Vi nhân giống mía đường

Vi nhân giống mía đường

Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 1 SV MSSV Nguyễn Thị Lan Hương 60800762 Nguyễn Kim Ngân 60801343 VI NHÂN GIỐNG MÍA Saccharum officinarum L. MỞ ĐẦU Mía là cây công nghiệp ngắn ngày quan trọng trong nền kinh tế quốc dân đối với nhiều nước trong khu vực nhiệt đới gió mùa ẩm. Nó khẳng định vị trí của mình bằng việc thỏa mãn nhu cầu cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp đường, phục vụ nhu cầu đường trong nước và đường còn là mặt hàng xuất khẩu quan trọng. Ở nước ta mía là cây trồng cung cấp nguồn nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp đường trong giai đoạn hiện nay cũng như sau này. Ngoài ra các phụ phẩm của ngành công nghiệp đường còn là nguồn nguyên liệu quí báu cho các ngành công nghiệp giấy, bia, rượu, cồn. Khi đời sống nhân dân ngày càng được cải thiện, các ngành sản xuất bánh kẹo, hóa chất ngày càng gia tăng nhu cầu về đường cũng như giấy, bia, cồn cũng tăng lên thì phát triển ngành trồng và chế biến mía không những đáp ứng nhu cầu về nguồn nguyên liệu mà còn góp phần lôi cuốn lực lượng lớn lao động ở khu vực nông thôn tham gia vào các công việc như trồng mía, thu mua nguyên liệu, làm công nhân trong các nhà máy sản xuất giấy, bánh kẹo, bia…Nhất là khi các nhà máy chế biến được đặt tại vùng nguyên liệu thì hiệu quả kinh tế sẽ tăng lên nhiều khi mà chi phí vận chuyển nguyên liệu được giảm xuống ở mức tối đa, giá tiền công công nhân rẻ. Mía là loại cây khỏe, có khả năng thích nghi cao với nhiều loại đất từ loại đất bãi ven sông, cho đến đất pherarít ở vùng đồi thấp cho đến đất phù sa trong đê v.v . Vì vậy nó góp phần khai thác tốt hơn tiềm năng đất đai ở nhiều địa phương nhất là những vùng đồi trọc vốn bị bỏ hoang hoặc trồng các loại cây hiệu quả thấp. Mía được trồng rộng rãi ở nhiều địa phương ở nước ta như các tỉnh đồng bằng sông Hồng, đồng bằng Cửu Long, Thanh Hóa, Nghệ An, Đồng Nai… Tuy nhiên ngành mía đường đang đứng trước khó khăn là các nhà máy hoạt động chưa đủ công suất vì tiếu nguyên liệu. Vì vậy, vấn đề cung ứng giống cho nông dân là rất cần thiết. Để cung cấp một số lượng lớn cây con có phẩm chất tốt thì kỹ thuật nuôi cấy in vitro là một lợi thế lớn. 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO 1.1.1. Sinh sản vô tính 1.1.1.1. Nhân giống theo cấu trúc tự nhiên của thực vật [6] - Dạng căn hành (bull): lá được xắp xếp chồng lên nhau, bên ngoài có lớp lá bảo vệ, lá là nhu mô dự trữ dày và xốp. Dạng căn hành thường được thấy ở họ hoa tulip, họ hành… - Dạng giò (corm): nhu mô dự trữ lớn, dày có cấu tạo giống như căn hành, nằm dưới gốc thân, dạng giò thường được thấy ở hoa gladiolus. - Dạng củ (rhizome): dày có cấu tạo như thân rễ nằm chìm dưới mặt đất, phía trên là vòm tăng trưởng chứa chồi thân dạng này thường được thấy ở họ hoa iris. - Thân bò (stolom): nhánh hay thân mỏng manh, thường là dạng thân bò, chốp ngọn là một cây hoàn chỉnh thấy ở cây dâu tây. Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 2 - Dạng căn hành nhỏ (bulbil): giống như căn hành, tròn nằm ở nách lá thấy ở hoa lily. 1.1.1.2. Nhân giống theo phương thức nông học - Giâm cành - Chiết cành - Ghép hay tháp cành 1.1.2. Nhân giống in vitro Nhân giống in vitro là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm (in vivo). Khác với các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp.[7] 1.1.2.1. Ưu điểm của vi nhân giống - Đưa ra sản phẩm nhanh hơn. - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao. - Sản phẩm cây giống đồng nhất. - Tiết kiệm không gian. - Nâng cao chất lượng cây giống. - Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn. - Lợi thế về vận chuyển. - Sản xuất quanh năm. 1.1.2.2. Hạn chế của vi nhân giống - Hạn chế về chủng loại sản phẩm. - Chi phí sản xuất cao. - Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình. 1.1.2.3. Ứng dụng của vi nhân giống Lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô nuôi cấy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn. Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền. Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền, cúc ), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà phê ), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây ), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa sợi ) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất. Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 3 1.1.3. Cơ sở khoa học 1.1.3.1. Tính toàn năng của tế bào Tế bào thực vật (phân hóa và còn sống) phản phân hóa, phân chia tạo cây trưởng thành bình thường (qua tất cả các giai đoạn phát triển của phôi). Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, ngoài ra chúng còn có khả năng phát triển thành tế bào mô sẹo (callus). Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia liên tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh. => Như vậy mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. [3] Tính toàn năng của tế bào nuôi cấy in vitro biểu hiện qua 3 giai đoạn:[4] - Tế bào phản phân hóa với sự phát sinh tế bào khả biến. - Sự định hướng phân hóa tế bào khả biến. - Sự phát sinh hình thái, phát triển cơ quan. 1.1.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào [5] Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào. Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó các tế bào phôi sinh này tiếp tục biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan khác nhau. Đó là sự phân hóa tế bào. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Khi gặp điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào. Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. 1.1.2.3. Môi trường dinh dưỡng Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường và các muối của các nguyên tố đa lượng (nito, phospho, kali, calxi) và vi lượng (Mg, Fe, Mn, Co,Zn, .). Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B1, B6, B3, .) và các chất điều hoà sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới.[6] Môi trường nuôi cấy về cơ bản có thể chia ra làm 3 loại: - Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi truờng White,Knop và Knudson C, … - Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg … - Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường MS (Murashige-Skoog). Thành phần môi trường dinh dưỡng: bao gồm Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 4 - Nước cất - Nguồn carbon: saccharose và glucose, nhưng saccharose phổ biến hơn (Trần Văn Minh, 2005). - Vitamin: B1 (Thiamin), PP (Acid nicotinamic), B6 (Pirydoxine), H (Biotin), B9 (Acid folic), Panthothenate calcium, B2 (Riboflavin), Mesoinositol. - Đa lượng: N P K Ca Mg S - Vi lượng: Fe Zn B Co N Mn Cu Al Mo I - Các chất điều hòa tăng trưởng  Auxin: 2,4 – D, IAA, IBA, NAA, Picloram  Cytokinin: BAP, IPA, Dihydrozeatin, Kinetin  Gibberellin  Acid abscisic  Ethylen - Các hợp chất không biết rõ thành phần: Nước dừa, nước khoai tây, nước chuối, casein,hydrolysalt, trypton, pepton… 1.1.2.