Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng hợp chất octacalcium phoshate/collagen khi mang protein tạo hình xương người tái tổ hợp typ 2 liều thấp trong tái tạo xương

Bài viết Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng hợp chất octacalcium phoshate/collagen khi mang protein tạo hình xương người tái tổ hợp typ 2 liều thấp trong tái tạo xương trình bày đánh giá việc sử dụng octacalcium phoshate/collagen (OCP/Col) như một chất mang để giảm nồng độ protein tạo hình xương người tái tổ hợp typ 2 (rhBMP-2) mà vẫn đạt hiệu quả.

JOURNAL OF 108 - CLINICAL MEDICINE AND PHARMACY Vol.17 - No1/2022 DOI: … Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng hợp chất octacalcium phoshate/collagen mang protein tạo hình xương người tái tổ hợp typ liều thấp tái tạo xương Research on the application of octacalcium phosphate/collagen composite to carry low-dose recombinant human bone morphogenetic protein-2 in bone regeneration Nguyễn Điện Biên Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 Tóm tắt Mục tiêu: Đánh giá việc sử dụng octacalcium phoshate/collagen (OCP/Col) chất mang để giảm nồng độ protein tạo hình xương người tái tổ hợp typ (rhBMP-2) mà đạt hiệu Đối tượng phương pháp: Nghiên cứu thực nghiệm mơ tả cắt ngang có đối chứng so sánh Đĩa xốp Atelocollagen-ACS OCP/Col ngâm tẩm với nồng độ rhBMP-2 khác cấy ghép vào 60 chuột có tổn thương khuyết hổng xương sọ Mô cấy ghép lấy sau 4, tuần Kết quả: Có hình thành mơ cứng đồng tổn thương nhóm OCP/Col tất nồng độ rhBMP2 Nhóm ACS có 0,25μg rhBMP-2 khơng tạo xương Mật độ khống xương tất nhóm khơng phụ thuộc vào nồng độ rhBMP-2 Sự hình thành xương tiến triển phụ thuộc vào nồng độ rhBMP-2 nhóm Vùng xương nhóm OCP/Col nhiều đáng kể so với nhóm ACS Kết luận: OCP/Col chất mang rhBMP-2, giảm đến 1/4 liều hiệu rhBMP-2, tránh biến chứng rhBMP-2 liều cao gây Từ khóa: rhBMP-2, tái tạo xương, collagen, octacalcium phosphate, protein tạo hình xương người typ Summary Objective: To evaluate the effective use of octacalcium phoshate/collagen (OCP/Col) as a carrier to reduce the concentration of recombinant human bone morphogenetic protein (rhBMP-2) but still be effective Subject and method: A cross-sectional descriptive experimental study with comparative control Atelocollagen-ACS or OCP/Col sponge discs were impregnated with different concentrations of rhBMP-2 and implanted in 60 mice with calvarial bone defects The transplanted tissue was obtained after 4, weeks Result: There was perform hard tissue formation in the defects of the OCP/Col groups at all concentrations of rhBMP-2 The ACS group had 0.25μg of rhBMP-2 showed almost no bone formation Bone mineral density in all groups was independent of rhBMP-2 concentration Progressive bone formation was dependent on rhBMP-2 concentration in both groups The new bone area was significantly more in the OCP/Col groups than in the ACS groups Conclusion: OCP/Col can be a carrier of  Ngày nhận bài: 5/10/2021, ngày chấp nhận đăng: 28/12/2021 Người phản hồi: Nguyễn Điện Biên, Email: dentistbien@gmail.com - Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 174 JOURNAL OF 108 - CLINICAL MEDICINE AND PHARMACY Vol.17 - No1/2022 DOI: … rhBMP-2, reducing the effective dose of rhBMP-2 by up to 1/4, avoiding complications caused by rhBMP2 at high doses Keywords: rhBMP-2, bone regeneration, collagen, octacalcium phosphate, recombinant human bone morphogenetic protein Đặt vấn đề Tái tạo xương thách thức phẫu thuật hàm mặt có nhiều trường hợp cần tái tạo xương vùng Mất tiêu xương hàm gây nhiều hậu nghiêm trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến khả ăn nhai, thẩm mỹ Vật liệu ghép xương kỹ thuật ghép xương vùng có nhiều khác biệt so với ghép xương vùng khác thể môi trường miệng, hoạt động quanh miệng, hàm kết thẩm mỹ biểu phần lớn sau ghép… Trong thực hành lâm sàng, ghép xương tự thân tiêu chuẩn vàng để tái tạo xương tính tạo xương tiêu xương vượt trội Tuy nhiên, kỹ thuật có số nhược điểm tính sẵn có hạn chế tỷ lệ mắc bệnh vị trí hiến Hydroxyapatite (HA) β-tricalcium phosphate (β-TCP) áp dụng rộng rãi thực hành lâm sàng; nhiên, vật liệu không thay ghép xương tự thân dù chúng có tính tương thích sinh học vượt trội khả tạo xương bề mặt (osteoconductivity) Lí chúng khơng có khả quy nạp xương (osteoinductivity) [8] Protein tạo hình xương người tái tổ hợp typ (rhBMP-2), protein quy nạp xương quan trọng Trong phẫu thuật hàm mặt, phê duyệt để sử dụng lâm sàng phục hồi huyệt sau nhổ nâng xoang hàm Mỹ rhBMP-2 cho thấy khả tái tạo xương ưu việt, nhiên, số tác dụng phụ báo cáo phù nề cục hay khả gây ung thư sử dụng liều cao [3] rhBMP-2 lưu trú vị trí tổn thương xương chất mang giải phóng để tạo xương Sự kích thích tăng trưởng rhBMP-2 có hiệu khu trú trì vài tuần 175 Xốp atelocollagen (ACS) sử dụng làm chất mang rhBMP-2 Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép Tuy nhiên, có nhiều báo chứng minh ACS giải phóng rhBMP-2 [2] Do đó, cần phải tìm chất mang có khả trì giải phóng rhBMP-2 cách tự động có tính năng, hoạt động chất thay xương Octacalcium phosphate (OCP) tiền chất trực tiếp apatit sinh học, chuyển đổi bền vững thành apatit sinh học đảo ngược điều kiện sinh lý Hơn nữa, OCP chứng minh tăng cường biệt hóa tế bào tạo xương có hiệu việc tái tạo xương khả tái tạo xương cao [9] hay khả hấp thụ nhanh so với HA β-TCP [4] Để cải thiện đặc tính vật lý nó, hỗn hợp bao gồm OCP collagen (OCP/Col) phát triển OCP/Col chứng minh mang lại khả tái tạo xương tăng cường đáng kể so với β-TCP HA collagen BMP2 biết hấp thụ canxi photphat collagen [7] Do đó, chúng tơi đề xuất OCP/Col chất mang ưu việt cho rhBMP-2 để giảm thiểu liều rhBMP-2 hiệu Mục tiêu nghiên cứu để đánh giá tiềm tạo xương rhBMP-2 liều thấp mang OCP/Col so với mang ACS Đối tượng phương pháp 2.1 Chuẩn bị OCP, OCP/Col, atelocollagen OCP tổng hợp cách kết tủa trực tiếp sàng để thu hạt có kích thước 