Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài stephania lour ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG VĂN THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC HAI LOÀI STEPHANIA LOUR Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG VĂN THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC HAI LOÀI STEPHANIA LOUR Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62.72.04.06 Người hướng dẫn khoa học: GS TS Phạm Thanh Kỳ PGS TS Nguyễn Quốc Huy HÀ NỘI, NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn GS TS Phạm Thanh Kỳ PGS TS Nguyễn Quốc Huy Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả Hoàng Văn Thủy LỜI CẢM ƠN Trong q trình nghiên cứu hồn thành luận án này, nhận nhiều giúp đỡ quý báu Ban lãnh đạo Trường Đại học Dược Hà Nội, Thầy Cô giáo, nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực đồng nghiệp, bạn bè gia đình Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS TS Phạm Thanh Kỳ, PGS TS Nguyễn Quốc Huy trực tiếp hướng dẫn, hết lòng bảo tận tình cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn: Các cán - Phòng đào tạo sau đại học - Trường đại học Dược Hà Nội, GS TS Nguyễn Thanh Bình, PGS TS Nguyễn Viết Thân, PGS TS Trần Mạnh Tuyển, PGS TS Trần Văn Ơn, PGS TS Nguyễn Thu Hằng, TS Hoàng Quỳnh Hoa, PGS TS Nguyễn Thùy Dương Các thầy cô Bộ môn Thực Vật, Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Dược học cổ truyền Bộ môn Dược lực - Trường ĐH Dược Hà Nội Các cán - Viện Hóa học hợp chất tự nhiên - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam PGS TS Đỗ Thị Thảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Đã đóng góp ý kiến q báu cho tơi thực luận án Nhân dịp xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, cán phịng ban, mơn Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện tốt để hoàn thành Luận án Cảm ơn quan bảo hiểm xã hội tỉnh, Sở Y tế Yên Bái quan tâm tạo điều kiện cho vật chất tinh thần để tơi hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn ông Ly Văn Chấn, Yên Bái, bà Nguyễn Phương Huyền tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, giúp thu thập mẫu Bình vơi nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới người bạn, người thân gia đình bố, mẹ, vợ kịp thời động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành nhiệm vụ Xin trân trọng cảm ơn! Hoàng Văn Thủy MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ PHÂN BỐ CHI STEPHANIA LOUR .3 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Phân bố chi Stephania Lour 1.2 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI STEPHANIA LOUR VÀ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU 1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Stephania Lour 1.2.2 Đặc điểm thực vật loài Stephania venosa (Bl.) Spreng 1.2.3 Đặc điểm thực vật loài Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang 1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHI STEPHANIA LOUR 1.3.1 Alcaloid Các alcaloid nhóm benzylisoquinolin Các alcaloid nhóm bisbenzylisoquinolin Các alcaloid nhóm aporphin 11 Các alcaloid nhóm proaporphin 15 Các alcaloid nhóm protoberberin 16 Các alcaloid nhóm morphinan 18 Các alcaloid nhóm hasubanan 19 Các alcaloid nhóm eribidin (dibenzazonin) 21 Các alcaloid nhóm stephaoxocan 21 1.3.2 Flavonoid 21 1.3.3 Các nhóm chất khác 21 1.4 THÀNH PHẦN HĨA HỌC HAI LỒI STEPHANIA VENOSA VÀ STEPHANIA VIRIDIFLAVENS 21 1.4.1 Thành phần hóa học lồi Stephania venosa (Bl.) Spreng 21 1.4.2 Thành phần hóa học lồi Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang .22 1.5 TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ CÔNG DỤNG LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ STEPHANIA VIRIDIFLAVENS 23 1.5.1 Tác dụng sinh học cơng dụng lồi Stephania venosa (Bl.) Spreng .23 1.5.2 Tác dụng sinh học cơng dụng lồi Stephania viridiflavens 28 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 29 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 29 2.1.2 Động vật dòng tế bào ung thư thí nghiệm 29 2.1.3 Hóa chất, dung mơi 30 2.1.4 Máy móc, thiết bị dụng cụ nghiên cứu 30 2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Nghiên cứu thực vật 31 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 32 2.2.3 Thử độc tính cấp đánh giá tác dụng sinh học 33 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 44 1.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT 44 3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật loài nghiên cứu 44 3.1.2 Kết giám định tên khoa học 50 3.1.3 Đặc điểm vi học loài nghiên cứu 54 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 62 3.2.1 Kết định tính lồi nghiên cứu (M1 M2) 62 3.