Hệ thống giới-hạn sửa đổi R-M II tồn tại ở thế giới vi khuẩn gồm có hai chức năng quan trọng là cắt giới hạn và methyltransferase. Enzym giới hạn II đã có vai trò thiết yếu cho sự thúc đẩy của sinh học phân tử. Tiếp theo là các methyltransferase đã trở thành enzym mà các nhà khoa học quan tâm đến, vì có thể có vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa gen.
2017 JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE HỆ THỐNG GIỚI HẠN - SỬA ĐỔI R-M IIG HỖ TRỢ CHO VIỆC TẠO RA CÁC PROTEIN CĨ TÍNH ĐẶC HIỆU MỚI Lê Thị Kim Tuyến1 TÓM TẮT Hệ thống giới-hạn sửa đổi R-M II tồn giới vi khuẩn gồm có hai chức quan trọng cắt giới hạn methyltransferase Enzym giới hạn II có vai trị thiết yếu cho thúc đẩy sinh học phân tử Tiếp theo methyltransferase trở thành enzym mà nhà khoa học quan tâm đến, có vai trị quan trọng q trình điều hịa gen Sau ADN tổng hợp, thay đổi ngoại di truyền (epigenetic) tạo tín hiểu mở đóng gen, methyl hóa acid nucleic thơng qua tồn genom phổ biến Tiếp tục sàng lọc phân tích hệ thống R-MII vi khuẩn cần thiết để phục vụ nghiên cứu điều hòa gen Sự khám phá hệ thống R-M IIG mang hai chức cắt giới hạn methyl hóa protein cho phép cải tiến sàng lọc enzym GenBank Việc xác định tính đặc hiệu họ enzym R-M IIG tái tổ hợp cho phép tìm số quy luật tương tác acid amin nucleotid nhận biết Trên sở đó, protein có tính đặc hiệu tạo thành cơng Từ khóa: Hệ thống R-M II; enzym giới hạn; methyltransferase; xác định tính đặc hiệu; nghiên cứu in silico SUMMARY: RESTRICTION-MODIFICATION SYSTEM IIG ALLOWS ENGINEERING OF NEW PROTEIN SPECIFICITIES Restriction-Modification RM II systems, specific of the bacterial kingdom, have two important enzymatic functions which are restriction endonuclease and methyltransferase Restriction enzymes had already an essential role in the developement of the molecular biology Now scientists are interested in methyltransferases for their role in the gene regulation process After the DNA synthesis, among the epigenetic modifications that could lead to turn the genes on and off, the methylation throughout the genom is usual Thus, screening of R-M II systems in bacteria is still necessary to provide more tools for the DNA research The new discovery of the R-M II G systems bearing the two endonuclease and methyltransferase on one unique protein has allowed the possibility to be screened in Genbank From the specificity determination of recombined R-M IIG enzymes belonging to the same family, some rules could have been deduced to know the interactions between the amino acids and the nucleotides recognized On that basis, proteins with new specificities has been successfully engineered Key words: R-M II system; restriction enzyme; methyltransferase; specificity determination; in silico research I ĐẶT VẤN ĐỀ Từ khám phá enzym giới hạn II vào năm 1968, chức cắt ADN vị trí đặc hiệu cho phép phân tích ADN genom, đại phân tử gồm vài triệu nucleotid loài vi khuẩn vài tỷ nucleotid tế bào cao cấp Các enzym giới hạn trở thành cơng cụ có ích thúc đẩy phát triển ngành sinh học phân tử [1], [2] Có ba phương pháp bật thiết lập nhờ có enzym này: 1) Bản đồ giới hạn ADN tạo