So sánh kết quả nhuộm giữa PP nhuộm HE sử dụng hóa chất Clear-rite 3 (PP nhuộm HE thường quy) với PP nhuộm HE sử dụng dung dịch có thành phần chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (PP nhuộm HE cải tiến).
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học CHẤT LƯỢNG TIÊU BẢN GIẢI PHẪU BỆNH KHI NHUỘM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HEMATOXYLIN EOSIN, CÓ THAY THẾ DUNG DỊCH CLEAR- RITE 3, CỒN BẰNG DUNG DỊCH CÓ THÀNH PHẦN CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT Trần Thị Khuê Nữ*, Nguyễn Văn Thắng**, Nguyễn Ngọc Minh Tâm* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) phương pháp nhuộm thường quy xét nghiệm mô bệnh học Trong phương pháp (PP) nhuộm HE có bước dùng hóa chất clear-rite 3, cồn để tẩy parafin khỏi mơ, có tính định nhiều đến chất lượng nhuộm tiêu (TB) Tuy nhiên clear-rite độc hại người môi trường Mong muốn môi trường làm việc độc hại không ảnh hưởng đến chất lượng nhuộm, tiến hành sử dụng dung dịch tẩy rửa chứa chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS) 1,7 % để thay hóa chất clear-rite alcool Mục tiêu: So sánh kết nhuộm PP nhuộm HE sử dụng hóa chất Clear-rite (PP nhuộm HE thường quy) với PP nhuộm HE sử dụng dung dịch có thành phần chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (PP nhuộm HE cải tiến) Phương pháp: Nghiên cứu thực nghiệm Kết quả: Nhuộm hạt nhân đầy đủ ghi nhận 99,2% nhóm A 100% nhóm B, nhuộm tế bào chất đầy đủ 99,2% nhóm A 95,1% nhóm B, rõ 93,4% nhóm A 97,5% nhóm B, đồng 92,6% nhóm A 94,3% tiêu nhóm B, nhuộm sắc nét,tương phản 96,7% nhóm A 92,6% tiêu nhóm B, 100% tiêu nhóm A đủ tiêu chuẩn để chẩn đốn so với 98,4% tiêu nhóm B Kết luận: Dung dung dịch tẩy rửa chứa chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS)1,7% sử dụng thay hiệu cho hóa chất Clear-rite cồn quy trình nhuộm HE thường quy Từ khóa: phương pháp nhuộm HE, chất hoạt động bề mặt LAS ABSTRACT QUALITY OF PATHOLOGY SPECIMEN DYEING WITH HEMATOXYLIN EOSIN METHOD USING SURFACTANT COMPOSITION INSTEAD OF CLEAR-RITE AND ALCOHOL Nguyen Van Thang, Nguyen Ngoc Minh Tam, Tran Thi Khue Nu * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 294 – 299 Background: Hematoxylin-Eosin (HE) staining is a standard procedure in histopathological examination One step of this procedure is to use Clear-rite and alcohol to clean tissue of paraffin This step is crucial to the quality of the staining However, Clear-rite is hazardous to humans and the environment In this study, we experimented with replacing Clear-rite and alcohol with a liquid dishwashing solution containing 1.7% of Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS) as a way to improve the safety of working environments while maintaining high staining quality Objectives: Evaluate the efficacy of 1.7% dish washing liquid (LAS) solution as a deparaffinization agent for hematoxylin (H) and eosin (E) staining in comparison to Clear-rite and alcohol *Bệnh viện Bình Dân, Thành phố Hồ Chí Minh **Bộ môn Xét nghiệm, Đại học Y Dược, Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Trần Thị Khuê Nữ ĐT: 0986232315 Email: khuenutt@gmail.com Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 295 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Methods: Expreimental study Results: Adequate nuclear staining was noted in 99,18% in group A and 100% in group B, adequate cytoplasmic staining in 99,2% in group A and 95,1% in group B, clarity in 93.4% of group A and 97.5% of group B sections, uniform staining in 92.6% of group A and 94.3% of group B sections, crisp stain in 96.7% of group A and 92.6% of group B sections, and 100% of group A sections stained adequately for diagnosis in comparison with 98.4% in group B Conclusions: 1.7% DWS was found to be an effective, less hazardous, more economical and aster alternative deparaffinization agent to clear-rite and alcohol Keywords: deparaffinization hematoxylin and eosin, liquid dishwashing solution (LAS) chứa chất hoạt động bề mặt Sodium Linear ĐẶT VẤN ĐỀ Alkylbenzene Sulfonate (LAS) 1,7% để thay Nhuộm Hematoxylin- Eosin (HE) hóa chất clear-rite alcool giai đoạn tẩy phương pháp nhuộm thường quy xét parafin quy trình nhuộm Hematoxylin nghiệm mô bệnh học, sử dụng rộng rãi Eosin (Ở nghiên cứu sử dụng tiêu chuẩn vàng(7) chẩn đốn mơ dung dịch chất tẩy rửa Sunlight pha loãng 1,7%) bệnh học Trong PP nhuộm HE có bước dùng Mục tiêu nghiên cứu hóa chất clear-rite (là hóa chất thay Xylen Khảo sát nhuộm nhân nhuộm tế bào chất hay Toluen, bệnh viện dùng) PP nhuộm để tẩy parafin mô bước quan trọng, định nhiều đến chất lượng nhuộm tiêu Tuy nhiên Xylen, Toluen(9,10) độc hại người môi trường Các chất thay hóa chất hydrocacbon béo, hydrocacbon thơm, dầu dừa, hóa chất có chức tương tự Toluen, Xylen: làm sáng mô xử lý, khử parafin mô kỹ thuật nhuộm HE Tuy nhiên hầu hết sản phẩm thay Toluen đắt tiền khơng phải nguy hiểm hơn(3,10) Theo phân loại Cơ quan Quản lý An Toàn Sức Khỏe Nghề Nghiệp - Hoa Kỳ (Occupational Safety and Health Administration –OSHA)(5), thành phần hóa chất dung dịch Clear rite 3(13) sử dụng, phân loại lớp 1B nguy gây ung thư, hóa chất dễ cháy lớp 2, có ảnh hưởng đến quan đích gan thận tiếp xúc hóa chất lâu dài thường xuyên, nguy đột biến tế bào mầm nguy gây ung thư, gây tổn thương quan phơi nhiễm kéo dài, tiếp xúc lập lập lại Mong muốn mơi trường làm việc độc hại không ảnh hưởng đến chất lượng nhuộm, tiến hành sử dụng dung dịch tẩy rửa 296 Khảo sát độ rõ, tương phản đồng PP nhuộm So sánh hiệu PP nhuộm HE dùng dung dịch Clear-rite (HE thường quy) với PP nhuộm HE dùng LAS 1,7% (HE cải tiến) ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu 122 khối mô đúc parafin cắt mỏng khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện Bình Dân thời gian từ tháng 12/2018 đến tháng 05/2019 Bộ môn Xét nghiệm Đại học Y Dược Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm Phương pháp chọn mẫu Lấy mẫu thuận tiện thời gian nghiên cứu Cỡ mẫu Có 122 khối mơ đúc parafin Quy trình tiến hành nghiên cứu Có 122 khối parafin nghiên cứu cắt mảnh 244 tiêu với độ dày 3-4µm 122 TB nhóm A nhuộm quy trình nhuộm HE thường quy sử dụng hóa chất clear-rite Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 alcool làm chất tẩy parafin 122 TB nhóm B sử dụng dung dịch chứa thành phần LAS 1,7% 90°C tẩy parafin Dung dịch chứa thành phần LAS 1,7% điều chế cách hòa tan 25 ml DWL (Sunlight Dish washing Liquid) 1500 ml nước cất Quy trình nhuộm nhóm