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng Auxin - Kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo và huyền phù tế bào. - Điều hòa sự phát sinh hình thái. - Cảm ứng sự phát sinh phôi soma. - Tác động rõ ràng lên sự kéo dài tế bào. - Thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào. - Kích thích phân bào ở tượng tầng phát sinh gỗ và kết hợp với cytokinin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. - Kích thích phát sinh rễ. - Tạo ưu thế ngọn. - Làm chậm quá trình lão hoá ở lá. - Ức chế hay thúc đẩy (thông qua ethylene) sự rụng lá và trái. - Làm chậm chín. Tuy nhiên, tầm quan trọng của bất kỳ chất điều tiết sinh trưởng nào đều có thể được đánh giá thông qua số các công trình nghiên cứu chúng. Ramakishnan và cs đã sử dụng 2,4-D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo từ mắt lá mầm của cây đậu đen, sau 5 ngày nuôi cấy xuất hiện mô sẹo với tỷ lệ 60,8% [3]. Kaviraj và cs cũng sử dụng 2,4-D để tạo mô sẹo từ lá sơ cấp của đậu xanh và kết quả là khi sử dụng 2,4-D với nồng độ 10mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo là 100%. Ngoài sử dụng 2,4-D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo, Kaviraj và cs sử dụng Auxin được tổng hợp từ các thực vật bậc cao, tảo, nấm, và cả vi khuẩn. Cơ quan tổng hợp auxin trong cây chủ yếu là đỉnh sinh trưởng ngọn, càng xa đỉnh ngọn hàm lượng auxin càng giảm. Ngoài đỉnh ngọn, auxin còn được tổng hợp ở một số cơ quan đang sinh trưởng như lá non, trái non, phôi hạt nhưng rất ít. Sử dụng α – NAA kết hợp với kinetin và BAP để tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh ở đậu xanh …[5]. Cytokinin - Phát sinh phân bào trong nuôi cấy mô (có mặt auxin) - Điều khiển sự phát sinh hình thái. - Phá cỡ trạng thái hưu miên của chồi ngọn. - Kích thích sự hoạt động của chồi bên. - Kích thích sự tăng trưởng chồi bên. Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 5 - Kích thích phát sinh chồi bên trong điều kiện có ưu thế ngọn. - Nở lá. - Làm chậm lão hoá lá. - Tích tụ diệp lục và thúc đẩy chuyển hoá etioplast vào diệp lục. - Ảnh hưởng lên sự tạo phôi soma với auxin. - Cản sự tạo rễ. Trong nuôi cấy chồi, Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. Một tỷ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy. Để tăng sinh chồi bên, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài, hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi có nhiều nước. Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin. Nồng độ cytokinin cao (0,5 - 10 mg/l) thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ (Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964; Ben Jaacov và ctv, 1991; Humphries, 1960; trích dẫn từ Vũ Văn Vụ, 2003). Rất nhiều cytokinin được phát hiện trong những nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy mô, nó kích thích phân hoá cơ quan của những tế bào không phân chia. Ignaccimuthu và cs sử dụng BAP và α – NAA để tạo chồi từ cuống tử điệp của đậu xanh sau 15 ngày nuôi cấy. Chỉ sử dụng BAP, Mai Trường và cs (2001) đã xây dựng được hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ cuống tử điệp…[12]. Giberelin - Nó tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên được, như ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. - Giảm/cản sự tạo chồi, rễ bất định, sự phát sinh phôi soma. - Cản sự tạo chồi trong sự hình thành đỉnh sinh trưởng. - Cảm ứng sự tạo chồi bất định, giúp sự tăng sinh chồi/rễ, kích thích sự tạo chồi từ mô sẹo ở một số loài thực vật xác định. Đại diện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp [13]. Ethylen Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây nhưng gần đây nó mới được coi là một hormone thực vật. Ethylen thường được sử dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào. Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng độ cao sẽ kéo dài khoảng ra rễ của thân…[13]. - Kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo ở một số loài thực vật. - Giúp hình thành củ tử chồi hoa tulip. - Nồng độ thấp giúp sự tạo phôi từ mô sẹo, nồng độ cao ngược lại. - Cảm ứng tạo hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào. Axit absixic Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây ngắn ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein [13]. - Kìm hãm sự tăng trưởng của mô sẹo. - Cản sự tạo chồi bất định. Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 6 - Cảm ứng trạng thái trưởng thành của mô. - Cần cho sự tăng trưởng bình thường của phôi soma. - Kìm hãm sự phát sinh phôi soma trong một số trường hợp. Trong nuôi cấy tuỳ theo cây trồng, bộ phận và kiểu gen nuôi cấy, môi trường và giai đoạn phát triển cụ thể trong quá trình nuôi cấy mà thành phần, chủng loại và nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng có khác nhau. [4] 1.1.2.5. Các chất bổ sung [3] Agar (thạch):Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy. Độ cứng của agar phụ thuộc vào nồng độ agar sử dụng và pH môi trường nuôi cấy. Nồng độ agar thường sử dụng là 5-10 %, nồng độ này cho phép độ ổn định trong môi trường khi nuôi cấy. Than hoạt tính: giúp kích thích sự phát triển của rễ trong nuôi cấy mô, có thể vì do nó hạn chế ánh sáng đi vào môi trường cũng như hấp thụ một số chất có tác dụng ức chế quá trình ra rễ, ngăn cản quá trình hóa nâu mẫu cấy (Nguyễn Văn Kết, 2003). Các hợp chất tự nhiên có thành phần không xác định: như nước dừa, dịch chiết bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy. Miller và Skook (1961) đã cho rằng trong nước dừa có 1,3-diphenylurea là một cytokinin có tác động chủ yếu lên quá trình phân bào của mẫu cấy. Nước dừa thường dùng ở nồng độ 10-15%. Nước dừa chỉ kích thích những tế bào hay mầm còn non chưa trưởng thành và sụ phát triển của phôi. Ngoài ra, nước dừa còn có khả năng giảm bớt sự tiết hợp chất phenol của mẫu cấy (Tanaki và Sakanishi, 1978). 1.1.2.6. pH của môi trường pH của môi trường là yếu tố rất quan trọng. Sự ổn định pH của môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. Giá trị của pH trong môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,5 – 5,8. Theo Nguyễn Như Khanh (1990) khi pH thấp (môi trường acid) sẽ hoạt hóa các enzyme hydrolaza dẫn đến kìm hãm sự sinh trưởng, đồng thời kích thích sự lão hóa tế bào trong mô cấy. Ngoài ra, sự bền vững và hấp thu một loạt các chất phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt NAA, gibberelin và các vitamin rất mẫn cảm với pH. Sự hấp thu sắt cũng phụ thuộc vào pH môi trường. Độ pH ảnh hưởng tới khả năng hòa tan của ion, độ đông tụ của agar, khả năng hấp thụ dinh dưỡng của mẫu cấy, sự tăng trưởng của tế bào. Để điều chỉnh pH, ta sử dụng HCl, NaOH, KOH. Độ pH thay đổi trong suốt quá trình nuôi cấy. 1.1.4. Các phương pháp nhân giống invitro [6] 1.1.4.1.Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 1.1.4.1.1. Đỉnh sinh trưởng Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 7 Hình 1. Đỉnh sinh trưởng Mô phân sinh đỉnh chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng và được bao bọc bởi một lớp vỏ bề mặt có cấu tạo cutin hạn chế thấp nhất quá trình thoát nước và lớp cutin này bao bọc cả chồi đỉnh. Quá trình sinh trưởng của đỉnh sinh trưởng chia làm 3 giai đoạn. Giai đoạn phôi sinh: trong các điểm sinh trưởng xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nó thành các mô riêng biệt.Giai đoạn dài ra do sự sinh trưởng nhanh chóng, mầm cơ quan đạt kích thước tối đa và có hình dạng nhất định. Ở mỗi nách lá đều có chồi nách. Chồi nách thực chất không khác đỉnh sinh trưởng. Do hiện tượng ưu thế ngọn nên các chồi nách không phát triển nhưng khi được đánh thức và bắt đầu sinh trưởng chúng có cấu tạo đầy đủ như thân chính. Mô đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus. Do đó đây là một vật liệu nuôi cây mô tế bào được sử dụng trong tạo giống cây sạch bệnh. Do kích thước quá nhỏ nên kỹ thuật nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng thường được tiến hành dưới kính lúp hay bao gồm cả chồi đỉnh. 1.1.4.1.2. Mẫu mô thực vật dùng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Kết quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phụ thuộc vào vật liệu khởi đầu, nguồn gốc và kích thước của mẫu. Để đạt được hiệu quả cao, cần lấy mẫu nuôi cấy từ chồi đang sinh trưởng mạnh (Gupta và CS, 1981) hoặc chồi của cây mới ghép (Jones và cs, 1985). Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây non dễ dàng hơn cây trưởng thành, tỷ lệ ra rễ trong trường hợp này đạt 83%, trong khi với cây trưởng thành chỉ đạt 63% (Vieitez và cs, 1985). Điều kiện nuôi cấy, thời điểm lấy mẫu cũng ảnh hưởng rất lớn đến kết quả tái sinh cây từ đỉnh sinh trưởng. Một số loài có ưu thế chồi đỉnh mạnh, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ chồi đỉnh dễ dàng hơn từ chồi nách, đối với một số loài khác lại thu được kết quả ngược lại. Kích thước mẫu nuôi cấy càng lớn, tỷ lệ tái sinh và sống sót của mẫu càng cao, tuy nhiên mẫu càng nhỏ thì khả năng sạch bệnh virus lại cao hơn. Do vậy, kích thước mẫu nuôi cấy cần phải xác định bằng thực nghiệm đối với mỗi loài. Mẫu nuôi cấy nhỏ nhất chỉ có chóp sinh trưởng và 2 - 3 mầm lá sẽ là lý tưởng để tạo giống sạch bệnh do mô phân sinh đỉnh nằm ở chóp đỉnh chồi, là trung tâm hoạt động sinh trưởng, phân hoá và phát triển của thực vật. Ngay dưới mô phân sinh này là các mầm lá. Đôi khi kích thước mẫu lớn hơn vẫn đảm bảo sạch bệnh virus (Vine và Jones, 1969) song một số trường hợp khác lại đòi hỏi mẫu nhỏ hơn (Hunter và cs, 1984). Phương thức này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi hay đỉnh sinh trưởng làm mẫu vật nuôi cấy. Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh và các mầm lá non. Khái Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 8 niệm mô phân sinh đỉnh (ngọn) chỉ đúng khi mẫu vật được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1-0,15 mm tính từ chóp sinh trưởng. Trong thực tế mẫu vật được tách với kích thước như vậy chỉ khi nào người ta tiến hành nuôi cấy với mục đích làm sạch virus cho cây trồng. Thường sẽ gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công các mô phân sinh đỉnh riêng rẽ có kích thước nhỏ như vậy. Do đó, trong khuôn khổ nhân giống in vitro người ta thường nuôi cấy cả đỉnh chồi hoặc đỉnh sinh trưởng. Phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, chuối… đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10 mm, nghĩa là toàn bộ mô phân sinh đỉnh và một phần mô xung quanh. Tương quan giữa độ lớn của chồi nuôi cấy, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi được biểu hiện như sau: Nếu độ lớn tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định tăng, nếu độ lớn giảm thì tỷ lệ sống và tính ổn định giảm. Nhưng xét về hiệu quả kinh tế nuôi cấy (thể tích bình nuôi, lượng dung dịch môi trường dinh dưỡng): Nếu độ lớn tăng thì hiệu quả kinh tế giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu quả kinh tế tăng. Do đó, phải kết hợp hài hòa được các yếu tố trên để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu. Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các cây đó có ba khả năng: - Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn). - Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ. - Cây phát triển từ chồi mới phát sinh. 1.1.4.2. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây 1.1.4.2.1. Nuôi cấy chồi bất định Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật. Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển. Các thể phân sinh này rõ ràng có nguồn gốc từ các tế bào đơn. Tuy nhiên, chiều hướng phản ứng của thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ phytohormone. Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình thành callus cơ sở từ các chồi được tách trong nuôi cấy. Các chồi sau đó phát triển từ ngoại vi mô callus và không có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn của mẫu vật. 1.1.4.2.2. Nhân giống thông qua giai đoạn callus Trong nhân giống in vitro nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus. Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất. 1.1.4.3. Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính Phôi vô tính là các cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ các tế bào soma. Chúng rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhưng do không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, và vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền các phôi vô tính có nội dung di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng. Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 9 Ở trường hợp phôi hữu tính, sự kết hợp giao tử đực và cái cho ra hợp tử (zygote). Hợp tử phân chia nhiều lần tạo nên phôi hữu tính có cấu trúc hai cực: rễ và ngọn. Khi hợp tử phát triển, miền sinh trưởng rễ và miền sinh trưởng ngọn cùng phát triển và cuối cùng tạo thành cây hoàn chỉnh, qua các giai đoạn phôi học như sau: - Trường hợp cây hai lá mầm: Dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm - Trường hợp cây một lá mầm: Dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu Ở rất nhiều cây, người ta nhận thấy các tế bào đang phân chia vô tổ chức đã tạo nên callus khi nuôi cấy. Có thể thay đổi hướng phát triển của chúng để tạo ra các phôi vô tính với các bước phát sinh hình thái rất giống với trường hợp phôi hữu tính. Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là phôi hữu tính luôn luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lượng và chất dinh dưỡng phục vụ cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn toàn không có nội nhũ. Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện vật lý, hóa học thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các giống, dòng trong cùng một loài. Tóm lại, có 3 phương thức tạo cây con trong nhân giống in vitro: - Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (Sơ đồ 1). - Mẫu mô phát sinh callus và callus tạo chồi (Sơ đồ 2). - Mẫu mô phát sinh callus, callus phát triển phôi (hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh phôi) và từ phôi thu được cây hoàn chỉnh (Sơ đồ 3). Sơ đồ 1. Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (thông qua phương thức tăng khả năng phát sinh chồi nách) Công nghệ Tế bào 10/06/2011 GVHD: TS. Lê Thị Thủy Tiên 10 Sơ đồ 2. Mẫu mô phát sinh callus, callus tạo chồi và phát triển cây hoàn chỉnh (thông qua phương thức phát sinh chồi bất định) Sơ đồ 3. Mẫu mô phát sinh callus, callus phát sinh phôi soma (hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh phôi soma) và từ phôi thu được cây hoàn chỉnh 1.1.5. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro 1.1.5.1. Quá trình sản xuất cây cấy mô Quá trình vi nhân giống thông thường gồm năm giai đoạn chính, mỗi một giai đoạn có những yêu cầu riêng. Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc - Chọn cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao. - Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non v.v… [...]