dấu vết ADN đặc hiệu dấu vân tay, không cho phép phân biệt loài sinh vật với mà cịn phân biệt thể loài; 2) Phương pháp sản xuất protein tái tổ hợp dùng chức cắt đặc hiệu ADN để gắn gen vào vector nhằm biến nạp vào vi trùng dễ mọc Escherischia coli dùng nhà máy sản xuất protein 3) ADN genom cắt giới hạn tạo đoạn ADN đủ nhỏ để giải trình tự, ghép lại với đưa trình tự toản ADN genom khổng lồ Trước đây, enzyme giới hạn coi cơng cụ dùng nghiên cứu Nhưng tồn hình thức hệ thống giới hạn - sửa đổi với methyltransferase tính đặc hiệu Hiện nay, methyltransferase cịn quan tâm nhiều tham gia vào biến đổi Trường đại học Thăng Long, Hà Nội - Email: ltkimtuyen@thanglong.edu.vn Ngày nhận bài: 05/02/2017 Ngày phản biện: 18/02/2017 Ngày duyệt đăng: 25/02/2017 SỐ 37 - Tháng 3+4/2017 Website: yhoccongdong.vn 135 VIỆN S EC KHỎ ỘNG G ỒN Đ ỨC NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ngoại di truyền (epigenetic), sở việc tìm hệ thống R-M II có tính đặc hiệu cần phải Việc khám phá protein R-M IIG làm thay đổi cách sàng lọc protein có tính đặc hiệu với hiệu cao, chí cho phép hiểu quy luật tương tác acid amin nucleotide nhận biết Quy luật suy lần họ protein giống MmeI cho phép tạo enzyme có tính đặc hiệu đột biến gen tương tự chỗ qui định Nghiên cứu sàng lọc enzyme giới hạn theo phương pháp cổ điển đến khả tạo enzyme phương pháp đột biến gen trình bày giai đoạn sau II NỘI DUNG 2.1 Quá trình sang lọc enzyme giới hạn II nhiều đặc hiệu khác New England Biolabs công ty vừa sản xuất enzym giới hạn II vừa sàng lọc enzim có tính đặc hiệu Từ 1968 đến 2005, số phịng thí nghiệm nhiều nước, có Việt Nam [3], [4] tham gia sàng lọc enzym giới hạn từ vi khuẩn thiên nhiên Phương pháp dùng phổ biến gồm có giai đoạn mọc vi khuẩn chủng, thử phản ứng dịch thô tế bào phá vỡ với ADN chuẩn Sự có mặt enzym giới hạn hoạt tính khẳng định thấy băng ADN cắt giới hạn Phương pháp không hiệu phương pháp sinh học phân tử, dùng ADN dị để tìm gen Nhưng gen enzym tìm thời gian có độ giống trình tự, khó nhận trực tiếp genom Tuy nhiên enzym giới hạn II thuộc hệ thống sửa đổi-giới hạn II (R-M II) gồm enzym giới hạn methyltransferase thường mã hai gen nằm sát gần genom Chính gen methyltransferase có đặc điểm trình tự cho phép phân biệt gen genom [5] Do đó, phát gen enzym giới hạn cách gián tiếp, dò gen methyltransferase trước, biết gen enzym giới hạn nằm sát bên cạnh, bên phải bên trái New Englands Biolabs sản xuất 250 enzym giới hạn có tính đặc hiệu khác phân phối khắp giới [6] Danh sách chủ yếu gồm enzym nhận trình tự nucleotid xi ngược có số lượng enzym nhiều, khơng cần thiết bổ sung vào enzym khác nhằm mục đích có thêm cơng cụ cho phương pháp sinh học phân tử Tuy nhiên, việc tiếp cận với enzym giới hạn khơng chấm dứt phận không tách rời hệ thống R-M Hiện nay, nghiên cứu thời thiên điều hòa gen, hiểu chế khiến protein sản xuất mức độ cần thiết thời điểm để bảo đảm sống tế bào Cụ thể hơn, rối loạn trình 136 SỐ 37- Tháng 3+4/2017 Website: yhoccongdong.vn điều hòa giải thích ngun nhân số bệnh ung thư Các loại điều hịa dẫn đến đóng mở gen cần phải có tín hiệu đặc biệt Trình tự nucleotid tồn ADN genom cho phép xác định vị trí tính chất gen tế bào, nhiên, sau ADN tổng hợp, có thay đổi ngoại di truyền (epigenetic) xẩy giả thuyết tham gia vào điều hòa gen Trong tượng ngoại di truyền, methyl hóa nucleotid phổ biến, methyltransferase chiếm vai trị quan trọng Vì lý này, việc sàng lọc phân tích hệ thống R-M vi khuẩn tiếp tục có lợi ích nhằm tạo khả tìm cơng cụ phục vụ việc nghiên cứu ADN Sự phát họ protein R-M IIG có trình tự giống nhận trình tự nucleotid khác thay đổi cách sàng lọc hệ thống giới hạn-sửa đổi nhanh hiệu 2.2 Các protein R-M IIG mang hai chức sửa đổi giới hạn Gần đây, họ enzym giới hạn khám phá, với đặc điểm khác so với enzym giới hạn cổ điển Đại diện họ enzym tìm MmeI thuộc vi khuẩn Methylophilus methylotrophus MmeI mô tả protein mang hai chức giới hạn methyl hóa ADN, nhận biết trình tự khơng đối xứng 5'-TCCRAC-3' cắt 20/18 N ngồi trình tự nhận biết Nó có đặc tính endonuclease methyltransferase tạo N6-methyl adenine, nhận xét thông qua trình tự protein khu vực chức năng: - Ở phần đầu có đoạn cố định P(D) (D/E)XK đánh dấu vị trí hoạt động phân huỷ liên kết phosphodiester acid nucleic, đặc điểm thuộc endonuclease phụ thuộc vào kim loại Cụ thể VD70 (9X)E80MK82; - Ở có đoạn cố định đặc hiệu methyltransferase tạo N6-methyl adenine, gồm có motif I, G312AHYTS, motif X, F359FDPACGCGNFL motif IV, G480NPPF - Ở cuối, có vùng TRD (Target Recognition Domain) nhận trình tự nucleotid đích, trường hợp MmeI 5'-TCCRAC-3' Hệ thống R-M có protein mang hai chức lúc (được phân loại R-M II G) đơn giản hóa q trình tự bảo vệ vi khuẩn chống xâm nhập ADN lạ Với hệ thống R-M II cổ điển, chức cắt sửa đổi mang protein khác nhau, tức protein có vùng TRD riêng Như vậy, xảy đột biến, làm thay đổi trình tự nhận biết đặc hiệu endonuclease, khả có thay đổi xảy với methyltransferase gần không Điều dẫn đến chết tế bào chủ ADN bị 2017 JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE cắt trình tự nucleotid nhận biết khơng methyl hóa Trong đó, MmeI có vùng chung TRD nhận ADN trình tự nucleotid đặc hiệu Khi đột biến xảy vùng TRD làm thay đổi trình tự nhận biết, lúc chức giới hạn sửa đổi dựa vào vùng TRD chung tiếp tục phối hợp với để đảm bảo ADN genom tế bào chủ bảo vệ ADN lạ không bảo vệ bị phân hủy 2.3 Nghiên cứu tương tác acid amin nucleotide họ MmeI Ở giới vi khuẩn, đột biến xảy với tỷ lệ cao đặt giả thuyết thiên nhiên, gen tương tự với MmeI có đột biến khác vùng TRD dẫn đến trình tự nucleotid khác nhận biết Sự khám phá họ enzym giống MmeI chứng minh phần giả thuyết Dựa phần mềm so sánh trình tự acid amin MmeI để khai thác trình tự công bố GenBank, kết liệt kê nhiều enzym giả định giống MmeI, có độ giống cao, thuộc nhiều vi khuẩn khác Các tác giả [7] xin ADN genom danh sách này, để phân tích gen giả định mã cho enzym thuộc họ MmeI Gen nhân lên PCR sản phẩm ADN khuếch đại clon vào Escherischia coli Khi tế bào tái tổ hợp biểu enzyme giới hạn, tính đặc hiệu xác định cho thấy có nhiều trình tự nhận (Bảng 1) Như vậy, protein phân tích có vùng TRD nhận trình tự nucleotid riêng biệt Khi đối chiếu trình tự acid amin vùng TRD với trình tự nucleotid nhận ra, có kết bật Số thứ tự nucleotid trình tự nhận biết nucleotid ghi sau: nucleotid cuối số nucleotid Trong họ MmeI, protein nhận biết nucleotid thứ A Những quy luật đơn giản suy với nucleotid 6, C G (Hình 1) Một đơi acid amin quan sát có tương quan cao với nucleotid số Ở vị trí tương tự MmeI R808, nucleotid C nhận arginine (R) nucleotid G nhận aspartate (D) Ở vị trí tương tự MmeI E806 acid amin thứ glutamate (E) có vai trị nhận nucleotid C với tỷ lệ 9/10 protein; acid amin thứ có vai trị nhận nucleotid G lysine (K) với tỷ lệ Bảng : Danh sách enzym hạn chế họ MmeI xác định tính đặc hiệu Tuy phức tạp hơn, quy luật suy với nucleotid số thấy Hình Ở nhận xét có đơi acid amin tương quan với nhận nucleotid số này, G (10 enzym), C (7 enzym), T (3 enzym) Y nhận pyrimidine C T (1 enzym) Những enzym nhận G có acid amin có điện tích dương (K R), vị trí tương tự MmeI E751, nucleotid C nhận acid amin D có điện tích âm (5/7) serine (R) Cái acid amin thứ vị SỐ 37 - Tháng 3+4/2017 Website: yhoccongdong.vn 137 VIỆN S EC KHỎ ỘNG G ỒN Đ ỨC NGHIÊN CỨU KHOA HỌC trí tương tự Mme I N773 tham gia vào nhận biết nucleotid G acid amin D (7/10) S Đối với enzym nhận C, có asparagine (N), serine (S) histidine (H) Hình 1: Đoạn trình tự acid amin vùng TRD đối chiếu với nucleotid số trình tự nhận biết ADN Hình 2: Đoạn trình tự acid amin vùng TRD đối chiếu với nucleotid số trình tự nhận biết ADN 138 SỐ 37- Tháng 3+4/2017 Website: yhoccongdong.vn 2017 JOURNAL OF COMMUNITY MEDICINE Đối với nucleotid số (Hình 3), có enzym nhận nucleotid A, enzym nhận nucleotid C, enzym nhận nucleotid G, enzym nhận R (nucleotid A G) enzym nhận N (bất nucleotid nào) Trong trường hợp thấy có tham gia đôi acid amin Các purine (A, G hai R) nhận acid amin R vị trí tương tự với MmeI R810 Acid amin thứ vị trí tương tự MmeI A774 nhận nucleotid G, leucine (L), Methionine (M), acid glutamic (E) Threonine (T) Hình 3: Đoạn trình tự acid amin vùng TRD đối chiếu với nucleotid số trình tự nhận biết ADN 2.4 Tương tác quan hệ acid amin nucleotid họ MmeI dùng để tạo enzym R-M IIG có tính đặc hiệu Từ tương tác đưa trên, nhận biết enzym MmeI (TCCRAG) NmeAIII (GCCGAC) họ thử nghiệm cách tạo đột biến gen tương tự [8] Các thay đổi acid amin enzym thực để nghiên cứu nhận biết nucleotid số 6, số số Kết cắt ADN chuẩn enzym thay đổi thấy Hình Để thay đổi nhận biết nucleotid số từ MmeI để có nucleotid G thành nucleotid C, đột biến đôi thực để E thành K vị trí MmeI 806 (ghi tóm tắt MmeI E806K) để R thành D vị trí MmeI 808 (MmeI R808D) Một thử nghiệm thực với NmeIII để thay nhận biết nucleotid số để có nucleotid C thành nucleotid G tạo đột biến đôi NmeAIII K816E NmeAIII D818R Hai kết với MmeI (6G) NmeAIII (6C) cho thấy băng giới hạn ADN chuẩn lambda cắt với enzym thay đổi giống băng lý thuyết cắt đứng vị trí TCCRAG GCCGAG Khi thay đổi nucleotid đột biến đôi MmeI A774L, kết enzym tạo có đặc hiệu chờ đợi TCCGAC, với đoạn giới hạn hình vạch MmeI gốc mà nhận TCCRAG tức TCCAAG TCCGAC Khi tạo đột biến đơi MmeI A774K, R810S, enzym có đặc hiệu TCCCAC Những thay đổi phối hợp thực với MmeI hai vị trí nucleotid số số lúc tạo ba đột biến A774L, E806K R808D Kết dẫn đến enzym với đặc hiệu chờ đợi TCCGAG Những thay đổi phối hợp thực với NmeAIII vị trí nucleotid số 3, lúc tạo đột biến S761R, N783D, L784A, K816E D818R Trường hợp cuối dẫn đến có enzym có tính đặc hiệu TCGRAC SỐ 37 - Tháng 3+4/2017 Website: yhoccongdong.vn 139 VIỆN S EC KHỎ ỘNG G ỒN Đ ỨC NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Hình 5: Băng cắt ADN chuẩn lambda với MmeI NmeIII nguyên vẹn hay thay đổi A: Kết gel agarose B kết lý thuyết III KẾT LUẬN Phương pháp cho thấy khả để khai thác số liệu khổng lồ phong phú trình tự genom ADN cơng bố GenBank Các gen chọn in silico đoạn nucleotid phân tích có dấu hiệu mã cho protein mặt lý thuyết Như thế, danh sách enzym thuộc họ MmeI mà xuất hình máy tính coi protein “giả thuyết” “methyltransferase giả định” Những ADN genom chủng vi khuẩn định cơng bố trình dùng để clon gen chọn lọc Chỉ có protein biểu hoạt tính khẳng định tính chất thực gen [9] Hiệu cao phương pháp có sản phẩm tái tổ hợp hoạt tính Mặt khác, việc khám phá họ enzym giống MmeI cho phép sàng lọc thêm methyltransferase Tính đặc hiệu chúng xác định thơng qua phản ứng giới hạn phân tích in vitro Quá trình nghiên cứu dẫn đến hiểu biết vài qui tắc tương tác acid amin nucleotid cuả riêng họ MmeI Trên sở đó, enzym khác có tính đặc hiệu tạo thành công TÀI LIỆU THAM KHẢO: Loenen W.A.M., Dryden D.T.F., Raleigh E.A cộng (2014) Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes Nucleic Acids Res, 42(1), 3–19 Roberts R.J (2005) How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology Proc Natl Acad Sci U S A, 102(17), 5905–5908 Lê Thị Kim Tuyến Vũ Hồng Nga (1997) Phát xác định enzym giới hạn BciV I, tách từ Bacillus circulans Tạp chí học Dự phịng, VII(4(34) Lê Thị Kim Tuyến Vũ Thị Kim Liên (1997) Sml I, enzym giới hạn tách chiết từ chủng Stenotrophomonas maltophilia Tạp chí học Dự phịng, VII(4 (34), 11–16 Wilson G.G (1991) Organization of restriction-modification systems Nucleic Acids Res, 19(10), 2539–2566 Pingoud A, Wilson G.G, Wende W (2014) Type II restriction endonucleasesa historical perspective and more Nucleic Acids Res, 42(12), 7489–7527 Morgan R.D, Dwinell E.A, Bhatia T.K cộng (2009) The MmeI family: type II restriction–modification enzymes that employ single-strand modification for host protection Nucleic Acids Res, 37(15), 5208–5221 Morgan R.D Luyten Y.A (2009) Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity Nucleic Acids Res, 37(15), 5222–5233 Tuyến L.T.K, Hòa B.K, Thành V.N cộng (2015) Biểu xác định enzyme giới hạn họ Mme tìm in silico Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(3), 831–836 140 SỐ 37- Tháng 3+4/2017 Website: yhoccongdong.vn ... truyền (epigenetic), sở việc tìm hệ thống R-M II có tính đặc hiệu cần phải Việc khám phá protein R-M IIG làm thay đổi cách sàng lọc protein có tính đặc hiệu với hiệu cao, chí cho phép hiểu quy luật... IIG có trình tự giống nhận trình tự nucleotid khác thay đổi cách sàng lọc hệ thống giới hạn- sửa đổi nhanh hiệu 2.2 Các protein R-M IIG mang hai chức sửa đổi giới hạn Gần đây, họ enzym giới hạn. .. giới hạn II thuộc hệ thống sửa đổi -giới hạn II (R-M II) gồm enzym giới hạn methyltransferase thường mã hai gen nằm sát gần genom Chính gen methyltransferase có đặc điểm trình tự cho phép phân biệt