Mối liên quan giữa biểu hiện mARN của gen CYP2E1 với giới hạn nồng độ tiếp xúc của benzen, toluen, xylen và ethylbenzen ở công nhân sản xuất sơn

Dung môi hữu cơ (VOCs) nói chung và đặc biệt là benzen(B), toluen(T), xylen(X), ethylbenzen(E) nói riêng với đặc điểm về khả năng hòa tan và độ bay hơi cao BTEX là nhóm xuất hiện nhiều trong môi trường của ngành sản xuất sơn.

K t qu nghiên c u KHCN MỐI LIÊN QUAN GIỮA BIỂU HIỆN mARN CỦA GEN CYP2E1 VỚI GIỚI HẠN NỒNG ĐỘ TIẾP XÚC CỦA BENZEN, TOLUEN, XYLEN VÀ ETHYLBENZEN Ở CÔNG NHÂN SẢN XUẤT SƠN Nguy n Th Hi n1,2, Đ Th C m Nhung1,2, Nguy n Phú Hùng3, Bùi Ph

ng Thu n1, Nguy n Quang Huy1 Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Viện Khoa học An toàn Vệ sinh Lao động; Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên D I MỞ ĐẦU ung môi hữu (VOCs) nói chung đặc biệt benzen(B), toluen(T), xylen(X), ethylbenzen(E) nói riêng với đặc điểm khả hịa tan độ bay cao BTEX nhóm xuất nhiều môi trường ngành sản xuất sơn Những người làm việc mơi trường có nguy tổn hại đến sức khỏe gây độc thần kinh, suy giảm khả sinh sản, tổn thương gan thận, suy hô hấp, viêm da Cytochrome P450 nhóm enzym có vai trị quan trọng q trình chuyển hóa nhiều chất sinh học hợp chất nội sinh bao gồm thuốc, thực phẩm chức năng, dung môi dùng công nghiệp chất gây nhiễm thành dạng chuyển hóa [1] Ngồi chúng cịn tham gia vào q trình ơ-xi hóa, xúc tác hoạt hóa tiền chất gây ung thư thành dạng cuối gây ung thư Trong nhóm CYP2E1 đóng vai trị quan trọng q trình chuyển hóa dung mơi hữu nói chung nhóm BTEX nói riêng [2] Sản phẩm chuyển hóa nhóm BTEX Việt Nam nhiều nước giới sử dụng làm số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với BTEX Trong nhóm dung mơi hữu sử dụng, Việt Nam có số giám sát sinh học cho người lao động (NLĐ) tiếp xúc với B, T, X [3],[4] số khác chưa có quy định Tuy nhiên số áp dụng để giám sát cho chất đơn lẻ, không sử dụng để giám sát cho nhóm chất, thực tế NLĐ phải tiếp xúc với VOCs theo nhóm Ảnh hưởng tác động từ nhóm chất khác với tác động chất riêng lẻ Với mục tiêu nghiên cứu để có sở cho nghiên cứu tiếp theo, tìm số giám sát sinh học cho NLĐ có tiếp xúc với nhóm VOCs nói chung nhóm BTEX nói riêng, chúng tơi đặt vấn đề nghiên cứu “Mối liên quan biểu mARN gen CYP2E1 với giới hạn nồng độ tiếp xúc benzen, toluen, xylen ethylbenzen công nhân sản xuất sơn” Nghiên cứu thực 73 công nhân ngành sản xuất sơn có tiếp xúc trực tiếp với BTEX Đây sở cho việc bảo vệ sức khỏe NLĐ, phòng tránh bệnh nghề nghiệp cách hiệu bền vững II ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng mẫu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu gồm 73 công nhân làm việc công ty sản xuất sơn tiếp xúc trực tiếp với BTEX Mỗi đối tượng tham gia nghiên cứu lấy: + 5ml máu tĩnh mạch vào thời điểm ca Tạp chí Hoạt động KHCN An toàn - Sức khỏe & Môi trường lao động, Số 1,2&3-2019 17 K t qu nghiên c u KHCN làm việc, cho vào ống đủ tiêu chuẩn có chứa chất chống đơng EDTA Mẫu sinh học sau lấy bảo quản lạnh, sau bảo quản -800C phịng thí nghiệm + 15ml nước tiểu lấy vào cuối ca làm việc ngày cuối tuần, bảo quản mát sở chuyển phịng thí nghiệm, chia thành ống nhỏ tích 2ml, sau bảo quản -800C phịng thí nghiệm 2.2 Hóa chất, dụng cụ - Hóa chất phân tích RT-PCR: Hóa chất dùng cho tách chiết ARN tổng số: total ARN purification Kit (do Norgen Canada cung cấp) Hóa chất dùng cho tổng hợp cADN: sử dụng kit First Strand cADN Synthesis Kit (do Thermo Fisher Scientific cung cấp) Hóa chất dùng cho phản ứng Reatime - PCR: vTOPreal qPCR 2X PreMix SYBR (do hãng Enzynomics cung cấp) Các hoá chất khác gồm: Dung dịch đệm TAE 1X, Agarose, ADN loading Dye (6x), thang ADN chuẩn 1kb (do Thermo Fisher Scientific cung cấp) - Hóa chất phân tích sản phẩm chuyển hóa: Bao gồm hóa chất Sigma đảm bảo phân tích lượng vết T,T- MUCONIC 98% sigma; KH2PO4; H3PO4 85%; Methanol; Axit acetic 99,7%; Na2HPO4; Dung dịch chuẩn o-cresol; Isoproyl ete; HCl; n-tetrabutylammonium bromua (TBAB); KH2PO4; MeOH; chất chuẩn o-mHA; pmHA, m-mHA… 2.3 Phương pháp nghiên cứu Tách chiết ARN tổng số ARN tổng số tách kít Total ARN purification Kit Norgen, quy trình tách thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm tách ARN tổng số đo máy quang phổ nanodrop để xác định độ tinh nồng độ xác Tổng hợp cADN cADN tổng hợp từ mẫu tách ARN tổng số enzym phiên mã ngược sử dụng kit RevertAid First Strand cADN Synthesis Kit 18 (Thermal Scienctific), quy trình tổng hợp thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm tổng hợp cADN kiểm tra gel agarose 1% Xác định hàm lượng mARN kỹ thuật Realtime PCR Sử dụng kỹ thuật Realtime PCR để đánh giá mức độ biểu hiệu mARN gen CYP2E1 Phản ứng Realtime PCR nghiên cứu sử dụng TOPreal™ qPCR 2X PreMIX (SYBR Green with low ROX) kit nhà sản xuất Enzynomic Phản ứng Realtime PCR sử dụng cặp mồi CYP2E1F1, CYP2E1R1 (Bảng 1) nhân lên đoạn cADN gen CYP2E1 b-actin F, b-actin R nhân lên đoạn cADN gen b-actin phản ứng riêng rẽ sau sử dụng mức độ biểu mARN b-actin làm chuẩn để đánh giá tương đối mức độ biểu mARN gen CYP2E1 mẫu nghiên cứu Mỗi mẫu nghiên cứu thực lặp lại lần Bảng Trình tự cặp mồi phản ứng RTPCR [2] M i CYP2E1 F1 CYP2E1 R1 Trình t m i (5’-3’) ACCTGCCCCAT GAAGCAACC GAAACAACTCC ATGCGAGCC b- actin F CAACTCCATCA TGAAGTGTGAC b-actin R CCACACGGAGT ACTTGCGCTC Tm (oC) S n ph m PCR (bp) 62,5 60,5 246 60,3 65,2 184 Phương pháp phân tích sản phẩm chuyển hóa BTEX số TTMA, O-cre, mHA, MA PGA: mHA, MA, PGA niệu phân tích theo phương pháp 8301 NIOSH máy HPLC Agilent 1290 [5] Phương pháp sắc ký hiệu cao máy HPLC Agilent 1290 dùng để phân tích axit tt, muconic [6] O-cresol phân tích theo phương pháp 8305 NIOSH [5] Tạp chí Hoạt động KHCN An toàn - Sức khỏe & Môi trường lao động, Số 1,2&3-2019 K t qu nghiên c u KHCN máy sắc kí khí Agilent GC/FID dụng cụ chuyên dùng bình định mức, pipet, cột chiết pha rắn chất đó; a giới hạn tiếp xúc, giới hạn cho phép a ≤1 Đạo đức nghiên cứu Phân tích số liệu Đối tượng hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật Phân tích thống kê thực cách sử dụng phi tham số Mann-Whitney U -test (SPSS cho Windows, 20.0) Kết biểu mARN gen CYP2E1 đề tài phân tích cơng thức 2-∆Ct Đây phương pháp dùng để định lượng tương đối dựa gen tham chiếu Trong phương pháp này, gen đích gen quản gia nghiên cứu tương ứng gen CYP2E1 Actin