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ hai loài nghiên cứu 65 3.2.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập 70 3.2.4 Kết định lượng alcaloid toàn phần L- tetrahydropalmatin củ loài nghiên cứu 99 3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 100 3.3.1 Độc tính cấp lồi nghiên cứu 100 3.3.2 Tác dụng giảm đau loài nghiên cứu 102 3.3.3 Tác dụng chống viêm loài nghiên cứu 104 3.3.4 Hoạt tính gây độc tế bào số dòng tế bào ung thư cao chiết tổng chất phân lập từ loài nghiên cứu 106 3.3.5 Hoạt tính chống oxi hóa lồi nghiên cứu 108 CHƯƠNG BÀN LUẬN 111 4.1 VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 111 4.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 118 4.3 VỀ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 128 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 136 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ đầy đủ, giải nghĩa Phổ cộng hưởng từ proton (Proton nuclear magnetic resonance) H-NMR 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị carbon 13 (Carbon-13 nuclear magnetic resonance) Co 5-HT Tia gamma từ đồng vị phóng xạ Serotonin [α]D A549 AchE Góc quay cực Tế bào ung thư phổi (Human lung carcinoma cells) Acetycholin esterase ADP Adenosin diphosphat AGS Tế bào ung thư dày người (Human stomach gastric adenocarcinoma) ALT Alanine transaminase AST Aspartate transaminase BC BchE Tế bào ung thư vú (Human breast cancer cell) Butyrylcholinesterase BuOH Butanol CI COSY Khoảng tin cậy (Confidence interval) Correlated Spectroscopy DĐVN DEPT Dược điển Việt Nam Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ED50 ESI-MS Liều có tác dụng 50% (Effective dose 50%) Khối phổ - ion hóa điện tử (Electrospray Ionization Mass Spectroscopy) EtOH Ethanol Glc Glucopyranosid Gy H358 Gray - Đơn vị liều hấp thụ xạ (jun/kilogam) Tế bào ung thư cuống phổi phế nang (Human lung alveolus carcinoma) C-NMR 60 60 Coban Hela Tế bào ung thư tiền liệt tuyến người (Human cervical carcinoma) HepG2 HL-60 Tế bào ung thư gan người (Human hepatocellular carcinoma) Tế bào ung thư bạch cầu người (human promyelocytic leukemia cell line) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HNIP Phòng tiêu Trường Đại học Dược Hà Nội (The herbarium of Hanoi University of Pharmacy) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HSQC Heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy HTCO IC50 Hoạt tính chống oxi hố Nồng độ ức chế 50% hoạt tính (Half maximal inhibitory concentration) K562 LC50 LD50 MCF7 MDA-MB-231 Dòng tế bào bạch cầu người (Human leukemic cell line) Nồng độ gây chết 50% (Lethal concentration 50%) Liều gây gây chết 50% (Lethal Dose 50%) Tế bào ung thư vú người (Human breast carcinoma) Dòng tế bào ung thư vú độc lập với nội tiết tố (Hormoneindependent breast cancer cell line) MDA Ung thư vú độc lập với nội tiết tố (Hormone-independent breast cancer) MeOH Methanol MIC MOLT -3 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration) Tế bào bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính (Acute lymphoblastic leukemia cells) MRC-5 Tế bào phổi phơi thai bình thường (Normal embryonic lung cells) MS MTT NaCMC Khối phổ (Mass spectrometry) 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-điphenyltetrazol brom Natri Carboxymethyl Cellulose NCI NMDA Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute) N-methyl Daspartat NOESY Phổ hiệu ứng hạt nhân Overhauser (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) OD ODC ODT OVCAR-8 Mật độ quang học (Optical density) Mật độ quang học giếng chứng khơng có mẫu thử Mật độ quang học mẫu thử Dòng tế bào ung thư buồng trứng (Human ovarian cancer cell line) PBMCs Các tế bào bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi người (Human peripheral blood mononuclear cells) Ph/đoạn PRP RNA Phân đoạn Huyết tương người giàu tiểu cầu (Human platelet-rich plasma) Acid ribonucleic S Stephania SKC SKOV3 Sắc ký cột Dòng tế bào ung thư buồng trứng người (Human ovarian cancer cell line) SKLM SRB Sắc ký lớp mỏng Sulforhodamin B Stt TBA Số thứ tự Acid thiobarbituric TCA Acid tricloacetic TLC tnc TT TLTK UV VHLKHCNVN VKNTTW WHO Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) Nhiệt độ nóng chảy Thuốc thử Tài liệu tham khảo Phổ tử ngoại Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương World Health Organization (Tổ chức y tế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân bố số loài thuộc chi Stephania Lour Việt Nam Bảng 1.2 Danh mục chất thuộc nhóm benzylisoquinolin Bảng 1.3 Danh mục chất thuộc nhóm bisbenzylisoquinolin Bảng 1.4 Danh mục chất thuộc nhóm aporphin 11 Bảng 1.5 Danh mục chất thuộc nhóm proaporphin 16 Bảng 1.6 