... nhân chồi sau 4 tuần cấy chuyn Khi bổ sung BA v kinetin với nồng độ 1ppm vo môi trờng nuôi cấy, hệ số nhân chồi khi cấy chuyển ở thời điểm 4 tuần l 4,4 - 4,5 lần với BA v 5,3 - 5,5 lần với kinetin Khi tăng BA v Kinetin lên 1,5 v 2ppm thì hệ số nhân của cả 2 giống đều giảm Tuy nhiên, tốc độ giảm hệ số nhân nhanh hơn khi tăng BA ở nồng độ 2 ppm, hệ số nhân của giống F134 chỉ còn 3,4 (vợt đ/c 0,1) v giống. .. Cú hai tỏc nhõn lm h mu nuụi cy in vitro: + B virus hay th ging nh virus xõm chim, khụng hoi mu nhng cú nh hng v sau lm gim tỏc nhõn gõy nhim s dng mu nuụi cy l nhu mụ phõn sinh nh + B vi sinh vt hy hoi, cú th kh trựng mu trc khi cy vo mụi trng S dng thuc khỏng sinh nhm hn ch s hoi mu ca vi sinh vt nh amphotoricin B, nystelin, kanamicin, vancomicin v penicillin kh c vi khun Gram (-) Gram (+) nm mc S... 35,7 3,0 55,3 6,0 1,5 41,1 3,2 69,3 5,3 88,7 7,5 1,4 39,0 4,6 76,6 6,5 89,0 9,0 2,0 27,6 3,7 53,6 4,2 85,3 Trên giống F134 cũng có kết quả tơng tự nh giống QĐ15 Nồng độ -NAA thích hợp nhất cho quá trình ra rễ của giống mía ny cũng l 0,5ppm Tuy nhiên, tỷ lệ cây ra rễ của giống ny luôn thấp hơn giống QĐ15 ở tất cả các cặp công thức tơng ứng Sau 3 tuần, công thức có tỷ lệ cây ra rễ cao nhất cũng chỉ đạt... cng khp vi nhng phỏt hin trc ú ca Nadar v Heinz (1977) Alam v cs (2003) bỏo cỏo rng phn ng to r tt nht l 2,5 mg/l IBA vi 16 r/chi vi chiu di r 1,1 cm Mamun v cs (2004) thu c kt qu to r tt nht trờn mụi trng MS cú b sung auxin (NAA + IBA) 0,5 mg/l i vi tng cht Chỳng ta cng thy rng 0,5 mg/l NAA v 2,5 mg/l IBA cho phn ng to r tt th hai vi s r 11,3 1,08/chi v chiu di r 3,7 0,47 cm Cỏc cõy con vi chi v... triển của bộ rễ nh giống QĐ15 Theo Kambaska Kumar Behera v Santilata Sahoo Mụi trng to r: cỏc thõn non di khong 5-6 cm ct ra t ng nghim c cho vo mụi trng MS bỏn rn cú b sung nng khỏc nhau ca IBA, NAA v IAA (0,53.0 mg/l) riờng l hoc kt hp Ra r in vitro v lm quen vi khớ hu: Cỏc loi auxin c s dng nng khỏc nhau v kt hp to r bt nh Trong s ú NAA v IBA ỏp ng tng i tt hn so vi IAA cho vic to r S kt hp NAA... sung than hot tớnh hay ngõm mu vi hn hp ascorbic acid v citric acid (25-150 mg/l) 12 Cụng ngh T bo 10/06/2011 GVHD: TS Lờ Th Thy Tiờn 1.1.5.2.2 To th nhõn ging in vitro Mu nuụi cy c cy trờn mụi trng chn lc c bit nhm mc ớch to th nhõn ging in vitro Cú hai th nhõn ging in vitro: th chi (multiple shoot) v th ct (cutting) t ngoi ra cũn cú th giũ (protocorm) To th nhõn ging in vitro da vo c im nhõn ging ngoi... ng ca cỏc vi sinh vt t c tt hn, to iu kin cho cõy mớa hp thu cht dinh dng hiu qu hn Cỏc vựng t trng mớa ca nc ta thng chua nờn cn phi bún thờm vụi - Cỏc cht vi lng: Bao gm cỏc nguyờn t nh magiờ (Mg), st (Fe), mangan (Mn), km (Zn), ng (Cu) tuy cn s lng ớt nhng rt quan trng i vi quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin cng nh cht lng ca cõy mớa t nc ta do trng lõu i li khụng chỳ ý bún b sung cht vi lng nờn... quỏ trỡnh nuụi cy mụ s dn li i v r mi xut hin Cõy con thng c x lý vi cht kớch thớch ra r bng cỏch ngõm hay phun lờn lỏ rỳt ngn thi gian ra r 1.1.5.2.6 Nhõn ging in vitro Cõy con sau khi c chuyn ra lung m hay cy vo bu t sau 7-10 ngy thỡ bt u ra r sau ú c phun dinh dng vi hn hp N,P,K (1g/l cho mi loi) Tuy nhiờn do quỏ trỡnh nhõn ging in vitro cú nhiu tn kộm thỡ cõy con c s dng nh l cõy m v c tip tc nhõn... đ/c 0,1) Trong khi cũng ở nồng độ 2ppm của kinetin, hệ số nhân vẫn vợt đối chứng 0,8 (F134) v 0,9 (QĐ15) Nh vậy, môi trờng nhân nhanh đợc chọn vẫn l MS có 0,5ppm -NAA v 1 ppm BA (hoặc 1 ppm kinetin) 3.4 NH HNG CA CHT IU HềA TNG TRNG V SACCHAROSE N QU TRèNH RA R CA CHI MA TRONG NG NGHIM Theo Nguyn Th Nhn Theo dõi quá trình ra rễ của cây mía in vitro trên môi trờng có bổ sung -NAA với các nồng độ 0ppm... của chồi mía Sau 3 tuần nuôi cấy đã có 100% số chồi ra rễ ở hm lợng saccaroza từ 6% đến 7,5% Tuy nhiên, số rễ trung bình/cây đạt cao hơn ở hm lợng saccaroza 7,5% Khi tăng nồng độ saccaroza lên 9% không chỉ lm giảm số rễ/cây m tỷ lệ cây ra rễ cũng đã giảm chút ít Giống F134 29 Cụng ngh T bo Cụng thc 1(/c) 2 3 4 5 1(/c) 2 3 4 5 10/06/2011 GVHD: TS Lờ Th Thy Tiờn Bảng 3.4 Khả năng ra rễ của giống mía F134 . 1.1.2. Nhân giống in vitro Nhân giống in vitro là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống. thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: