Kỹ thuật Di truyền trong Chọn giống Thực vật

177 Chương 9 Kỹ thuật Di truyền trong Chọn giống Thực vật I. Mở đầu bào thực vật là biến nạp và biểu hiện các gene ngoại lai trong tế bào thực vật. Biến nạp của các tế bào vi khuẩn được thự . Tuy nhiên, việc cải biến di truyền ở thực vật bậc cao bằng cách đưa DNA ngoại lai vào trong các tế bào của chúng là một quá trình rất phức tạp. Sử dụng enzyme hạn chế (restriction endonucleases) để cắt phân tử DNA sợi đôi thành những đoạn nhỏ riêng rẽ, phát triển kỹ thuật lai DNA-DNA và các gene chỉ thị (marker genes) cho phép chọn lọc các tế bào , động vật và thực vật bậc cao. Những nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin di truyền mới được biến nạp vào các thực vật eukaryote biểu hiện không chỉ ở mức độ tế bào và sau đó mức độ cơ thể hoàn chỉnh mà còn có thể truyền lại cho các thế hệ sau của chúng. Ý nghĩa thực tiễn của quá trình biến nạp là tạo ra những tính trạng mới hoặc cải tiến những tính trạng đã có. Về một số phương diện nào đó, kỹ thuật này có ưu điểm hơn so với phương pháp chọn giống bằng lai hữu tính. Nếu ở phương pháp lai hữu tính, để chuyển được một gene hay một số gene từ một giống này, qua một giống khác người ta phải tiến hành một quy trình lai trở lại tốn rất nhiều thời gian và công sức. Trong khi đó kỹ thuật chuyển gene không những cho phép vượt qua được những trở ngại do sự xa cách về quan hệ họ hàng giữa thể cho gene và nhận gene mà còn cho phép cây trồng tiếp nhận một cách nhanh chóng những gene mới do con người thiết kế. Có thể thực hiện được điều này bằng cách sử dụng các hệ thống vector sinh học, nhưng không phải đều có thể thực hiện được với bất kỳ cây trồng nào. Việc tái sinh các cây được chuyển gene chủ yếu phụ thuộc vào các tế bào soma có tính toàn thể, mà không phải là tế bào soma nào cũng có khả năng đó. Thành tựu nổi bậc của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là tái sinh được cây biến nạp gene đầu tiên vào đầu thập niên 1980. Đến nay, các kỹ thuật phân tử đã được ứng dụng thành công ở nhiều loài khác nhau. Lúc đầu người ta sử dụng các gene chỉ thị để biến nạp, nhưng nay đã thay thế bằng các gene quan trọng có giá trị kinh tế.nhằm mục đích cải thiện phẩm chất cây trồng. Hai nhân tố then chốt thúc đẩy sự phát triển của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là: các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ những tế bào biến nạp và các phương pháp đưa DNA ngoại lai vào các 178 loài thực vật khác nhau. Muốn chuyển một gene thành công cần phải chứng minh hiệu quả của phương pháp biến nạp gene, nhưng đôi khi các loài nghiên cứu hoặc không thể tái sinh được cây từ các mô không phân hoá, hoặc có thể tái sinh nhưng sau đó khó phát triển thành cây hoàn chỉnh. Do đó hai nhân tố nói trên thường được nghiên cứu phát triển song song. Các chỉ thị biến nạp gene đầu tiên đã sử dụng Agrobacterium tumefaciens để đưa vào cây thuốc lá các gene kháng kháng sinh. Agrobacterium là vật truyền hữu hiệu để đưa các DNA ngoại lai vào trong các loài thuộc họ Solanaceae, nhưng ở một số cây trồng khác quan trọng hơn, việc sử dụng nó còn gặp nhiều hạn chế. Trở ngại lớn nhất là tính đặc trưng vật chủ của Agrobacterium, mặc dù những tiến bộ gần đây đã cho phép ứng dụng thành công trên một số giống cây trồng. Sự phát triển của các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ callus và protoplast đã mở ra một hướng mới cho công nghệ di truyền thực vật thông qua các phương pháp biến nạp gene trực tiếp. Nhờ sự phát triển của phương pháp bắn gene (particle bombardment) dựa trên cơ sở tăng gia tốc của các hạt kim loại nặng mang nguyên liệu di truyền vào trong mô thực vật. Việc biến nạp ở các loài cây trồng gặp nhiều thuận lợi hơn. Các phương pháp biến nạp khác cũng có hiệu quả đối với các trường hợp đặc biệt, nhưng khả năng ứng dụng rộng rãi của chúng bị hạn chế. Chẳng hạn các phương pháp biến nạp gene bằng xung điện (electroporation) vào các mô được cắt nhỏ từng phần, phương pháp xử lý hoá học bằng PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection) đưa DNA ngoại lai trực tiếp vào tế bào, phương pháp dùng silicon carbide lắc với tế bào có tác dụng như các mũi kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào, phương pháp biến nạp gene qua ống phấn Kể từ khi tạo được cây chuyển gene đầu tiên, đến nay kỹ thuật này đã có những bước tiến rất lớn. Những thành công của nó không chỉ giới hạn ở những cây mang tính chất mô hình như thuốc lá và các cây họ cà, mf còn đạt được những kết quả ứng dụng ở một số cây trồng quan trọng. Vì thế chúng ta có cơ sở để hy vọng rằng trong tương lai kỹ thuật gene sẽ trở thành một công cụ hỗ trợ không thể thiếu được của chọn giống thực vật. II. Kỹ thuật chuyển gene 1. Những nguyên tắc chung của kỹ thuật chuyển gene Có một số yếu tố sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gene. Không phải tất cả các tế bào trong cơ thể đều có tính toàn thể, các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gene lạ. Một loại cây nào đó có thể được biến nạp khi nó có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Mô tế bào là một tập hợp của nhiều tế bào có phản ứng khác nhau khi gặp một yếu tố tác động đến. Một số ít tế bào trong cây có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Những tế bào 179 khác chỉ có một trong hai khả năng ấy. Một số lớn các tế bào trong cơ thể có khả năng điều chỉnh được khả năng đó, một số khác ngược lại không thể làm được. Tương quan giữa các quần thể tế bào kiểu như vậy phụ thuộc vào loài, kiểu gene, cơ quan, thậm chí tùy từng vùng trong một cơ quan. Một trong các cơ chế có thể chuyển các tế bào từ trạng thái tiềm ẩn sang trạng thái thực sự có khả năng tái sinh là sự xuất hiện thương tổn trên cơ thể. Phản ứng với sự thương tổn có lẽ là cơ sở sinh học cho sự tăng sinh và tái sinh của các tế bào soma. Tuy nhiên phản ứng này khác nhau giữa các loài cây, cũng như giữa các nhóm tế bào trong cùng một cây. Nói chung các cây hòa thảo và các cây họ đậu phản ứng này xảy ra rất yếu. Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA. Vì thế gene chỉ có thể được đưa vào tế bào thông qua Agrobacterium, virus, bằng phương pháp vi tiêm hay bằng súng bắn gene. Việc chuyển gene chỉ thành công khi đưa được gene vào nhóm tế bào có khả năng tái sinh và tiếp nhận gene lạ. Tuy nhiên, khả năng biến nạp không có liên quan chặt chẽ với khả năng biểu hiện của gene được biến nạp. DNA không phải của virus có thể liên kết với hệ gene của vật chủ và không di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác. Trong khi đó các DNA của virus có thể không liên kết với hệ gene của vật chủ, thậm chí cả khi có rất nhiều bản sao trong tế bào chủ. DNA, RNA của virus di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và có thể lan truyền khắp trong cây trừ vùng mô phân sinh. - Phản ứng của các loại tế bào thực vật với quá trình chuyển gene Mục đích chính của một quy trình chuyển gene là đưa một cách ổn định một đoạn DNA vào hệ gene nhân của các tế bào có khả năng phát triển thành một cây biến nạp. Ở nhiều loài thực vật, sự xác định kiểu tế bào nào trong cây có khả năng tiếp nhận sự biến nạp là điều khó khăn. Hạt phấn hay tế bào trứng sau khi được biến nạp có thể được dùng để tạo ra cây biến nạp hoàn toàn thông qua quá trình thụ tinh bình thường. Hạt phấn thường được coi là đối tượng lý tưởng để gây biến nạp. Trong khi đó, việc biến nạp gene vào hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn. Trong trường hợp này, thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi. Việc biến nạp đối với các tế bào đơn của các mô phức tạp như phôi hay mô phân sinh thường cho ra những cây khảm. Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi. Các chồi bất định hay các phôi được hình thành từ các tế bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh. 2. Các phương pháp chuyển gene ở cây trồng Khi sử dụng nấm men, nấm, động vật hoặc thực vật như là vật chủ cho tạo dòng, cần có phương pháp đưa DNA vào trong tế bào của những sinh 180 vật này. Nói chung ở một số loài vi khuẩn tế bào được xử lý bằng dung dịch muối. Ở tế bào nấm men, sự tiếp nhận DNA tăng lên khi tiếp xúc với lithium chloride hoặc lithium acetat. Vì vậy người ta sử dụng phương pháp này thường xuyên khi biến nạp nấm men (Saccharomyce cerevisiae). Đối với phần lớn sinh vật bậc cao hơn đòi hỏi phương pháp tinh vi hơn. 2.1. Biến nạp vào tế bào riêng lẻ Cản trở lớn nhất ở sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế bào. Tế bào động vật không có thành. Trong nuôi cấy, chúng được biến nạp dễ dàng, đặc biệt khi DNA gắn trên bề mặt của tế bào nhờ kết tủa với calcium phosphat (hình 9.1a). Các enzyme được sử dụng làm mất thành tế bào của nấm men, các loại nấm khác, tế bào thực vật, và dưới những điều kiện thích hợp, người ta có thể tạo ra tế bào trần (hình 9.1b). Tế bào trần tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng. Có thể thực hiện chuyển nạp bằng những phương pháp khác nhau: Hình 9.1 Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào 2.1.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes mang các gene ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn có kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây (Hình 9.2). 181 Hình 9.2 Cấu trúc của Ti-plasmid Hình 9.3 Agrobacterium gây khối u ở thực vật A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm (Hình 9.3). Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid là T-DNA xâm nhập vào hệ gene của cây bị bệnh. 2.1.1.1. Ti-plasmid là nhân tố gây biến nạp tự nhiên ở thực vật Tạo khối u Tổng hợp nopaline Sử dụng nopaline Điểm xuất phát sao chép Các chức năng chuyển T-DNA 182 Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D. Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là T- DNA (Transferred DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc (oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự phân chia tế bào liên tục. Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amine hay đường gọi là opine. Hai loại enzyme đã được nghiên cứu kỹ nhất là octopine synthetase và nopaline synthetase. Vùng B có liên quan đến sự tái sinh Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế bào thực vật Ngoài ra mỗi Ti-plasmid còn chứa các gene nằm ngoài vùng T-DNA mã hoá cho các enzyme phân giải ocpine để làm nguồn dinh dưỡng cacbon và nitrogen cho vi khuẩn. 2.1.1.2. T-DNA và các trật tự biên 25 bp Vùng T-DNA có kích thước từ 10 kb đến 20 kb, nằm kẹp giữ hai trật tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border – LB) và biên phải (right border – RB). Toàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biên này đều được chuyển sang tế bào thực vật. LB và RB là những yếu tố cần thiết để định hướng cho sự chuyển DNA. Việc mất đi 6 bp đầu tiên hoặc 10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA. Quá trình chuyển của T-DNA được bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB. Sự định hướng này là rất quan trọng nếu không việc chuyển sẽ kém hiệu quả. Trong các gene được mã hoá ở vùng T-DNA có 3 gene rất quan trọng trong việc phát triển khối u: một gene mã hoá cho việc chuyển enzyme AMP-isopentonyl transferase và 2 gene mã hoá cho enzyme tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane-2 mono oxygenase và acetamid hydrolase). Sự hoạt động của các gene này tạo điều kiện cho sự phát triển của tế bào thực vật có sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin. Đặc điểm này được sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong phần lớn các tế bào không được biến nạp. 2.1.1.3. Vùng vir Chính hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Nó có kích thước khoảng 40 kb và gồm 6 operon: virA, B, D và G là toàn toàn cần thiết cho việc tạo ra độc tính, còn virC và E có liên quan với việc hình thành khối u. Trừ virG và A, các operon khác đều là đa cistron. Nói chung gene virA biểu hiện ở mọi điều kiện, gene virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng thể hiện rất mạnh ở các dịch chiết từ các mô bị tổn thương. Hoạt động của các operon này có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các hợp chất phenol được tiết 183 ra từ vết thương của cây. Từ vết thương của cây thuốc lá người ta đã tinh chiết và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và alpha hydroxyacetosyringon. 2.1.1.4. Quá trình chuyển T-DNA Đoạn T-DNA muốn được chuyển, trước tiên nó cần phải được hoạt hoá nhờ hoạt động của các gene vir. Hoạt động này xảy ra khi Agrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được chiết ra từ vết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hoặc protoplast. Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gene virA (protein virA). Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium, đóng vai trò như là một chất thụ cảm đối với acetosyringon có trong môi trường. Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (có lẽ bằng việc phosphoryl hoá) gene virG. Protein virG sau đó lại gắn vào gene chỉ huy nằm sát gene khởi động thuộc các gene vir khác. Bằng cách như vậy, protein của gene virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình phiên mã của chính nó, đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E. Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, ở vị trí base thứ ba và thứ tư của mạch đơn phía dưới mới được tổng hợp. Từ đó, một mạch T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo hướng 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải. Điều này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA. Operon D chủ yếu mã hoá cho một loại endonuclease tạo ra các vết cắt nói trên tại hai trật tự biên. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gene virC mã hoá. Protein gene vir E2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật. Phức hợp protein-mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T- DNA sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium. Gene virB mã hoá cho ít nhất 11 protein để hình thành nên một cầu nối, cho phức hợp trên chuyển từ Agrobacterium sang tế bào thực vật. Tế bào thực vật bị thương tổn là nơi chuyển gene T-DNA. Trong các mô được sử dung để chuyển gene, lá là nguồn tốt nhất cho tái sinh (Hình 9.4). Những tế bào ở mép lá bắt đầu tái sinh và khi những đĩa lá này được nuôi cấy trên môi trường chứa Agrobacterium, những tế bào này rất hiệu quả cho tác nhân chuyển gene. Kỹ thuật đĩa lá được sử dụng hiệu quả cho chuyển gene vào thực vật nhờ sử dụng Ti-plasmid của Agrobacterium. 2.1.2. Chuyển nạp gene trực tiếp vào protoplast Hầu hết các tế bào thực vật được bao bọc bởi thành cellulose nên khó để hấp thụ các phân tử DNA ngoài vào tế bào. Tuy nhiên thành tế bào có thể làm tan nhờ xử lý tế bào với enzyme cellulase (Hình 9.5). Kết quả thu được các protoplast chỉ còn màng sinh chất rất thuận lợi cho các thao tác 184 thí nghiệm. Protoplast có thể hấp thụ các đại phân tử như DNA và chúng có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua sự tạo thành callus. Hình 9.4 Tái sinh cây từ đĩa lá nhiễm Agrobacterium Mặc dầu protoplast đã được sử dụng thành công cho nhiều loài, tuy nhiên hầu hết các cây nông nghiệp quan trọng như ngũ cốc là rất khó tái sinh từ protoplast. Gần đây đã thu được một vài thành công trong sinh trưởng ở lúa và ngô từ protoplast của nuôi cấy tế bào phát sinh phôi. Phôi thực vật sinh trưởng in vitro là nguồn tế bào quan trọng cho nuôi cấy. Các cây lúa và ngô hữu thụ được tạo thành từ những tế bào được thao tác di truyền thu được từ nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi. 2.1.2. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng xung điện Tế bào được đặt ở trong một thiết bị có hiệu điện thế cao, xung điện 185 tạo các lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) ở trên màng tế bào và DNA có thể xâm nhập vào chất nguyên sinh. Bên cạnh những phương pháp biến nạp, người ta còn sử dụng các phương pháp vật lý để đưa DNA vào trong tế bào. 2.1.3. Chuyển gene bằng phương pháp bắn gene Hinh 9.5 Tái sinh cây từ protoplast 186 Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới. Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu tiên vào năm 1987. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng viên đạn có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào. 1-1,5 μm được dùng làm vi đạn (microprojectile). Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quang vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với nòng súng. Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Ra khỏi đầu nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào. Một tỷ lệ nhất định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gene (Hình 9.6). Hình 9.6 Sơ đồ súng bắn gene 2.1.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm (microinjection) ông ở khá nhiều đối tượng thực vật (Hình 9.7). Tuy nhiên, kỹ thuật này hiện nay ít được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác (micromanipulator) cực nhạy, thiết bị kéo và mài kim tiêm từ các ống thủy tinh (puller) rất đắt tiền. Ngoài ra, nó còn đòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên. Hình 9.7 vào tế bào [...]... pháp phân tích đa hình về chiều dài các đoạn DNA (RFLP) bằng kỹ thuật enzyme giới hạn, là cắt rời DNA hệ gene thành nhiều đoạn ngắn dài khác nhau, từ đó lập nên bản đồ hệ gene, gọi là bản đồ enzyme giới hạn của mỗi cá thể 3.4 Ứng dụng kỹ thuật RFLP trong chọn giống thực vật Trước đây người ta đã sử dụng các dị thể đánh dấu đơn lẽ trong thực vật bậc cao để xem xét các đặc tính hình thái Ví dụ, gene gây... vọng rất lớn trong nghiên cứu da dạng di truyền (genetic diversity), địn 4 Nguyên tắc và cơ sở di truyền của phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị (MAS-marker aided-selection) dựa vào PCR Một chỉ thị di truyền cần có hai yêu cầu cơ bản: thứ nhất là phải có sự khác biệt giữa cơ thể bố và cơ thể mẹ và thứ hai là nó phải được truyền lại chính xác cho thể hệ sau Người ta phân ra các kiểu chỉ thị di truyền sau:... kháng virus, … V Một số kỹ thuật khác và ứng dụng của chúng trong chọn giống thực vật trên thế giới và ở Việt Nam Trong những năm qua, các phương pháp biến nạp gene ở thực vật bậc cao đã có rất nhiều tiến bộ Hiện nay các phòng thí nghiệm công nghệ gene đang bắt tay vào việc cải thiện có ý nghĩa cho một số loại cây trồng nhờ các công cụ của sinh học tế bào và sinh học phân tử Trong một vài trường hợp... hỏi một quy trình và điều kiện môi trường đặc biệt để đánh giá Chọn lọc gián tiếp nhờ marker phân tử sẽ làm cho tiến độ chọn giống tiến hành đúng như kế hoạch, hơn nữa có thể kết hợp nhiều tính trạng chọn lọc cùng một lúc Nhờ đánh dấu được các gene, nhà chọn giống có thể theo dõi tính chất di truyền trong một cặp lai thông qua phân tích RFLP trong quần thể phân ly Ứng dụng RFLP marker để nghiên cứu bệnh... Xa-2, Xa-3, Xa-4, Xa-5, Xa-10 và Xa-21 Gene Xa-1, Xa-5, Xa-21 là những “gene tags” (vật đánh dấu gene) rất hữu dụng trong chọn lọc một chương trình lai tạo có hiệu quả Muốn biết marker có phải là công cụ hữu ích trong chọn lọc giống lúa hay không, người ta nghiên cứu bản chất của sự kết hợp gene trong một nền tảng di truyền nào đó Các marker cung cấp ngay những thông tin về cây lúa nào mang gene gì... lá cây Mặc dù các marker rất có ích trong nhiều nghiên cứu ứng dụng cũng như cơ bản, nhưng nó rất hạn chế trong chọn giống cây trồng Những năm gần đây, có hai loại marker mới đã được phân lập, chúng có nhiều triển vọng trong việc ứng dụng vào công tác chọn giống Đó là protein marker và DNA marker Những marker phân tử này khác với marker hình thái ở 5 đặc điểm di truyền như sau: - Kiểu gene của các... dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR Cho đến nay có rất nhiều chỉ thị phân tử được phát triển dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như: AFLP (Amplified fragment length polymorphism), RAPD (Random amplified polymorphism DNA), SSR (Simple sequence repeats), STS (sequence tagged site) … Chọn lọc nhờ chỉ thị dựa vào PCR Tính biến dị di truyền giữa các giống trong một loài cây có thể được... triển vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hoá của kỹ thuật bắn gene Thực tế, đậu tương đã được dùng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền Kết quả đầu tiên ở đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gene nhờ Agrobacterium Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium Các... các bản sao cùng tách rời, như thế mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện di n một kết quả biến nạp độc lập và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên : Phaseolus thành công rất ít Hai hướng được ứng dụng trong công nghệ di truyền ở đậu tây là kỹ thuật xâm nhiễm bằng Agrobacterium và bắn gene Tuy nhiên, chỉ có kỹ thuật sau mới có khả năng phục hồi các cây biến nạp Cây đậu tây biến... legoglobin Đó là mộ ) đang tìm cách giải quyết III Kỹ thuật RFLP 1 Đại cương về kỹ thuật RFLP Kỹ thuật này dựa trên cơ sở đặc hiệu trong việc cắt đoạn DNA của một loại hình enzyme đặc hiệu gọi là enzyme giới hạn Khi sử dụng một hay nhiều enzyme giới hạn, chúng sẽ tìm đúng vị trí đặc hiệu để cắt và cho những đoạn DNA dài ngắn khác nhau Bất kỳ có sự biến đổi nào trong hệ gene (sự đảo gene, đột biến điểm, tăng . 177 Chương 9 Kỹ thuật Di truyền trong Chọn giống Thực vật I. Mở đầu bào thực vật là biến nạp và biểu hiện các gene ngoại lai trong tế bào thực vật. Biến nạp. cá thể. 3.4. Ứng dụng kỹ thuật RFLP trong chọn giống thực vật Trước đây người ta đã sử dụng các dị thể đánh dấu đơn lẽ trong thực vật bậc cao để xem xét