Danh mục chất thuộc nhóm protoberberin 16 Bảng 1.7 Danh mục chất thuộc nhóm morphinan 18 Bảng 1.8 Danh mục chất thuộc nhóm hasubanan 19 Bảng 1.9 Danh mục ba chất thuộc nhóm stephaoxocan 21 Bảng 1.10 Tác dụng sinh học số alcaloid có lồi S venosa 25 Bảng 2.1 Thơng tin mẫu cao chuẩn bị để thử độc tính đánh giá tác dụng 34 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu hai mẫu nghiên cứu phương pháp hóa học 62 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR SB1 (CDCl3, 500, 125 MHz, δ ppm) 71 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR, HMBC SB2 (CD3OD, 500, 125 MHz, δ ppm) 73 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR hỗn hợp chất SB3 chất tham khảo .74 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR SB4 chất tham khảo Stepharin 75 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR chất SE1 chất tham khảo [23] 77 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR SE3 chất tham khảo Stephanin 80 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ NMR SE5 chất tham khảo 81 Bảng 3.9 Dữ liệu phổ NMR SE6 (SDLE1.1) chất tham khảo 83 Bảng 3.10 Dữ liệu phổ NMR chất SE7 chất tham khảo [59] 85 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ H-NMR chất SE8 chất tham khảo [145] 86 13 Bảng 3.12 Dữ liệu phổ C-NMR chất SE8 chất tham khảo [140] .87 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ NMR chất SE9 chất tham khảo 89 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ SVB7 so với chất tham khảo 91 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ NMR SVB6.1 chất tham khảo 92 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ SVB12 chất tham khảo 93 Bảng 3.17 Dữ liệu phổ NMR SVB13.1 tham khảo 95 Bảng 3.18 Dữ liệu phổ NMR SVB8 so với chất tham khảo 98 Bảng 3.19 Kết định lượng alcaloid toàn phần củ loài nghiên cứu .99 Bảng 3.20 Số lượng chuột nhắt trắng chết dùng mẫu thử BV1 mức liều thử 100 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Rotundin (lần 6) PL_160 1.3 Định lượng rotundin mẫu thử Sắc ký đồ mẫu thử (lần 1) PL_161 Sắc ký đồ mẫu thử (lần 2) PL_162 Sắc ký đồ mẫu thử (lần 3) PL_163 II MẪU THỬ M2 (BÌNH VƠI N BÁI) Chuẩn bị mẫu thử: theo quy trình định lượng L-tetrahydropalmatin chun luận Bình vơi DĐVN IV Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Chuẩn Rotundin (VKNTTW, WS 0316141.01; 96,16% C21H25NO4 nguyên trạng) Cân xác khoảng 20 mg chuẩn rotundin bình định mức 25 ml, hịa tan, pha lỗng vừa đủ methanol Lắc kỹ (Cg) Hút xác 4,0 ml dung dịch chuẩn vừa pha (Cg) vào bình định mức 50 ml, pha lỗng vừa đủ pha động, lắc kỹ Khối lượng cân mẫu chuẩn: 19,77 mg Điều kiện khai triển: - Máy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu (HHC : 01/2020) - Cột Phenomenex Germini, C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) cột tương đương - Dung dịch đệm pH 4,5 : Hỗn hợp gồm dung dịch kali dihydrophosphat 0,05M – triethylamin (1000:2), điều chỉnh pH acid phosphoric (TT) Dung dịch đệm pH 4,5 lọc qua màng lọc 0,45µm - Pha động: + Dung dịch đệm pH4,5 – acetonitril (80 - 20) + v = 2,0 ml/ phút + V inj = 20µl Thẩm định phương pháp: Thẩm định tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống Định lượng mẫu: Xác định giá trị trung bình lần định lượng PL_164 2.1 Thẩm định tính đặc hiệu Kết quả: Đạt Hình ảnh chồng phổ mẫu chuẩn mẫu thử (quét DAD dải sóng từ 190 – 800) PL_165 25 20 15 10 mAU Ch1-283nm,4nm (1.00) rotundin/21.076/526224 2.1.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 2.1.2 Sắc ký đồ mẫu thử mAU Ch1283n m4n m (1.00 ) 5.0 10.0 15.0 10.0 15.0 rotundin/21.183/229765 -5 0.0 15 10 0.0 5.0 PL_166 2.1.3 Sắc ký đồ dung mơi PL_167 2.2 Thẩm định sơ độ thích hợp hệ thống Kết quả: Đạt Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Rotundin (lần 1) PL_168 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Rotundin (lần 1) PL_169 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Rotundin (lần 1) PL_170 1.3 Định lượng rotundin mẫu thử Sắc ký đồ mẫu thử (lần 1) PL_171 Sắc ký đồ mẫu thử (lần 2) PL_172 Sắc ký đồ mẫu thử (lần 3) PL_173 ... tính sinh học, để từ góp phần nâng cao giá trị sử dụng hai lồi Bình vơi Việt Nam, luận án "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour Việt Nam" ,...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG VĂN THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC HAI LOÀI STEPHANIA LOUR Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN... 1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC HAI LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ STEPHANIA VIRIDIFLAVENS 21 1.4.1 Thành phần hóa học lồi Stephania venosa (Bl.) Spreng 21 1.4.2 Thành phần hóa học loài Stephania