300–500μm Dung dịch collagen chuẩn bị công ty NMP collagen PS (Nhật Bản) Các hạt OCP sàng trộn vào dung dịch collagen Tỷ trọng OCP OCP/Col điều chỉnh thành 77% trọng lượng Hỗn hợp đơng khơ, xử lý khử nhiệt TẠP CHÍ Y DƯỢC LÂM SÀNG 108 Tập 17 - Số 1/2022 nhiệt khử trùng cách sử dụng chiếu xạ tia gamma sản phẩm cuối đĩa có đường kính 5mm rhBMP-2 hịa tan nước cất nồng độ 0,00, 0,01 0,04μg/μl Sau đó, 25μl dung dịch rhBMP-2 nhỏ vào đĩa OCP/Col ACS (nhóm đối chứng) Các vật liệu kí hiệu 0,00 OCP/Col, 0,25 OCP/Col, 1,00 OCP/Col, 0,00 ACS, 0,25 ACS, 1,00 ACS 2.2 Động vật quy trình cấy ghép 60 chuột đực 10 tuần tuổi sử dụng Cấy ghép tiến hành gây mê toàn thân Sau khử trùng vùng mổ, rạch da hình vịng cung từ vùng tiền não thất trái sang phải qua vùng trán Màng xương vùng vòm sọ bị gạt sang bên Sử dụng mũi khoan có đường kính 5mm tay khoan điện để tạo tổn thương khuyết hổng xương vịm sọ có độ dày hết xương, đường kính 5mm tưới nước muối sinh lý liên tục Vật liệu cấy ghép sau cấy vào phần khuyết xương vòm sọ Năm chuột cấy ghép cho nhóm Sau cấy ghép vật liệu, màng xương da đặt khâu lại Ở nghiên cứu này, mô cấy ghép thu thập thời điểm bốn sáu tuần sau phẫu thuật Tồn thí nghiệm thực Trung tâm Thí nghiệm Động vật Đại học Nagasaki tuân theo quy trình Ủy ban Chăm sóc Sử dụng Động vật địa phương Đại học Nagasaki phê duyệt 2.3 Phân tích hình thái phân tích định lượng xương chụp Micro-CT Phân tích hình ảnh để định lượng hình thái xương hình thành thực máy chụp Micro-CT điều kiện tiêu chuẩn (90kV, 150mA, hai phút) Trong phân tích ba chiều phần mềm phân tích cấu trúc (TRI/3D-BON), vùng xương hình thành sau lấy mẫu phân tích mật độ khống xương (Bone Mineral Density-BMD), với mật độ thiết lập từ 300mg/cm 1.500mg/cm3 phạm vi chiết xuất xương xác định khoảng từ 300mg/cm3 đến 1.100mg/cm3 2.4 Chuẩn bị mô kiểm tra mô học DOI:… Sau chụp Micro-CT, mẫu ngâm PBS qua đêm cố định 4% paraformaldehyde 24 Các mẫu sau khử trùng EDTA 10 ngày rửa nước cất Tiếp đến, mẫu vật cắt thành hai mảnh từ trung tâm tổn thương nhúng vào parafin tạo thành khối Các lát cắt mẫu vật dày 5μm cắt từ khối parafin nhuộm hematoxylin eosin Hình ảnh chụp kính hiển vi quang học (Axiocam ERc 5s, ZEISS) 2.5 Đo định lượng vùng xương vỏ xương tuỷ Định lượng vùng xương vỏ xương tuỷ mô cấy ghép đo mặt cắt mô học gần trung tâm tổn thương Dữ liệu xương vỏ xương tuỷ trích xuất Adobe Photoshop® CS6 Extended Sau chuyển đổi sang ảnh JPEG, thể tích liệu (Kilobyte) xương vỏ xương tuỷ đo trình xem ảnh Windows 10 2.6 Phân tích thống kê Phân tích thống kê tất liệu Micro-CT thực JMP® phiên 13 (Viện SAS, Cary, NC, Hoa Kỳ) Sự thay đổi theo thời gian giá trị BMD nhóm OCP/Col phân tích kiểm tra so sánh nhiều đối tượng không tham số Giá trị biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) Giá trị p nhỏ 0,05 có ý nghĩa thống kê Tồn q trình nghiên cứu thực Khoa Vật liệu tái sinh phẫu thuật hàm mặt, Đại học Y Nagasaki giám sát giáo sư-chủ nhiệm khoa Kết 3.1 Phân tích hình thái Micro-CT Phân tích hính thái cho thấy nhóm 0,00 0,25 ACS khơng hình thành mơ cứng, nhóm 1,00 ACS có cho thấy hình thành mơ cứng mức độ định Ngược lại, hình thành mô cứng ghi nhận tổn thương nhóm OCP/Col tất nồng độ rhBMP-2 Đồng thời 176 JOURNAL OF 108 - CLINICAL MEDICINE AND PHARMACY Vol.17 - No1/2022 DOI: … nhóm này, vùng sáng cản sóng có phụ thuộc nồng độ rhBMP-2 (Hình 1) Hình Sự hình thành mơ cứng nhóm ACS OCP/Col 3.2 Phân tích hình thái thể tích xương phân tích hình ảnh Micro-CT Nhóm OCP/Col tạo lượng thể tích xương nhiều nhóm ACS Cụ thể, 0,25 OCP/Col 1,00 OCP/Col cho thấy thể tích xương hình thành tăng đáng kể so với 1,00 ACS - nhóm tích xương cao nhóm ACS, tuần Ở thời điểm tuần, nhóm 1,00 OCP/Col cho thấy gia tăng đáng kể thể tích xương so với 1,00 ACS (Hình 2) Hình Thể tích xương nhóm ACS OCP/Col 3.3 Mật độ khống xương BMD có xu hướng tăng từ đến tuần sau cấy ghép tất nhóm Khơng có khác biệt đáng kể BMD nhóm ACS OCP/Col Ví dụ: BMD nhóm 1,00 OCP/Col nhóm tạo khối lượng xương cao không khác biệt đáng kể so với nhóm 0,00 ACS bốn sáu tuần (Hình 3) 177 TẠP CHÍ Y DƯỢC LÂM SÀNG 108 Tập 17 - Số 1/2022 DOI:… Hình Mật độ khống xương nhóm ACS OCP/Col 3.4 Đánh giá mơ học Nhóm 0,00 0,25 ACS cho thấy khơng có hình thành xương tổn thương, nhóm 1,00 ACS cho thấy lượng định xương hình thành sau bốn tuần Mặt khác, nhóm OCP/Col, diện tích xương tăng dần nồng độ rhBMP-2 tăng lên (Hình 4) Nhóm 0,00 0,25 ACS cho thấy hình thành xương nhẹ vị trí tổn thương cịn nhóm 1,00 ACS cho thấy có kết nối rìa xương quanh tổn thương với xương sau sáu tuần Ngược lại, nhóm OCP/Col cho thấy hình thành xương rõ rệt so với nhóm ACS (Hình 5) Hầu tất nhóm cấy ghép ACS bị hấp thụ vật liệu cấy ghép, nhóm OCP/Col cịn trì, đặc biệt nồng độ rhBMP-2 thấp Ngồi ra, xương hình thành nhóm OCP/Col dày nhóm ACS Ta thấy nhóm OCP/Col với rhBMP-2 có hình thành xương trưởng thành nhiều với tủy xương Hình Hiệu ACS OCP/Col có khơng có rhBMP-2 đến hình thành xương tổn thương tuần sau phẫu thuật 178 JOURNAL OF 108 - CLINICAL MEDICINE AND PHARMACY Vol.17 - No1/2022 DOI: …   Hình Hiệu ACS OCP/Col có khơng có rhBMP-2 đến hình thành xương tổn thương tuần sau phẫu thuật 3.5 Đo định lượng vùng xương vỏ xương tuỷ Diện tích vùng xương vỏ vùng tủy xương hình thành đo mẫu mơ học cho thấy xu hướng tương tự, thể tích xương đo micro-CT tăng lên theo tăng nồng độ rhBMP-2 nhóm ACS OCP/Col Diện tích xương nhóm OCP/Col cao diện tích nhóm ACS nồng độ tương ứng rhBMP-2 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê quan sát mức thấp (0,00, 0,25) cao (1,00) nồng độ rhBMP-2 nhóm ACS OCP/Col (Hình 6) 0,25 OCP/Col, nồng độ thấp rhBMP-2, cho thấy vùng xương tương tự với 1,00 ACS sau tuần Hình Ảnh hưởng ACS OCP/Col có khơng có rhBMP-2 vùng xương vỏ tủy xương tuần sau phẫu thuật Bàn luận Khi sử dụng BMP nói chung lâm sàng, việc lựa chọn chất mang thích hợp vơ quan trọng nhiều nguyên nhân rhBMP-2 khuếch tán thời gian