response of Arabidopsis roots to abiotic stress Science 320(5878): 942-5 Hoagland D.R (1920) Optimum nutrient solutions for plants Science 52 (1354): 562-564 doi:10.1126/ science.52.1354.562 Iida A., Kazuoka T., Torikai S., Kikuchi H & Oeda K (2000) A zinc finger protein RHL41 mediates the light acclimatization response in Arabidopsis The plant journal 24(2): 191-203 Jakoby M, Wang H Y., Reidt W., Weisshaar B & Bauer P (2004) FRU (BHLH029) is required for induction of iron mobilization genes in Arabidopsis thaliana FEBS Lett 577(3): 528-534 Le C.T.T., Brumbarova T., Ivanov R., Stoof C., Weber E & Mohrbacher J., Fink-Straube C & Bauer P (2016) Zinc Finger Ofarabidopsis Thaliana12 (Zat12) interacts with Fer-Like Iron DeficiencyInduced Transcription Factor(FIT) linking iron deficiency and oxidative stress responses Plant Physiol 170: 540-557 Lee S.C., Lan W.Z., Kim B.G., Li Legong, Cheong Y.H., Pandey G.K., Lu G., Buchanan B & Luan S (2007) A protein phosphorylation/ dephosphorylation network regulates a plant potassium channel Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 104(40): 15959-15964 Marschner H (1995) Mineral nutrition of higher plants 2nd ed Academic press p.11 Mittler R (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance Trends Plant Sci 7: 405-410 Rizhsky L., Davletova S., Liang H & Mittler R (2004) The zinc finger protein ZAT12 is required for cytosolic ascorbate peroxidase expression during oxidative stress in Arabidopsis The journal of biological chemistry 279(12): 11736-43 Sambrook J., Fritsch E.F & Maniatis T (1989) Molecular cloning: A laboratory manual 2nd ed New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press Vogel J.T., Zarka D.G., Van Buskirk H.A., Fowler S.G & Thomashow M.F (2005) Roles of the CBF2 and ZAT12 transcription factors in configuring the low temperature transcriptome of Arabidopsis The plant journal 41(2): 195-211 Xu J., Tran T., Padilla Marcia C.S., Braun D.M & Goggin F.L (2017) Superoxide-responsive gene expression in Arabidopsis thaliana and Zea mays Plant Physiol Biochem 117: 51-60  ... (www.bio-rad-iq5.software.informer.com/) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.2 Đánh giá sinh trưởng dòng chuyển gen AtZAT12 biểu cao 3.1 Chọn lọc dòng Arabidopsis chuyển gen sau biến nạp Đánh giá sinh trưởng dòng chuyển gen dương tính hệ thống sinh... biểu gen AtZAT12 câY Arabidopsis chuyển gen kết trình bày biểu gen AtZAT12 ba mẫu rễ dòng 1, 10 hai mẫu dịng 10 (Hình 5) Kết cho thấy dòng số biểu gen AtZAT12 đối chứng Col-0 rễ thân Dịng 10 có biểu. .. Để đánh giá biểu gen AtZAT12 dịng ZAT12 Ox, chúng tơi sử dụng kỹ thuật Real time PCR để đánh giá biểu gen rễ thân Do dòng CH1-1 sinh trưởng nên không thu đủ lượng để tách ARN Do 549 Đánh giá biểu