III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đặc điểm chung nhóm đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu có tuổi đời trung bình 42,08±8,8, tuổi nghề trung bình 20±8,68 73 đối tượng có 53 người công nhân nam, 20 công nhân nữ Tất cơng nhân hồn tồn khỏe mạnh, khơng mắc bệnh trước vào làm việc, thời điểm nghiên cứu không bị mắc bệnh gan sử dụng loại thuốc điều trị Giới hạn tiếp xúc BTEX áp dụng công thức (1): = Trong đó: + + + [ 7] + 3.2 Kết đo nồng độ BTEX sở nghiên cứu C1,C2, C3… Cn nồng độ chất độc hại thực tế môi trường; Chúng tiến hành đo nồng độ BTEX môi trường làm việc sở nghiên cứu, kết thu trình bày Bảng m1, m2, m3… mn nồng độ cho phép Bảng Thống kê số mẫu phân tích nồng độ BTEX sở nghiên cứu Ch s phân tích Benzen (B) Toluen(T) Xylen (X) Ethylbenzen Gi i h n ti p c a c a BTEX (a) S m u phân tích 73 73 73 73 73 t tiêu chu n S m t tiêu chu n S m u S m cho phép c a Vi t Nam* cho phép c a M ** không phát hi n S m u % S m u % 0 0 17 - 4,11 23,28 - 22 37 22 30,14 50,68 30,14 - - 60*** 82,19 Chú thích: - Không sử dụng * Tiêu chuẩn cho phép nồng độ B, T, X trung bình mơi trường lao động Việt Nam ≤ 5; 100; 300 mg/m3 [8] ** Tiêu chuẩn cho phép nồng độ B, T, X trung bình môi trường lao động ACGIH Mỹ ≤ 1,6; 75,434; 87mg/m3 [7],[9] *** - Số đối tượng có giới hạn tiếp xúc vượt q TCCP Tạp chí Hoạt động KHCN An toàn - Sức khỏe & Môi trường lao động, Soá 1,2&3-2019 19 K t qu nghiên c u KHCN Kết Bảng cho thấy: Theo tiêu chuẩn Việt Nam số người lao động (NLĐ) tiếp xúc với chất đơn lẻ B, T, E, X có 4,11% số đối tượng tiếp xúc với B cao tiêu chuẩn cho phép (TCCP), theo TCCP ACGIH có đến 30,14% số đối tượng tiếp xúc với B vượt TCCP Tương tự số đối tượng tiếp xúc với toulen vượt TCCP ACGIH 50,56%, theo TCCP Việt Nam có 23,28%, có 30,14% số đối tượng tiếp xúc với E vượt ngưỡng - theo TCCP ACGIH Đánh giá giới hạn tiếp xúc tổng dung mơi hữu BTEX theo ACGIH có đến 60/73 (82,19%) số đối tượng tiếp xúc với BTEX vượt ngưỡng cho phép 3.3 Kết phân tích sản phẩm chuyển hóa BTEX Bằng phương pháp trình bày chúng tơi phân tích nồng độ chất chuyển hóa sử dụng làm giám sát sinh học cho NLĐ có tiếp xúc với BTEX Cụ thể phân tích sản phẩm chuyển hóa TTMA, Ocresol, mHA tổng MA+PGA thu nồng độ cụ thể chất đối tượng, kết trình bày Bảng Kết Bảng cho thấy: Có 23/73 (31,50%) đối tượng nghiên cứu có nồng độ TTMA vượt TCCP ACGIH, theo tiêu chuẩn Việt Nam khơng có trường hợp nào, có 31/73 (42,26%) đối tượng có nồng độ Ocresol vượt TCCP 22/71 (31,14%) đối tượng có nồng độ MA+PGA vượt TCCP 3.4 Mối tương quan mức độ biểu gen CYP2E1 với giới hạn tiếp xúc BTEX ARN tổng số mẫu máu tách chuyển đổi thành cADN, sau thực phản ứng realtime PCR, thu chu kỳ ngưỡng gen CYP2E1 gen Actin Phân tích biểu gen CYP2E1 thông qua số: ct (chu kỳ ngưỡng), ∆Ct (hiệu số chênh lệch Ct gen đích với gen tham chiếu mẫu), 2-∆Ct biểu thị tỷ lệ biểu gen CYP2E1 so với gen b-actin Sử dụng phần mềm SPSS để tìm mối tương quan (tương quan Pearson Correlation) Phân tích kết thu từ biểu mARN gen CYP2E1 sản phẩm chuyển hóa nhóm BTEX cho kết Bảng Kết Bảng cho thấy mức độ biểu mARN gen CYP2E1 cho hệ số tương quan cao R=0,72 (p