ngắn sử dụng chỗ khơng có chất mang, cần có chất mang thích hợp để phân phối, lưu giữ giải phóng BMP-2 179 cách bền vững [7] Trong thực hành lâm sàng tại, ACS chất mang tiêu chuẩn cho rhBMP-2 bán thương mại Tuy nhiên, phải sử dụng nồng độ rhBMP-2 cao ACS sử dụng làm chất mang [5] Như chứng minh trước đây, liều cao BMP-2 gây tác dụng phụ lâm sàng nghiêm trọng hình thành xương phát, tiêu xương huỷ cốt bào trung gian, tạo tế bào lipd TẠP CHÍ Y DƯỢC LÂM SÀNG 108 Tập 17 - Số 1/2022 không mong muốn ung thư Ngồi ra, rhBMP-2 liều cao gây phù sưng tấy cấp tính, dẫn đến tắc nghẽn đường thở gây tử vong dùng vùng miệng hàm mặt [10] Do đó, nên áp dụng rhBMP-2 liều thấp để tránh tác dụng phụ Trong sản phẩm thương mại, nồng độ rhBMP-2 với chất mang ACS 1,5μg/μl dùng cho người tổng liều khơng q 12mg 8CC thể tích xương ghép Có số lý OCP/Col chất mang tiềm vượt trội cho rhBMP-2 so với ACS Đầu tiên, theo báo cáo trước đây, thân OCP/Col có hoạt tính quy nạp xương [6] Như thể Hình 1, 5, hình thành xương quan sát vùng rìa tổn thương nhóm OCP/Col khơng có rhBMP-2, cho thấy OCP/Col có tạo q trình tạo xương bề mặt trình quy nạp xương Rõ ràng rhBMP-2 làm tăng hoạt động quy nạp xương OCP/Col, OCP/Col với rhBMP-2 gây hình thành xương trưởng thành với xương vỏ tủy xương nhiều so với OCP/Col khơng có rhBMP-2 (Hình 1, 5) BMD có xu hướng tăng phụ thuộc vào thời gian, không quan sát thấy khác biệt đáng kể Cũng khơng có khác biệt đáng kể nhóm ACS OCP/Col với nồng độ rhBMP-2 khác (Hình 3) Điều cho thấy chất lượng xương tương tự nhau, số lượng khác ACS OCP/Col với tư cách chất mang Thứ hai, thành phần OCP/Col thuận lợi để sử dụng làm chất mang rhBMP-2 rhBMP-2 biết liên kết chặt chẽ với canxi photphat collagen (là thành phần OCP/Col) Người ta suy đốn rhBMP-2 giải phóng OCP collagen bị phân hủy, cho phép việc phát hành chậm rhBMP-2 [1] Tàn dư OCP/Col quan sát thấy sau cấy ghép tuần, ACS hấp thu hồn tồn Điều hỗ trợ cho việc giải phóng bền vững rhBMP-2 với OCP/Col làm chất mang Hơn nữa, rhBMP-2 ảnh hưởng đến q trình hóa học q trình tế bào gốc trung mơ tăng sinh biệt hóa thành nguyên bào xương, đó, cấu trúc xốp OCP/Col (bao gồm collagen) mơi trường thích hợp cho di chuyển tế bào Cuối cùng, DOI:… OCP/Col có độ bền học vượt trội so với ACS Chúng tơi quan sát thấy xương hình thành nhóm cấy ghép OCP/Col dày so với xương nhóm cấy ghép ACS (Hình 5) Phát cho thấy OCP/Col đủ cứng để chống lại áp lực từ vạt da rhBMP-2/ACS chấp thuận ứng dụng lâm sàng để bảo tồn huyệt sau nhổ nâng xoang hàm vùng hàm mặt Tại vùng này, chất liệu implant không bị áp lực bao bọc thành xương Tuy nhiên, chất liệu cấy ghép cần có độ bền học định trường hợp nâng xương ổ Về mặt này, rhBMP-2 với OCP/Col vật liệu cấy ghép tốt để tái tạo xương có hướng dẫn (Guide Bone RegenerationGBR) có độ cứng tính linh hoạt Trong nghiên cứu này, chứng minh khả tái tạo xương vượt trội tổn thương khuyết hổng xương vòm sọ chuột với rhBMP-2 mang OCP/Col Bản thân OCP/Col có hoạt tính quy nạp xương, rhBMP2 liều thấp giúp tăng cường hoạt động hoạt tính này Theo phân tích định tính sử dụng Micro-CT kiểm tra mơ học, nồng độ rhBMP-2 giảm xuống ¼ lần sử dụng OCP/Col làm chất mang so với ACS (Hình 6) Gần đây, nhu cầu tái tạo xương ổ ngày gia tăng trước phổ biến phương pháp trồng implant Chúng gợi ý rhBMP-2 với OCP/Col vật liệu cấy ghép lý tưởng cho GBR tính quy nạp xương vượt trội đặc tính học độ cứng tính linh hoạt Kết luận Tóm lại, thân OCP/Col chất ghép xương tốt, chất mang cho rhBMP-2, giúp làm giảm liều hiệu rhBMP-2, từ áp dụng lâm sàng cách an toàn, hiệu đáng tin cậy Tài liệu tham khảo Boerckel JD, Kolambkar YM et al (2011) Effects of protein dose and delivery system on BMPmediated bone regeneration Biomaterials 32: 5241-5251 180 JOURNAL OF 108 - CLINICAL MEDICINE AND PHARMACY Vol.17 - No1/2022 Brown KV, Li B et al (2011) Improving bone formation in a rat femur segmental defect by controlling bone morphogenetic protein-2 release Tissue Eng Part A 17: 1735-1746 Carreira A, Lojudice F et al (2014) Bone morphogenetic proteins: Facts, challenges, and future perspectives J Dent Res 93: 335-345 Kamakura S, Sasano Y et al (2002) Implanted octacalcium phosphate is more resorbable than β ‐ tricalcium phosphate and hydroxyapatite J Biomed Mater Res Part A 59: 29-34 Kawai T, Tanuma Y et al (2016) Clinical safety and efficacy of implantation of octacalcium phosphate collagen composites in tooth extraction sockets and cyst holes J Tissue Eng 7: 2041731416670770 Kouketsu A, Matsui K et al (2020) Octacalcium phosphate collagen composite stimulates the 181 DOI: … expression and activity of osteogenic factors to promote bone regeneration J Tissue Eng Regen Med 14: 99-107 Lee YH, Lee BW et al (2019) Application of alginate microbeads as a carrier of bone morphogenetic protein-2 for bone regeneration J Biomed Mater Res B Appl Biomater 107: 286-294 Lichte P, Pape HC et al (2011) Scaffolds for bone healing: Concepts, materials and evidence Injury 42: 569-573 Suzuki O, Kamakura S et al (2006) Bone formation enhanced by implanted octacalcium phosphate involving conversion into Ca-deficient hydroxyapatite Biomaterials 27: 2671-2681 10 Woo EJ (2012) Adverse events reported after the use of recombinant human bone morphogenetic protein J Oral Maxillofac Surg 70: 765-767  ... khơng có khả quy nạp xương (osteoinductivity) [8] Protein tạo hình xương người tái tổ hợp typ (rhBMP -2) , protein quy nạp xương quan trọng Trong phẫu thuật hàm mặt, phê duyệt để sử dụng lâm sàng phục... hoạt Trong nghiên cứu này, chứng minh khả tái tạo xương vượt trội tổn thương khuyết hổng xương vòm sọ chuột với rhBMP -2 mang OCP/Col Bản thân OCP/Col có hoạt tính quy nạp xương, rhBMP2 liều thấp. .. thiểu liều rhBMP -2 hiệu Mục tiêu nghiên cứu để đánh giá tiềm tạo xương rhBMP -2 liều thấp mang OCP/Col so với mang ACS Đối tượng phương pháp 2. 1 Chuẩn bị OCP, OCP/Col, atelocollagen OCP tổng hợp