A B đưa Bảng Bảng Quy trình nhuộm HE thường quy Các giai đoạn Hóa chất Thời gian Clear-rite phút Clear-rite phút Clear-rite phút Tẩy parafin Alcool 99,5 phút Alcool 95 phút Alcool 90 phút Rửa nước phút Hematoxylin 4-5 phút Nhuộm nhân 10 Rửa nước phút 11 Rửa axit alcool 1% nhúng Tẩy axit 12 Rửa nước 1-2 phút 13 Dung dịch Ammonia 1% phút Kiềm hóa (bluing) 14 Rửa nước phút 15 Alcool 70 phút Nhuộm tế bào chất 16 Eosin 1-2 phút 17 Alcool 90 phút 18 Alcool 95 phút Biệt hóa alcool, làm 19 Alcool 99.5 phút 20 Clear rite phút Lau mô thừa xung quanh, để khô, dán keo Nghiên cứu Y học thống kê Stata 14.0 KẾT QUẢ Nhuộm nhân đầy đủ ghi nhận nhóm A 99,2% so với 100% nhóm B (p >0,05) Nhuộm tế bào chất đầy đủ nhóm A 99,2% so với 95,1% nhóm B (p >0,05) Độ rõ tiêu nhóm A 93,4% so sánh với 97,5% nhóm B (p >0,05) Nhuộm màu đồng nhóm A 94,3% so sánh với nhóm B 92,62% (p >0,05) Sự tương phản, sắc nét nhóm A 96,7% so sánh với nhóm B 92,62% (Hình 1) Đủ tiêu chuẩn đủ chẩn đốn nhóm A 100% so với nhóm B 98,4% (p >0,05) (Hình 2) Bảng Bảng quy trình nhuộm HE với dung dịch có thành phần LAS 1,7% Thời gian Tẩy parafin LAS 1,7% I 90 phút LAS 1,7% II 90 phút Nước cất I 90 30 giây Nước cất II 90 30 giây Nước máy 45 30 giây Nước máy T PXN 30 giây Nhuộm nhân 7.Hematoxylin Harris phút T PXN Rửa với nước phút Kiềm hóa (bluing) Dung dịch Thilium phút carbonate 1% T PXN 10 Rửa nước phút Nhuộm tế bào chất 11 Eosin T PXN phút Rửa nước Rửa nước T PXN phút Khử nước 12 Sấy khô 60 10 phút Các giai đoạn Hóa chất Nhiệt độ Hình Tổng hợp tỉ lệ nhuộm Xử lý phân tích số liệu Nhập liệu excel xử lý phần mềm Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Hình Tỉ lệ tiêu đủ chẩn đoán 297 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Hình Chất lượng nhuộm nhân tiêu mô túi mật A: Nhuộm HE thường quy (40X), B: Nhuộm HE cải tiến (40X) Hình Nhuộm tế bào chất tiêu mô túi mật A, C: Nhuộm HE thường quy (10X, 40X), B, D: Nhhuoojm HE cải tiến (10X, 40X) Hình Độ rõ, tương phản tiêu ba3n mô túi mật A, C: Nhuộm HE thường quy (10X, 40X), B, D: Nhhuoojm HE cải tiến (10X, 40X) BÀN LUẬN Theo phân loại OSHA(5) MSDS(13), clear-rite thuộc hóa chất dễ cháy loại có điểm 298 cháy 18,3°C/64,9°C, có tác dụng đến quan đích gan thận tiếp xúc hóa chất lâu dài thường xuyên, phân loại nhóm 1B nguy đột biến tế bào mầm nguy gây ung thư; nhóm nguy hiểm đường hơ hấp, gây tổn thương quan phơi nhiễm kéo dài tiếp xúc lặp lặp lại Do có điểm cháy thấp 18,3°C tương tự xylen nên chất thải không bỏ trực tiếp xuống hệ thống chất thải thơng thường, mà xử lý chất thải hóa chất nguy hại Tương tự nghiên cứu trước sử dụng dung dịch có thành phần LAS 1,7% thay cho hóa chất clear-rite q trình tẩy parafin Dung dịch có thành phần LAS hỗn hợp tạo bọt cao chất hoạt động bề mặt khơng ion, tạo thành từ alkylbenzenesulfonates, có tính chất dung mơi giúp hịa tan parafin Ngun tắc chất tẩy rửa nhiệt độ 900C(4) với chất hoạt động bề mặt giúp cho việc loại bỏ parafin khỏi tiêu cách giảm sức căng bề mặt nước, bước đầu tẩy parafin khỏi mơ, ngăn khơng cho parafin dính lại mảnh mơ từ parafin loại khỏi mảnh cắt, giúp tẩy parafin hoàn toàn So với clear-rite 3, chất tẩy rửa chén kinh tế, an toàn có sẵn Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng chất chứa thành phần LAS 1,7% Điều dẫn đến tác động gián tiếp đến an toàn nhân viên xử dụng xử lý chất thải hóa chất Với tác dụng có hại xylene biết đến, nhiều nhà nghiên cứu cố gắng sử dụng chất thay xylene mô bệnh học Buesa Peshkov nghiên cứu họ chứng minh tiêu tẩy rửa dung dịch rửa chén 1,7% 900C giúp loại bỏ xylen khỏi quy trình nhuộm(3) Nghiên cứu Ankle(1) kết luận nhuộm HE không chứa xylen alcool phương pháp thay tốt so với phương pháp thường quy, có đến 90% tiêu nhuộm đầy đủ để đưa chẩn đốn phương pháp khơng có xylen so với 88,33% phương pháp thường quy(1) Ramulu kết luận xà phòng rửa chén dạng Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 lỏng sử dụng chất thay hiệu cho xylen alcool quy trình nhuộm HE thường quy, nhuộm nhân đầy đủ rõ ràng so với nhuộm HE thường quy(12) Pandey cho thấy tiêu nhuộm HE với dung dịch tẩy rửa chén 1,7% ghi điểm tốt nhuộm tế bào chất độ tương phản Tỉ đủ để chẩn đoán 86% trường hợp so với nhuộm HE dùng xylen 84%(8) Trong nghiên cứu thực để xem liệu dung dịch chứa thành phần chất hoạt động bề mặt LAS 1,7% độc hại, rẻ tiền sẳn có thị trường xem giải pháp thay hiệu chất tẩy parafin cho phương pháp nhuộm HE Các tiêu nhuộm phương pháp HE thường quy (nhóm A) HE cải tiến (nhóm B), Bác sĩ Giải phẫu bệnh đánh giá cho thông số nhuộm màu nhân, nhuộm tế bào chất, độ rõ, tính đồng nhuộm tương phản, sắc nét nhuộm Nhuộm nhân đầy đủ ghi nhận nhóm A 99,2% so với 100% nhóm B Các nghiên cứu khác báo cáo số lượng nhóm A thấp nhóm B(1,8,12) Về nhuộm tế bào chất đầy đủ, nghiên cứu cho thấy 99,2% nhóm A so sánh với 95,1% nhóm B Kết tương tự nghiên cứu(1,12) Về vấn độ rõ nhuộm màu, nghiên cứu thống kê có 93,4% tiêu cho thấy rõ ràng đầy đủ để đánh giá nhóm A so sánh nhóm B 97,5%, kết nghiên cứu tương tự hầu hết nghiên cứu khác, thỏa đáng so với nghiên cứu khác Vấn đề đồng nhuộm màu, tất nghiên cứu sử dụng phương pháp dùng chất tẩy rửa chén pha loãng cho tỉ lệ không đồng thấp ngang với dùng xylen Dung dịch chứa thành phần LAS 1,7% sử dụng phổ biến tất nghiên cứu quy trình nhuộm khơng chứa xylen chúng nhạy cảm với nhiệt độ LDW hay LAS pha loãng phải trì nghiêm ngặt 900C Nhiệt độ giảm nhẹ khơng tẩy parafin hồn tồn Điều dẫn đến lượng parafin dư lại tiêu Điều Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Nghiên cứu Y học dẫn đến tiêu nhuộm không đồng Một số nghiên cứu thêm bước bổ sung 1,7% LDW III 900C 30 giây quy trình nhuộm tìm thấy kết tốt Nghiên cứu chúng tơi cho thấy tiêu có chất lượng nhuộm tương phản sắc nét nhóm A 96,7% so với nhóm B 92,6%, tương tự(12,14) số nghiên cứu khác báo cáo tỉ lệ tốt thông số phương pháp nhuộm(1,8) Trong điểm số tổng thể, tiêu nhuộm HE dùng LAS 1,7% đủ để chẩn đoán 98,2% so sánh với 100% tiêu đủ chẩn đoán nhóm A, trường hợp tương tự nghiên cứu khác(12,14) Phân tích thống kê cho thấy tiêu nhuộm HE với dung dịch chứa LAS 1,7% có tác dụng tương đương phương pháp nhuộm HE thường quy Giá trị p thu 0,292 (p >0,05) Tuy nhiên tiêu nhuộm cải tiến có khuynh hướng nhuộm màu đỏ Điều làm tiêu độ tương phản nhân tế bào chất KẾT LUẬN Đạt chất lượng nhuộm nhân: HE cải tiến 99,2%, HE thường quy 100% Đạt chất lượng nhuộm tế bào chất: HE cải tiến 95,1%, HE thường quy 99,2% Đạt chất lượng HE cải tiến/ HE thường quy: Độ 97,5%/93,4%, Độ tương phản 92,6%/96,7% Độ đồng 91,8%/94,3% Nhuộm HE cải tiến có ưu điểm nỗi trội: Ít độc hại - Giá thành thấp - Thời gian nhuộm nhanh TÀI LIỆU THAM KHẢO Ankle MR, Joshi PS (2011) "A study to evaluate the efficacy of xylene-free hematoxylin and eosin staining procedure as compared to the conventional hematoxylin and eosin staining: An experimental study" J Oral Maxillofac Pathol, 15(2):161-167 Bộ Y Tế (2016) Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh- Tế bào học NXB Y học, pp.22; 215; 245-247 Buesa René J, Peshkov Maxim V (2009) "Histology without xylene" Ann Diagn Pathol, 13(4):246-256 Gayathri G, Snegha A, Teleflo B (2016) Substitutes for xylene in histopathology and the role of temperature J Path Micro, 2(2):5563 Hazard Communication (2016) "Hazard Classification Guidance for Manufacturers, Importers, and Employers" Department of Labor, pp.221, 300-304 299 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Kandyala R, Raghavendra SP, et al (2010) "Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures" Journal of Oral and Maxillofacial Pathology, doi: 10.4103/0973-029X.64299 Kumar GL, Kiernan JA, Dako AS (2010) "Education GuideSpecial Stains and H & E: Pathology" Dako North America, pp.29-36, 118-129, 177-183 Pandey P, Dixit A, Tanwar A, et al (2014) "A comparative study to evaluate liquid dish washing soap as an alternative to xylene and alcohol in deparaffinization and hematoxylin and eosin staining" Journal of Laboratory Physicians, 6(2):84 Phạm Minh Khiêm, Nguyễn Thị Kim Oanh, Nguyễn Văn Lực (2010) Toluen & ảnh hưởng môi trường người Bài tiểu luận Đại học Sư Phạm Đà Nẵng 10 Rai R, Yadav R, Bhardwaj A (2016) "Biosafe sunstitutes to xylene: A review" International Journal of Information Research and Review, 3(6):2529-2532 300 11 Ramaswamy AS, et al (2017) "A Study of Xylene Free Hematoxylin and Eosin Staining Procedure" AAMS, 1:A16-A21 12 Ramulu S, Koneru A, Ravikumar S, et al (2012) "Liquid dish washing soap: An excellent substitute for xylene and alcohol in hematoxylin and eosin staining procedure" J Orofac Sci, 4(1):37 13 Scientific Thermo Fisher (2015) "Clear rite safety data sheet Mercedes Medical" URL: https://www.msdsexplorer.com/ 14 Sravya T, Rao GV, Kumari MG, et al (2018) "Evaluation of biosafe alternatives as xylene substitutes in hematoxylin and eosin staining procedure: A comparative pilot study" J Oral Maxillofac Pathol, 22(1):148 Ngày nhận báo: 31/07/2019 Ngày phản biện nhận xét báo: 30/08/2019 Ngày báo đăng: 10/10/2019 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học ... tơi sử dụng dung dịch có thành phần LAS 1,7% thay cho hóa chất clear -rite q trình tẩy parafin Dung dịch có thành phần LAS hỗn hợp tạo bọt cao chất hoạt động bề mặt không ion, tạo thành từ alkylbenzenesulfonates,... so với nhuộm HE dùng xylen 84%(8) Trong nghiên cứu thực để xem liệu dung dịch chứa thành phần chất hoạt động bề mặt LAS 1,7% độc hại, rẻ tiền sẳn có thị trường xem giải pháp thay hiệu chất tẩy... cho phương pháp nhuộm HE Các tiêu nhuộm phương pháp HE thường quy (nhóm A) HE cải tiến (nhóm B), Bác sĩ Giải phẫu bệnh đánh giá cho thông số nhuộm màu nhân, nhuộm tế bào chất, độ rõ, tính đồng nhuộm