KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY HÚNG CHANH (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.) TRONG ĐIỀU KIỆN VI NHÂN GIỐNG QUANG TỰ DƯỠNG

Mục đích của nghiên cứu là xác định một số ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên tăng trưởng của cây húng chanh nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng.. Nguyễn Thị Quỳnh và ctv 2010 đã nghiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

   

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY HÚNG CHANH

(Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.) TRONG ĐIỀU KIỆN

VI NHÂN GIỐNG QUANG TỰ DƯỠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

   

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY HÚNG CHANH

(Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.) TRONG ĐIỀU

KIỆN VI NHÂN GIỐNG QUANG TỰ DƯỠNG

Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện:

PGS.TS NGUYỄN THỊ QUỲNH PHẠM THÀNH THÁI

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

PGS TS Nguyễn Thị Quỳnh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài này Cô đã truyền đạt những kiến thức và nhiều kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

Anh Nguyễn Như Hiến, chị Hoàng Ngọc Nhung, chị Trịnh Thị Thanh Vân đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Bạn Phạm Minh Duy cùng làm chung nhóm đề tài tốt nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Các bạn và anh chị làm cùng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật đã hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp

Các thầy cô, cán bộ thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và phòng Thí nghiệm Trọng điểm, Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài này

Quý thầy cô trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy

em trong suốt quá trình học tập tại trường Thầy cô đã dạy cho em nhiều kiến thức bổ ích

Tập thể các bạn sinh viên lớp DH06SH đã cùng chia sẻ niềm vui và nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học cũng như trong lúc thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cha mẹ và những người thân trong gia đình đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con được học hành Cha mẹ đã luôn quan tâm, bên cạnh con và là chỗ dựa vững chắc cho con trong cuộc sống

Biên Hòa, ngày 13 tháng 7 năm 2010

Phạm Thành Thái

TÓM TẮT

Cây húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.) là một cây thuốc

được sử dụng nhiều trong dân gian Cây húng chanh thường được nhân giống bằng giâm cành nhưng phương pháp này không cung cấp được số lượng lớn cây con đồng nhất và có chất lượng cao Nuôi cấy mô quang tự dưỡng là phương pháp nhân giống đang được quan tâm vì những ưu điểm của nó Mục đích của nghiên cứu là xác định một số ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên tăng trưởng của cây húng chanh nuôi

cấy in vitro quang tự dưỡng

Đốt thân cây húng chanh gồm hai lá mở và có khối lượng tươi ban đầu là 200 ±

20 mg được dùng làm mẫu Đốt thân được cấy vào hộp Magenta chứa 65 ml môi trường MS 1/2 không đường, không vitamin và giá thể là perlite Thí nghiệm gồm hai mức thay đổi của cường độ ánh sáng (120 hoặc 170 μmol m-2 s-1) và ba mức thay đổi thời gian chiếu sáng (8, 12 hoặc 16 giờ/ngày) được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ phòng 24 ± 2°C, độ ẩm là 45 ± 5% Sau 45 ngày nuôi cấy sẽ khảo sát các chỉ tiêu về tăng trưởng Kết quả cho thấy sự gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô,.v.v đều gia tăng một cách có ý nghĩa khi tăng cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng

Đốt thân cây húng chanh gồm hai lá mở và có khối lượng tươi ban đầu là 300 ±

50 mg được dùng làm mẫu Đốt thân được cấy vào hệ thống nuôi cấy bơm khí trực tiếp là hộp polycarbonate có thể tích 17 L và hệ thống nuôi cấy trao đổi khí tự nhiên là hộp Magenta có thể tích là 370 ml Sử dụng môi trường MS 1/2 không bổ sung đường

và vitamin với giá thể là perlite Thí nghiệm gồm hai mức thay đổi nồng độ khí CO2(400 hoặc 1200 ppm) được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ phòng là 24 ± 2°C, độ

ẩm là 50 ± 5% với cường độ ánh sáng là 250 μmol m-2 s-1 và thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày Sau 45 ngày nuôi cấy sẽ khảo sát các chỉ tiêu về tăng trưởng Kết quả cho thấy cây tăng trưởng mạnh trong hệ thống bơm khí trực tiếp có tăng cường CO2

Từ khóa: bơm khí trực tiếp, CO2, cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, trao đổi khí

tự nhiên, vi nhân giống quang tự dưỡng

The country borage (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.) is a herb which

is used widely in folk The country borage are usually propagated by stem cuttings, but this method does not provide a large number of semilar and high quality seedlings Photoautotrophic micropropagation is being interested in plant propagation because of  

its advantages The purpose of this study is to determine the influence of some environmental conditions on the growth of country borage

Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng stem with two leaves and 200 ± 20 mg

of weight was cultured in vitro for 45 days on MS 1/2 sugar-free medium with different light intensities (120 or 170 μmol m-2 s-1) and photoperiod (8, 12 or 16 hour per day) At the end of a 45-day-culture period, fresh weight, dry weight of plantlets noticeably increased in the hight light intensities (170 μmol m-2 s-1) and longest photoperiod (16 hour per day)

Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng stem with two leaves and 300 ± 50 mg

of weight was cultured in vitro for 45 days on MS 1/2 sugar-free medium with two type of vessel [natural ventilation (370 ml) or forced ventilation (17 L)] under CO2enriched (1200 ppm) or CO2 non-enriched (400 ppm) At the end of a 45-day-culture period, fresh weight, dry weight of plantlets were highest in the force ventilation with

CO2 enrichment

Keywords: CO2, forced ventilation, light intensities, natural ventilation, photoautotrophic micropropagation, photoperiod

MỤC LỤC

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các bảng xi

Danh sách các hình xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về cây húng chanh 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Sự phân bố 3

2.1.3 Hình thái 4

2.1.3.1 Đặc điểm bên ngoài 4

2.1.3.2 Đặc điểm giải phẫu 5

2.1.4 Đặc điểm sinh thái 5

2.1.5 Tinh dầu 6

2.1.6 Ứng dụng của cây húng chanh 7

2.1.7 Các phương pháp nhân giống cây húng chanh 9

2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

2.2.1 Sơ lược lịch sử phát triển của phương pháp nuôi cấy mô 10

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật 11

2.2.3 Phương pháp vi nhân giống truyền thống 12

2.2.3.1 Các giai đoạn trong vi nhân giống truyền thống 13

2.2.3.2 Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô truyền thống 13

2.2.4 Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng 14

2.2.4.1 Sơ lược về phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng 14

2.2.4.2 Các phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng 15

2.2.4.3 Các giai đoạn trong vi nhân giống quang tự dưỡng 18

2.2.4.4 Ưu và nhược điểm của nuôi cấy mô quang tự dưỡng 19

2.2.5 Tính chất của môi trường nuôi cấy in vitro 20

2.2.5.1 Nồng độ đường 20

2.2.5.2 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 20

2.2.5.3 Giá thể 21

2.2.5.4 Ánh sáng 21

2.2.5.5 Nồng độ CO2 21

2.2.5.6 Nhiệt độ 22

2.2.5.7 Độ ẩm tương đối 22

2.2.5.8 Khí ethylen 23

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

3.2 Vật liệu 24

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 24

3.2.1.1 Thiết bị 24

3.2.1.2 Dụng cụ 25

3.2.2 Giá thể sử dụng trong thí nghiệm 26

3.2.3 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 26

3.2.4 Môi trường nuôi cấy 26

3.2.5 Mẫu cấy thí nghiệm 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 Thí nghiệm 1 27

3.3.1.1 Mục tiêu thí nghiệm 27

3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm 27

3.3.1.3 Vật liệu 28

3.3.1.4 Phương pháp thí nghiệm 28

3.3.1.5 Điều kiện thí nghiệm 28

3.3.1.6 Chỉ tiêu theo dõi ở ngày thứ 45 29

3.3.2 Thí nghiệm 2 29

3.3.2.1 Mục tiêu thí nghiệm 29

3.3.2.2 Bố trí thí nghiệm 29

3.3.2.3 Vật liệu 30

3.3.2.4 Phương pháp thí nghiệm 31

3.3.2.5 Điều kiện thí nghiệm 31

3.3.2.6 Chỉ tiêu theo dõi ở ngày thứ 45 32

3.4 Phương pháp thu thập và tính toán số liệu 32

3.4.1 Gia tăng trọng lượng tươi 32

3.4.2 Gia tăng trọng lượng khô 32

3.4.3 Tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/rễ 33

3.4.4 Tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/rễ 33

3.4.5 Phần trăm chất khô (%CK) 33

3.4.6 Số chồi/cây 33

3.4.7 Số lá mở/cây 33

3.4.8 Chiều cao cây 33

3.4.9 Chiều dài rễ 33

3.4.10 Đường kính thân 33

3.4.11 Diện tích lá 33

3.4.12 Xác định hàm lượng chlorophyll theo phương pháp Arnon, 1949 33

3.4.13 Hiệu suất quang hợp thuần Pn 34

3.4.14 Tỷ lệ mất nước ở ngày thứ 45 35

3.5 Phân tích thống kê 35

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1.1 Thí nghiệm 1 36

4.1.1.1 Gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô 36

4.1.1.2 Tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/rễ 38

4.1.1.3 Tỷ lệ trọng lượng khô thân lá/rễ 38

4.1.1.4 % chất khô 39

4.1.1.5 Chiều cao cây 39

4.1.1.6 Chiều dài rễ 39

4.1.1.7 Đường kính thân 40

4.1.1.8 Số chồi/cây 40

4.1.1.9 Số lá mở/cây 40

4.1.1.10 Diện tích lá 40

4.1.1.11 Hàm lượng chlorophyll (chlo) a, b và a + b 41

4.1.1.12 Tỷ lệ chlorophyll a/b (chlo a/b) 43

4.1.1.13 Hiệu suất quang hợp thuần (Pn) 43

4.1.2 Thí nghiệm 2 45

4.1.2.1 Gia tăng trọng lượng tươi 45

4.1.2.2 Gia tăng trọng lượng khô 49

4.1.2.3 Tỷ lệ trọng lượng tươi thân lá/rễ và tỷ lệ trọng lượng khô thân lá/rễ 49 4.1.2.4 % chất khô 50

4.1.2.5 Chiều cao cây, chiều dài rễ và đường kính thân 50

4.1.2.6 Số chồi/cây 51

4.1.2.7 Số lá mở/cây và diện tích lá 51

4.1.2.8 Hàm lượng chlorophyll a, b và a + b, tỷ lệ chlorophyll a/b 52

4.1.2.9 Phần trăm mất nước 53

4.1.2.10 Hiệu suất quang hợp thuần (Pn) 54

4.2 Thảo luận 58

4.2.1 Thí nghiệm 1 58

4.1.2 Thí nghiệm 2 60

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 68

GTTLT Gia tăng trọng lượng tươi

MS Murashige và Skoog (1962) NĐCO2 Nồng độ khí CO2

TĐKTN Trao đổi khí tự nhiên

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm 1 27

Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm 2 29

Bảng 3.3 Thời gian tăng ánh sáng và nồng độ khí CO2 31

Bảng 4.1 Tác động của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng 37

Bảng 4.2 Tác động của hệ thống nuôi cấy và nồng độ khí CO2 46

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình

Hình 2.1 Cây húng chanh ngoài tự nhiên 4

Hình 2.2 Hình giải phẫu đốt thân, cuống lá và lá của cây húng chanh 5

Hình 2.3 Công thức hóa học của Carvacrol và Thymol 7

Hình 2.4 Một số ứng dụng của cây húng chanh 9

Hình 2.5 Các loại bình nuôi cấy trong phương pháp trao đổi khí tự nhiên 16

Hình 2.6 Hệ thống nuôi cấy bơm khí trực tiếp hộp 17 L 17

Hình 2.7 Các giai đoạn nuôi cấy 19

Hình 3.1 Sơ đồ cơ bản của hệ thống bơm khí trực tiếp 25

Hình 3.2 Đốt thân hai lá mở của cây húng chanh 27

Hình 4.1 Giàn để cây ở ngày thứ 45 44

Hình 4.2 Cây húng chanh trong hộp Magenta ở ngày nuôi cấy thứ 45 44

Hình 4.3 Cây húng chanh ở ngày nuôi cấy thứ 45 45

Hình 4.4 Cây húng chanh đặt trong tủ Percival ở ngày nuôi cấy thứ 45 55

Hình 4.5 Cây húng chanh trong hộp Magenta trao đổi khí tự nhiên 56

Hình 4.6 Cây húng chanh trong hệ thống bơm khí trực tiếp 56

Hình 4.7 Cây húng chanh ở ngày nuôi cấy thứ 45 57

Biểu đồ Biểu đồ 4.1 Gia tăng trọng lượng tươi của cây húng chanh 36

Biểu đồ 4.2 Gia tăng trọng lượng khô của cây húng chanh 38

Biểu đồ 4.3 Chiều cao của cây húng chanh 39

Biểu đồ 4.4 Diện tích lá của cây húng chanh 41

Biểu đồ 4.5 Hàm lượng chlorophyll a và chlorophyll b 42

Biểu đồ 4.6 Hàm lượng chorophyll a + b 42

Biểu đồ 4.7 Hiệu suất quang hợp thuần ở ngày nuôi cấy thứ 18, 38 và 44 43

Biểu đồ 4.8 Gia tăng trọng lượng tươi của cây húng chanh 47

Biểu đồ 4.9 Sự biến thiên gia tăng trọng lượng tươi của cây húng chanh 48

Biểu đồ 4.10 Gia tăng trọng lượng khô của cây húng chanh 49

Biểu đồ 4.11 Chiều cao cây của cây húng chanh 50

Biểu đồ 4.12 Chiều dài rễ của cây húng chanh 51

Biểu đồ 4.13 Hàm lượng chlorophyll a và hàm lượng chlorophyll b 52

Biểu đồ 4.14 Hàm lượng chlorophyll a + b 52

Biểu đồ 4.15 Phần trăm mất nước của cây sau 30, 60, 90 và 120 phút 53

Biểu đồ 4.16 Số lần trao đổi khí của hai hệ thống nuôi cấy 54

Biểu đồ 4.17 Hiệu suất quang hợp thuần của cây húng chanh 55

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây với sự tiến bộ của công nghệ sinh học nói chung và trong kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật nói riêng đã góp phần giải quyết vấn đề lương thực, thực phẩm, cung cấp cây giống sạch bệnh

Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy mô truyền thống hiện nay vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi do kỹ thuật này vẫn còn nhiều nhược điểm như: tỷ lệ nhiễm cao, tỷ lệ cây sống thấp khi ra vườn ươm, sự bất thường trong sinh lý,.v.v Nhằm khắc phục những nhược điểm đó nên vào thập niên 80, Giáo sư Toyoki Kozai và các cộng sự thuộc trường Đại học Chiba, Nhật Bản đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô quang tự dưỡng Cây húng chanh là cây thuốc dân gian, hiện diện rộng rãi ở Việt Nam Đã có những sản phẩm thương mại sử dụng làm thuốc với thành phần chính là tinh dầu húng chanh và nhiều nghiên cứu về tác dụng chữa bệnh của tinh dầu húng chanh Cây húng chanh có thể được nhân giống bằng cách giâm cành nhưng dễ bị thoái hóa giống do sâu bệnh Đồng thời cây húng chanh trồng ngoài tự nhiên có thể bị nhiễm nấm, khuẩn nên không thực sự là nguồn nguyên liệu tốt trong sản suất thuốc Chính vì thế cần áp dụng phương pháp nuôi cấy mô vào việc nhân giống cây húng chanh sạch bệnh và có hàm lượng tinh dầu cao Nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào thực vật trên cây húng chanh chưa có nhiều công bố trên thế giới cũng như ở Việt Nam Nguyễn Thị Quỳnh

và ctv (2010) đã nghiên cứu về ảnh hưởng của sự trao đổi khí tự nhiên ở bình nuôi cấy,

nồng độ đường lên sự tăng trưởng của cây húng chanh in vitro, và đã chứng minh cây

húng chanh đã tăng trưởng tốt trong môi trường không đường và không vitamin khi được nuôi cấy trong bao nylon có gắn màng trao đổi khí bằng giấy lọc

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát sự tăng trưởng của cây húng chanh trong điều kiện vi nhân giống quang tự dưỡng” nhằm tìm ra một số điều kiện tối ưu để gia tăng sự tăng trưởng của cây húng chanh

1.2 Yêu cầu của đề tài

Tiến hành thí nghiệm một cách khoa học có sự lặp lại và phân tích thống kê để đánh giá kết quả

1.3 Nội dung thực hiện

Xác định được điều kiện về thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng tối ưu cho sự tăng trưởng của cây húng chanh trong vi nhân giống quang tự dưỡng

Đồng thời, so sánh sự tăng trưởng của cây húng chanh trong hai hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng (trao đổi khí tự nhiên và bơm khí trực tiếp) trong điều kiện có hoặc không tăng cường CO2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây húng chanh

Họ (Family): Lamiaceae (hoa môi)

Chi (Genus): Plectranthus

Loài (Species): Plectranthus amboinicus

Tên la tinh: Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng., Plectranthus aromaticus Roxb., Coleus amboinicus Lour., Coleus aromaticus Benth

Tên Việt Nam: Húng chanh, rau tần dầy lá, rau thơm lông, dương tử tô

Tên tiếng Anh: Country borage, Indian borage, Indian mint, Puerto Rico oregano, thyme [Country borage là tên gọi những cây thuộc họ bạc hà ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới (Morton, 1992) Morton (1992) đã đưa ra danh sách gồm những tên bản xứ và tên tiếng Anh (được sử dụng ở những nước không dùng tiếng Anh là ngôn ngữ chính), như: bread-and-butter plant, Cuban oregano, East Indian thyme, French thyme, Indian borage, Mexican thyme, sage, Spanish thyme, wild thyme, v.v Việc sử dụng nhiều tên tiếng Anh đã làm nhầm lẫn với những cây thảo dược khác có cùng tên thông thường.]

Tên tiếng Pháp: Coliole aromatique, Aromate des Javanais (m) (là tên Pháp được sử dụng ở New Caledonia), oreille (ở Haiti), plectranthre (tên của nhóm Plectranthus)

2.1.2 Sự phân bố

Theo Codd (1975), xuất sứ của Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng là ở

Châu Phi, từ nam Kenya đến Angola và Natal

Morton (1992) cho rằng Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng có xuất sứ ở

Moluccas (Spice Islands) của Malaysia

Hiện nay cây húng chanh có mặt ở Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ Ở Nam Phi loài này xuất hiện trên đá, thân cây ngã, đất giàu mùn, và ở rìa của các sa mạc cát gần biển (Codd, 1975) Tại Việt Nam, cây húng chanh thường được trồng ở đồng bằng, trung du nhất là ở vùng Nam Bộ Được thu hái quanh năm, có thể dùng tươi hoặc phơi khô

2.1.3 Hình thái

2.1.3.1 Đặc điểm bên ngoài

Cây húng chanh là cây thân thảo, gốc hóa gỗ, có chiều cao từ 25 đến 75 cm Thân cây húng chanh mọc đứng, có lông Lá có cuống, mọc đối, rộng, hình bầu dục, dày, trông như mọng nước Phiến lá dài 7 – 10 cm, rộng 4 – 6 cm, bìa lá khía tai bèo, mặt trên có lông đơn, đầu lông tiết mang hạch, trong, bóng ; mặt dưới lá nhiều lông bài tiết hơn, gân nổi rõ Hoa màu tía, nhỏ, mọc thành hoa tự, tận cùng đài hoa gồm các vòng hoa mọc sít nhau gồm 20 – 30 hoa (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Hình 2.1 Cây húng chanh ngoài tự nhiên

2.1.3.2 Đặc điểm giải phẫu

Thân: Vi phẫu hình chữ nhật hay vuông, góc hơi tròn Biểu bì là một lớp tế bào hình chữ nhật hay đa giác có 5 hoặc 6 cạnh khá đều nhau, cutin mỏng Lỗ khí nằm ngang hay nhô cao hơn lớp biểu bì Lông che chở đa bào một dãy rất nhiều, từ 3 – 9 tế bào Lông tiết nhiều, đầu tròn hoặc bầu dục chứa nhiều chất tiết màu vàng xanh Cuống lá: Tế bào biểu bì dẹt và nhỏ, cutin mỏng Lỗ khí, lông tiết và lông che chở giống như thân

Lá: Gân giữa lồi ở mặt dưới Biểu bì trên và dưới có lông che chở đa bào và lông tiết, cutin mỏng

Hình 2.2 Hình giải phẫu đốt thân (a), cuống lá (b) và lá (c) của cây húng chanh

(Nguồn: www.uphcm.edu.vn)

2.1.4 Đặc điểm sinh thái

Cây húng chanh ưa đất khô (Morton, 1992), và sinh trưởng tốt nhất ở đất mùn khô Hơi ẩm quá mức cho phép ở vùng rễ sẽ làm cây bị thối rữa Khoảng pH tốt nhất

là ở 5,8-6,8 (Duke và Hurst, 1975), với giới hạn là ở pH từ 5,0 đến 8,7 (Duke, 1979) Cây húng chanh có thể phát triển ở khoảng nhiệt độ từ 10 đến 32°C Cây cần ít nhất 4 tháng ở nhiệt độ cao, và cây phát triển yếu ớt khi trồng ngoài vườn ở Canada và Bắc Mỹ Cây húng chanh cần được trồng trong nhà, sau đó chuyển ra vườn trong mùa

hè Vị trí trồng cây húng chanh tốt là ở nơi có ánh sáng đầy đủ (Adams, 1987) Sản lượng mùa vụ sẽ tăng lên khi cây húng chanh được trồng ở nơi có bóng râm tại các khu vườn dừa ở Kerala, India Cây thích thoát nước tốt, và có xu hướng thích nghi với môi trường khô Sự ra hoa ở cây húng chanh phụ thuộc vào nơi chúng được trồng Cây

nở hoa vào mùa xuân (tháng tư và năm) ở Tây Ấn Độ và bang Florida, Mỹ; nhưng từ tháng 5 đến tháng 10 ở Sir Lanka (Morton, 1992) Cây húng chanh hiếm khi ra hoa ở Java (Ochse và van den Brink, 1980) hay ở Ấn Độ (Morton, 1992) Cho dù vậy, ở

miền Nam Ấn Độ, sự ra hoa đã được ghi nhận từ tháng 12 năm trước đến tháng 3 năm sau

2.1.5 Tinh dầu

Lượng tinh dầu trong cây khoảng 0,055% theo Morton (1992); và từ 0,1 đến 0,2% trên trọng lượng tươi của lá, hoặc 0,01 – 0,02% ở thân Hương thơm ở lá là do trong tinh dầu có chứa carvacrol (chiếm khoảng 60%) và caryophyllene (từ 3 – 20%) (Bos và ctv, 1983 ; Tucker và Maciarello, 1987 ; Kuebel và Tucker, 1988) Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy sự khác nhau về thành phần tinh dầu của cây húng chanh Baslas và Kumar (1981) nhận thấy rằng trong tinh dầu húng chanh gồm thymol (41%) và carvacrol (13%) Malik và ctv (1985): β-selinene (17%), limonene (10%), thymol (8%), carvacrol (40%) và eugenol (7%) Nguyễn Xuân Dũng và Đỗ Tất Lợi (1991) cho thấy carvacrol (40%), caryophyllene (6%) và α-terpinene (17%) Singh và ctv (2002) đã khảo sát thành phần tinh dầu trong lá cây húng chanh Ấn Độ bằng phương pháp GC và GC-MS cho thấy sự hiện diện của thymol (94,3%), carvacrol

(1,2%), 1,8-cineole (0,8%), p-cymene (0,3%), spathulenol (0,2%) và terpinen-4-ol

(0,2%) chiếm khoảng 97% trọng lượng tinh dầu

Nguyên nhân của sự khác biệt về thành phần hóa học của tinh dầu húng chanh

có thể là kết quả của di truyền, môi trường sống, quá trình phát triển hay là do một số nguyên nhân khác (Singh và ctv, 2002)

Ngoài tinh dầu ra thì trong cây húng chanh còn có khoảng 140 loại diterpenoids được phân lập từ lá và các phenolic Tuy nhiên các nghiên cứu về các chất được tổng hợp trên cây húng chanh còn rất ít ỏi (Abdel-Mogib, 2002)

Carvacrol còn gọi là cymophenol, C6H3CH3(OH)(C3H7), là một monoterpenoid phenol Ít tan trong nước nhưng tan nhiều trong các dung môi hữu cơ như ethanol, diethyl ether, carbon tetrachloride và acetone Carvacrol có thể ức chế nhiều loại vi

khuẩn nguy hiểm như : E coli O157 : H7 (Kiskó và Roller, 2005), Shigella spp

(Bagamboula, 2002)

Hình 2.3 Công thức hóa học của Carvacrol (hình trái) và Thymol (hình phải)

Thymol hay 2-isopropyl-5-methylphenol (C10H14OH), là một monoterpene phenol dẫn xuất của cymene Thymol ít tan trong nước nhưng tan mạnh trong ethanol

và các dung môi hữu cơ khác Thymol cũng có hoạt tính sinh học như carvacrol là ức chế vi khuẩn

Khi phân tích bằng máy sắc ký khí, Vera (1993) đã cho thấy trong thành phần tinh dầu của cây húng chanh ngoài hai chất cơ bản là carvacrol và thymol còn bao gồm các chất sau: α-pinene, camphene, 1-octen-3-ol, β-pinene, myrcene, α-phellandrene, Δ-

3-carene, terpinene, p-cymene, limonene, (Z)-β-ocimene, (E)-β-ocimene,

phelandrène, γ-terpinene, terpinolene, linalool, camphor, 1-terpinen-4-ol, terpineol, α-cubebene, β-cubebene, β-elemene, β-caryophyllene, α-bergamotene, (Z)- β-farnesene, α-humulene, β-guaiene, (-)-α-selinene, β-bisabolene, δ-cadinene, caryophyllene oxide, δ-cadinol, α-cadinol, farnesol, calamenol và (-)-4β-7β-aromadendrandiol

α-2.1.6 Ứng dụng của cây húng chanh

Nhiều loài húng chanh được trồng với mục đính trang trí như ở tại Saudi Arabia Cũng tại đây, lá cây được sử dụng để sát trùng vết thương (Abulfatih, 1987) (hình 2.)

Tại Châu Phi, lá cây húng chanh được dùng để giảm đau Ở Đông Phi lá cây còn được sử dụng như thuốc trừ sâu (Kokwaro, 1976) Tại Đông và Nam Phi cây húng chanh được dùng để trừ giun, sán (Lukhoba, 2005)

Cây húng chanh ở tại Asian được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau từ ho, đau dạ dày đau tim đến trị cảm sốt, đau đầu và cả vết thương gây ra bởi rết hay bọ cạp

(Burkill, 1935).Tại khu vực Trung Mỹ như Cuba và Jamaica thì cây húng chanh được dùng để trị ho, tại Venezuela thì được dùng như thuốc tiêu và để trị bệnh về thận Duke (1977) đã cho rằng trong cây húng chanh có mang calcium, iron, vitamin

A và C với hàm lượng cao Sau đó, Morton (1992) đã chứng minh bằng cách phân tích hàm lượng dinh dưỡng từ lá cây húng chanh

Tại Brazil, cây húng chanh được dùng để chữa trị các vết loét trên da gây ra bởi

Leishmania braziliensis (Franca và ctv, 1996)

Ngoài các công dụng của cây húng chanh được sử dụng trong y học cổ truyền thì hiện nay đã có những nghiên cứu bước đầu để ứng dụng cây húng chanh trong điều trị bệnh một cách khoa học

Candrappa (2009) đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết từ lá cây húng chanh trên những con con chuột bị tiểu đường

Tính chất kháng khuẩn ở cây húng chanh đã được chứng minh qua nhiều

nghiên cứu như của Gurgel (2009) cho thấy tác dụng ức chế Staphylococcus aureus

Khả năng chống oxi hóa của tinh dầu đã được ghi nhận bởi Albuquerque (2006)

Henderson (2005) đã ghi nhận có sự giảm cân ở những phụ nữ thừa cân nhẹ khi trong khẩu phần ăn hằng ngày của họ có bổ sung thêm cây húng chanh

Một số sản phẩm thương mại trên thị trường Việt Nam với thành phần chính là tinh dầu của cây húng chanh (hình 2.4):

Thực phẩm chức năng Saborkids: tăng cường khả năng miễn dịch đối với các bệnh viêm đường hô hấp ở trẻ nhỏ

Tragutan: Sát trùng đường hô hấp Trị các chứng ho khan, ho kèm theo cảm cúm, làm hạ sốt

Codatux Syrup: Giúp giảm ho (ho khan, ho gió, ho có đàm) và khò khè trong các trường hợp bị ho do cảm mạo, viêm họng, dị ứng với thời tiết

Hình 2.4 Một số ứng dụng của cây húng chanh a, b, c: Cây húng chanh được sử dụng

làm cây cảnh (nguồn: flickr.com); d : Sản phẩm Tragutan (nguồn: ft-pharma.com) ; e: Sản phẩm Codatux Syrup (nguồn: thuocbietduoc.com.vn) ; f : Sản phẩm Sarbokids (nguồn: pharmark.com.vn)

2.1.7 Các phương pháp nhân giống cây húng chanh

Cây húng chang được nhân giống bằng gieo hạt hoặc cắt đốt (Adams, 1987) Sự nảy mầm mất 6 tuần (Adams, 1987) Theo Morton (1992) thì cây húng chanh phát triển chủ yếu từ cắt đốt, hiếm khi từ hạt Cây húng chanh rất dễ nhân giống thông qua đoạn non, dễ hơn là sử dụng những đoạn đã hóa gỗ (già)

Cây húng chanh được nhân giống dễ dàng bằng phương pháp cắt đốt Một đốt thân dài 7,5 – 10 cm, loại bỏ chồi ngủ và các lá thấp Sau đó giâm vào trong đất sạch hoặc đất gồm 50% than bùn và 50% perlite Giữ ẩm và đặt cây trong bóng râm, rễ sẽ hình thành sau 7 đến 14 ngày ở trên vết cắt (Staples và Kristiansen, 1999)

Bởi vì cây húng chanh thường hiếm khi ra hoa nên phương pháp nhân giống bằng cách gieo hạt ít được sử dụng (Staples và Kristiansen, 1999) Nên trong thực tế thì cây húng chanh chủ yếu nhân giống bằng phương pháp cắt đốt Tuy nhiên phương pháp cắt đốt lại có nhược điểm là làm cây bị thoái hóa sau một thời gian dài, đồng thời

cây giống dễ bị nhiễm bệnh gây ảnh hưởng đến chất lượng mùa vụ Mặt khác, tinh dầu của cây húng chanh cũng đã được sử dụng trong điều chế dược phẩm sử dụng cho người do đó cây con phải được cung cấp với số lượng lớn và phải đảm bảo sạch bệnh Chính vì thế sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống cây húng chanh là một trong những biện pháp tối ưu nhất

Hiện nay chỉ có một vài tài liệu nghiên cứu về nuôi cấy mô cây húng chanh Bauer và ctv (2002) đã nuôi cấy chồi cây húng chanh trong bình Erlenmeyer 300 mL chứa 50 mL môi trường MS nguyên bổ sung 3% sucrose và 0,8% agar nhằm mục đích nghiên cứu chuyển gene ở cây húng chanh Roja và cộng sự (2005) đã tiến hành nuôi cấy mô cây húng chanh Ấn Độ nhằm nghiên cứu sự phát sinh hình thái của các mẫu thân, lá và chồi ngủ dưới tác động của các loại chất điều hòa tăng trưởng thực vật Tại Việt Nam, Nguyễn Thị Quỳnh và ctv (2010a) đã bước đầu nghiên cứu nhân giống

thành công cây húng chanh in vitro quang tự dưỡng bằng việc sử dụng các bao nylon

có gắn màng trao đổi khí bằng giấy lọc

2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Sơ lược lịch sử phát triển của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Gottlied Haberlandt (1902), nhà thực vật học người Đức, đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào Tuy nhiên những thí nghiệm của ông đối với các tế bào mô mềm, biểu bì đã bị thất bại, do chúng không thể phân chia được

Năm 1922, Kotte và Robbins đã lặp lại các thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ cây ngô Hai tác giả đã nuôi được đỉnh sinh trưởng trong thời gian ngắn trên môi trường lỏng có chứa đường glucose, muối khoáng và thu được

hệ rễ nhỏ

Năm 1934, White đã duy trì được sinh trưởng của đầu rễ cà chua trong thời gian khá dài trên môi trường lỏng có chứa đường, muối khoáng và dịch chiết nấm men Cùng thời gian, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hoocmon thực vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào

Năm 1941, Van Overbeck đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cà rốt Trong thời gian này, nhiều chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin được

nghiên cứu và tổng hợp thành công: acid naphathalen acetic (NAA), acid Dichlorophenoxy acetic (2,4-D)

Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch virus của giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Năm 1954, Miller và cs phát hiện ra kinetin trong chế phẩm thủy phân của tinh dịch cá bẹ có tác dụng kích thích sự phân bào

Năm 1957, Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong nuôi cấy mô cây thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ của auxin : cytokinin

Năm 1960, Morel lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để nhân nhanh phong lan, mở đầu cho công nghiệp vi nhân giống thực vật

Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi trường MS Đây là môi trường được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn được sử dụng rộng rãi cho đến nay

Năm 1964, Guha và Maheshwari thành công trong việc tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura

Những năm sau này các nghiên cứu đều được thực hiện nhằm hoàn thiện thêm cho phương pháp nuôi cấy mô thực vật, nổi bật là phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng được giáo sư Kozai và ctv phát triển vào cuối thập niên 80 với những ưu điểm vượt trội so với nuôi cấy mô truyền thống Song song đó là việc ứng dụng nuôi cấy mô trong vi nhân giống, sản xuất sinh khối thực vật như: Noguchi (1977) đã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20.000 L; Flores và Filner (1985) lần đầu tiên sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy rễ tơ ở Hyoscyamus muticus, những rễ này cho nhiều chất hyoscyamine hơn ở cây tự nhiên Ngoài ra còn có các nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng và tính đến cuối năm 2009 cây trồng chuyển gen chiếm 134 triệu ha, tương đương 9% tổng diện tích đất nông nghiệp trên thế giới Nhưng mức độ thành công trong chuyển gen vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy

và tái sinh tế bào thành cây in vitro

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các

bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng

Phân loại các phương pháp nhân giống in vitro dựa trên đối tượng nuôi cấy:

Nuôi cấy từ cấu trúc có tổ chức:

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy chồi bất định Nuôi cấy phôi

Nuôi cấy từ cấu trúc không tổ chức:

Nuôi cấy mô sẹo Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào

Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

2.2.3 Phương pháp vi nhân giống truyền thống

Trong vi nhân giống truyền thống gồm có hai phương pháp là: dị dưỡng và quang dị dưỡng

Dị dưỡng là phương pháp nuôi cấy mà nguồn carbon hữu cơ (đường, vitamin, v.v) của môi trường nuôi cấy là nguồn năng lượng duy nhất cho sự phát triển của mẫu cấy Trong phương pháp nuôi cấy này bộ máy quang hợp của mẫu cấy không hoạt động vì mẫu cấy thường không mang diệp lục tố và việc nuôi cấy không cần ánh sáng (Kozai và Kubota, 2005)

Quang dị dưỡng là phương pháp nuôi cấy mà mẫu cấy tăng trưởng dựa trên việc

sử dụng cả hai nguồn carbon: vô cơ (CO2 trong bình nuôi được mẫu cấy sử dụng trong quá trình quang hợp) và hữu cơ (đường, vitamin, v.v., được hấp thu trực tiếp từ môi trường nuôi cấy) làm nguồn năng lượng chính Khi mẫu cấy có mang diệp lục tố tăng trưởng trên môi trường có đường trong điều kiện được chiếu sáng được gọi là nuôi cấy quang dị dưỡng (Kozai và Kubota, 2005) Vì phương pháp nuôi cấy quang dị dưỡng sử dụng bình nuôi kín nên sự trao đổi khí bị hạn chế Nồng độ CO2 trong hộp nuôi lúc mới bật đèn là 300 ppm với cường độ ánh sáng là 80 – 250 μmol m-2 s-1 thì chỉ sau vài giờ nồng độ CO2 giảm xuống chỉ còn 100 ppm (Buddendorf và Woltering, 1994) Sự thiếu hụt CO2 làm cho cây nuôi cấy quang dị dưỡng sử dụng nguồn đường trong môi trường nuôi cấy làm nguồn carbon chính Do đó hiệu suất quang hợp thuần của cây nuôi cấy trong phương pháp này luôn thấp, do cây chỉ sử dụng lượng khí CO2 do hô hấp của mình tạo ra để cung cấp cho quá trình quang hợp

2.2.3.1 Các giai đoạn trong vi nhân giống truyền thống

Trong vi nhân giống in vitro được chia thành 4 giai đoạn chính:

Giai đoạn 0: Lựa chọn mẫu cấy

Giai đoạn 1: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng

Giai đoạn 2: Nhân chồi

Giai đoạn 3: Tạo rễ và chuẩn bị cho sự phát triển trong môi trường tự nhiên

Giai đoạn 4: Thuần hóa ex vitro

2.2.3.2 Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô truyền thống

Như chúng ta thấy phương pháp quang dị dưỡng đã có những ưu điểm nhất định so với phương pháp dị dưỡng Tuy nhiên cả hai phương pháp đều chủ yếu quan tâm đến các thành phần hóa học (chất vô cơ, chất điều hòa tăng trưởng thực vật, nồng

độ đường, amino acid, vitamin, v.v) hay đến các đặc tính hóa học như pH của môi trường nuôi cấy hơn là các yếu tố vật lý của môi trường (ánh sáng, thành phần không khí, độ ẩm, trao đổi khí, nhiệt độ) trong hộp nuôi cấy để thúc đẩy hay ngăn cản sự tăng trưởng của cây Ngoài ra việc sử dụng bình nuôi cấy kín là một đặc điểm tiêu biểu trong vi nhân giống truyền thống Những điều này là nguyên nhân gây nên những hạn chế của phương pháp vi nhân giống truyền thống:

• Hiệu suất quang hợp (photosynthetic rate) của cây in vitro thấp, cây

thiếu khả năng tự dưỡng Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho cây phát triển trong phương pháp vi nhân giống truyền thống, tuy nhiên đã có những nghiên cứu cho thấy đường kìm hãm hoạt động của enzyme quang hợp Rubisco (Hdider và Desjardins, 1995), dẫn đến cường độ quang hợp thấp

Ngoài ra, cây in vitro sống dựa vào nguồn carbon từ môi trường và khả năng

tự dưỡng kém nên khi chuyển sang giai đoạn ex vitro cây cần một khoảng thời gian để phục hồi khả năng quang hợp do đó cây sinh trưởng chậm khi đưa ra vườn ươm trong 3 – 4 tuần đầu tiên

• Do bình nuôi cấy kín nên ẩm độ tương đối (relative humidity) trong bình nuôi cấy luôn ở mức xấp xỉ 100% Việc này dẫn đến những bất thường về sinh lý, sự biến dị ở cây cấy mô Hiện tượng thủy tinh thể là kết quả của các tác nhân vật lý và hóa học bao gồm ẩm độ tương đối và nồng độ ethylene ở mức cao trong bình nuôi cấy

• Tỉ lệ thoát hơi nước cao do khí khổng hoạt động không bình thường, mở

liên tục trong giai đoạn in vitro và nhiều giờ sau khi ra vườn ươm Đồng

thời lớp cutin mỏng

• Tỉ lệ nhiễm khuẩn cao trong giai đoạn in vitro do sự hiện diện của đường

và vitamin trong môi trường nuôi cấy

• Bình nuôi cấy thường nhỏ và kín đã gây nhiều khó khăn trong việc tự động hóa quá trình nuôi cấy đồng thời tốn công lao động cho việc cấy chuyền và cọ rửa

• Chất điều hòa sinh trưởng thường xuyên được sử dụng cũng làm tăng chi phí sản xuất

• Cây ra rễ không hoàn chỉnh, thường chỉ có hệ rễ sơ cấp, một số còn hình thành mô sẹo ở gốc

• Tỉ lệ sống của các cây con khi chuyển ra vườn ươm thấp do sự khác biệt lớn giữa môi trường sống bên trong và bên ngoài bình nuôi cấy Vì vậy nhà nhân giống cần quan tâm, chăm sóc nhiều hơn cây cấy mô trong những ngày đầu tiên cây ở giai đoạn ex vitro

Chính những nhược điểm trên đã làm cho phương pháp vi nhân giống truyền thống gặp nhiều hạn chế khi đưa vào sản xuất Bằng các nghiên cứu khắc phục một số

nhược điểm trên đồng thời với các hiểu biết về môi trường vật lý trong nuôi cấy in vitro đã dẫn đến sự hình thành phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng

2.2.4 Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng

2.2.4.1 Sơ lược về phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng

Quang tự dưỡng là phương pháp vi nhân giống trong đó thực vật sử dụng nguồn cacbon vô cơ (CO2 từ không khí) và ánh sáng là nguồn năng lượng chính, nói cách khác là trong môi trường nuôi cấy, các chất hữu cơ bao gồm đường, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng cần được loại bỏ hoàn toàn Cây nuôi cấy quang tự dưỡng chỉ được cung cấp dinh dưỡng khoáng và phải tự phát triển khả năng quang hợp để cố định CO2 nhằm tạo nguồn chất hữu cơ cho mình

Vì sự cần thiết của nguồn CO2 nên bình hay hộp nuôi cây trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng cần có sự trao đổi khí tốt Để cây có thể tăng trưởng trong điều

kiện quang tự dưỡng thì điều đầu tiên là mẫu cấy phải mang diệp lục tố tức là có khả năng tự quang hợp, tiếp đến là phải kích thích hoạt động quang hợp nhằm gia tăng tốc

độ tăng trưởng của cây Để kích thích sự tăng trưởng cây in vitro thì phải điều chỉnh

các điều kiện của môi trường nuôi cấy như: cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ CO2,.v.v cho phù hợp với khả năng sinh trưởng của loại cây trồng

2.2.4.2 Các phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng

Trao đổi khí tự nhiên

Trao đổi khí tự nhiên là phương pháp sử dụng bình nuôi cấy có lỗ thông khí nhỏ Nguồn gốc của thông khí tự nhiên là do sự chênh lệch về áp suất, khác biệt về nhiệt độ giữa trong và ngoài bình và sự chuyển động của dòng không khí xung quanh bình Do đó, hình dạng của bình, hướng của nắp đậy và lỗ thông, dòng không khí xung quanh bình sẽ ảnh hưởng đến hệ số trao đổi khí tự nhiên của bình (Kozai, 2005) Hiện nay trong vi nhân giống quang tự dưỡng thường sử dụng hộp nuôi cấy gắn màng millipore nhằm gia tăng sự trao đổi khí (Hình 2.5)

Hiện nay, tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã sử dụng giấy mỏng để thay thế cho nút cao su dùng để đậy bình tam giác hoặc các chai thủy tinh có màng thông khí trên nắp

để nuôi cấy quang tự dưỡng nhiều loại thực vật như cây paulownia, cây lõi thọ, cây hoa đồng tiền, cây dâu tây, v.v

Tại Việt Nam việc áp dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng còn gặp nhiều khó khăn do giá thành bình nuôi cấy có màng millipore rất cao dẫn đến việc hạn chế trong áp dụng phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng ở Việt Nam Gần đây Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã nghiên cứu sử dụng các bao nylon có gắn giấy lọc ở thành bao

để thay thế cho màng millipore đem đến khả năng ứng dụng cao cho vi nhân giống quang tự dưỡng (Nguyễn Thị Quỳnh và ctv, 2010a)

Hình 2.5 Các bình nuôi cấy sử dụng trong phương pháp trao đổi khí tự nhiên

(Kozai và ctv, 2005)

Bơm khí trực tiếp

Phương pháp bơm khí trực tiếp là hệ thống nuôi cấy có thể điều chỉnh được dòng không khí đi vào bình nuôi nên có thể kiểm soát được hệ vi khí hậu bên trong

hộp nuôi cấy để tối ưu hóa sự tăng trưởng của cây in vitro (Hình 2.6) Hệ thống bơm

khí trực tiếp trong vi nhân giống quang tự dưỡng được thiết kế ngày càng tiến bộ hơn, các hộp nuôi cấy có kích thước lớn (chứa từ 50 – 500 cây) với các thiết bị kiểm soát môi trường vật lý bên trong hộp đã được phát triển từ cuối thập niên 1980

Năm 1988, Fujiwara và ctv đã nghiên cứu bơm khí với nồng độ khí CO2 cao vào trong hộp nuôi cấy trong điều kiện quang tự dưỡng Từ đó đến nay hệ thống này vẫn được các nhà nuôi cấy mô tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện

Hình 2.6 Hệ thống nuôi cấy bơm khí trực tiếp hộp 17 L.

Bơm khí trực tiếp là một phương pháp nhằm gia tăng nồng độ khí CO2 trong hộp nuôi cây tùy theo sự phát triển của cây Không khí bình thường (CO2 ở mức khoảng 300 – 400 µmol mol-1) hay không khí có chứa khí CO2 ở nồng độ cao được bơm trực tiếp vào hộp nuôi cây Hệ thống này sử dụng các thiết bị như: máy bơm khí, máy đo nồng độ CO2 và lưu lượng kế để kiểm soát tốc độ trao đổi khí vào và ra khỏi hộp

Fujiwara và ctv (1988) đã sử dụng hộp nuôi cấy bằng acrylic với dung tích là

17,8 L để nhân giống quang tự dưỡng cây dâu tây (Fragaria x ananassa Duch.) (1348

cây/m2) Trong nghiên cứu này hệ thống nuôi cấy được bơm khí trực tiếp và có tăng cường CO2

Năm 1992, Kubota và Kozai công bố hệ thống nhân giống cây khoai tây

(Solanum tuberosum L.) bằng phương pháp bơm khí trực tiếp sử dụng hộp

polycarbonate, giá thể là rockwool Hiệu suất quang hợp thuần của khoai tây có khác biệt đáng kể so với trường hợp nuôi cấy trong hộp nhỏ và trao đổi khí tự nhiên

Heo và Kozai (1997), đã thiết lập một hệ thống nhân giống bơm khí trực tiếp có thể tích là 12 L Cây được cấy vào vỉ nuôi cấy có nhiều ô, giá thể là hỗn hợp vermiculite và cellulose Tốc độ phát triển của cây khoai lang trong trường hợp này lớn gấp nhiều lần so với cây nuôi cấy trong hộp nhỏ, môi trường có đường và trao đổi khí tự nhiên

Nguyễn Thị Quỳnh và ctv (2010b) đã thiết kế các hộp nuôi bơm khí trực tiếp có thể tích thay đổi từ 7 L, 17 L đến 60 L áp dụng trong nhân giống cây lan Dendrobium

So với nuôi cây in vitro quang dị dưỡng, cây in vitro quang tự dưỡng bơm khí trực tiếp

trong hộp lớn có một số ưu điểm sau:

Hiệu suất quang hợp thuần cao nên cấy phát triển tốt hơn gấp nhiều lần

Khí khổng hoạt động bình thường

Lớp sáp trên tế bào biểu bì dày

Tỷ lệ mất nước khi ra vườn ươm thấp

Những lợi ích của việc sử dụng hộp nuôi cấy lớn:

Môi trường thông thoáng, độ ẩm duy trì ở mức thấp hơn so với nuôi cấy hộp nhỏ

Nồng độ CO2 và độ ẩm trong hộp nuôi cấy được điều chỉnh khi cần thiết, khả năng tăng trưởng của cây nuôi cấy có thể đạt mứu tối ưu

Một lí do quan trọng nữa là một số lượng lớn cây được nuôi cấy mà không làm giảm đi trọng lượng tươi, trọng lượng khô của cây con Do vậy giảm giá thành sản xuất

Có thể tự động hoá, giảm chi phí nhân công

Trong điều kiện độ ẩm thấp, nồng độ CO2 và ánh sáng cao, sự thích nghi của cây con cây con được đảm bảo, do đó không cần điều kiện đặc biệt nào trong

giai đoạn thuần hoá ex vitro nên tỷ lệ sống của cây in vitro cao

Giá thể tơi xốp, thoáng khí Khi nhổ cây lên ít gây hại cho hệ rễ, cây không bị giảm sức sống

Giá thành sản xuất cây in vitro bằng phương pháp quang tự dưỡng thấp hơn

nuôi cấy quang dị dưỡng (Kozai và Xiao, 2005)

2.2.4.3 Các giai đoạn trong vi nhân giống quang tự dưỡng

Các giai đoạn phát triển và hoạt động trong vi nhân giống thông thường được chia làm 4 giai đoạn chính Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, các giai đoạn có thể

ít hơn so với vi nhân giống truyền thống, vì các giai đoạn nhân chồi và tạo rễ thường kết hợp vào một giai đoạn Trên lý thuyết thì chỉ giai đoạn ban đầu là cần điều kiện dị dưỡng hay quang dị dưỡng để tạo mẫu sạch bệnh bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chồi ngọn, phôi soma, v.v Khi mẫu cấy đã xuất hiện diệp lục tố thì có thể chuyển mẫu sang nuôi cấy quang tự dưỡng Giai đoạn thuần hoá cây trước khi ra vườn ươm thường không cần thiết khi cây tăng trưởng tốt trong điều kiện quang tự dưỡng Như vậy, một

hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng có thể bao gồm 2 giai đoạn: giai đoạn khởi đầu và

giai đoạn nhân chồi/ra rễ, trong khi vi nhân giống truyền thống cần 4 giai đoạn: khởi

đầu, nhân chồi, ra rễ/chuẩn bị, và thuần hoá ex vitro (Hình 2.7)

Hình 2.7 Các giai đoạn nuôi cấy trong vi nhân giống quang dị dưỡng (photomixotrophic)

và quang tự dưỡng (photoautotrophic) (Kozai và Kubota, 2005)

2.2.4.4 Ưu và nhược điểm của nuôi cấy mô quang tự dưỡng

Ưu điểm của phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng

• Nâng cao tốc độ tăng trưởng và phát triển của cây in vitro

• Giảm những bất thường về hình thái và sinh lý của cây in vitro

• Tỉ lệ đột biến thấp do không sử dụng các chất điều hòa tăng trưởng

• Không đòi hỏi điều kiện nuôi cấy hoàn toàn vô trùng, với điều kiện cây (mẫu cấy) sạch bệnh

• Nguy cơ nhiễm nấm, khuẩn thấp do không có đường và các chất hữu cơ khác trong môi trường nuôi cấy

• Dễ dàng điều chỉnh môi trường khi sử dụng hệ thống bơm khí trực tiếp,

vì thế có thể điều chỉnh tốc độ tăng trưởng của cây bằng cách thay đổi điều kiện môi trường

• Có thể tự động hóa quá trình sản xuất

• Giảm chi phí nhân công

Hạn chế của phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng

• Đòi hỏi những kiến thức hiểu biết nhất định về các điều kiện vật lý của môi trường nuôi cấy cũng như các biện pháp kiểm soát Sự thiếu hiểu biết

có thể dẫn đến những thất bại hoặc những nhận định sai lầm trong việc nghiên cứu và ứng dụng phương pháp này

• Chi phí sản xuất có thể tăng do tăng chi phí điện thắp sáng (tăng cả thời gian và cường độ chiếu sáng) và làm mát, tăng cường nồng độ CO2 Tuy nhiên việc sử dụng các tấm phản quang có thể làm tăng cường độ ánh sáng

mà không làm tăng chi phí điện cũng như việc lựa chọn loại máy lạnh có chỉ tiêu tiết kiệm điện cao

2.2.5 Tính chất của môi trường nuôi cấy in vitro

Các đặc tính sinh lý và giải phẫu của cây in vitro có liên hệ với nhau và liên

quan mật thiết với vi khí hậu trong bình nuôi gồm có: ánh sáng, độ ẩm tương đối, nồng

độ CO2, sự di chuyển khí trong bình, v.v, và thành phần của môi trường dinh dưỡng Tất cả các nhân tố đó tác động qua lại với nhau đồng thời tác động lên sự tăng trưởng

của cây in vitro (Afreen, 2005)

2.2.5.1 Nồng độ đường: Nồng độ đường cao trong môi trường nuôi cấy ức chế sự

quang hợp của cây in vitro Sự quang hợp và tăng trưởng của cây dâu tây in vitro được

mô tả bởi Hdider và Desjardins (1995) cho thấy rằng hiệu suất quang hợp của cây dâu tây tăng theo thời gian khi được chuyển từ môi trường có đường sang môi trường không đường Tương tự, hoạt động của RuBisCO cũng tăng trong những cây đó

2.2.5.2 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Trong vi nhân giống truyền thống,

các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm làm tăng số chồi và sự tăng trưởng chồi, làm tăng sự tạo rễ Do đó, thành phần môi trường và thành phần các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được xem là yếu tố quyết định đối với sự thành công của một quy trình nhân giống Ngược lại, trong vi nhân giống quang tự dưỡng mẫu cấy là các đốt thân mang lá có khả năng quang hợp nên việc bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh là không cần thiết vì cây sẽ

tự tạo ra các chất điều hòa sinh trưởng nội sinh cần thiết cho việc gia tăng chồi Do đó

điều quan tâm ở đây là cách thức kiểm soát môi trường nuôi để cây sinh trưởng và tạo

rễ mới là quan trọng (Kozai và Kubota, 2005)

2.2.5.3 Giá thể: Việc thay thế agar hay gel truyền thống bằng các giá thể thông

thoáng, xốp có tác động quan trọng lên môi trường vùng rễ và ảnh hưởng lên toàn bộ quá trình phát triển của cây Cấu trúc rễ của cây thay đổi khi cây tăng trưởng trên các giá thể khác nhau như: agar, gellan gum, vermiculite, Sorbarod (sợi cellulose) và Florialite (hỗn hợp của vermiculite và sợi cellulose) Cây tăng trưởng trên giá thể càng thông thoáng thì hệ thống rễ phụ phát triển càng mạnh Nhờ đó chất dinh dưỡng và nước được hấp thu tốt thúc đẩy cây tăng trưởng (Afreen và ctv, 1999) Mặt khác, cây nuôi cấy trong những giá thể xốp có khả năng sống và tăng trưởng tốt hơn trong điều

kiện môi trường ex vitro so với giá thể agar Ví dụ như tỉ lệ sống cao của cây bạch đàn

ex vitro do hệ thống rễ phát triển mạnh khi nuôi cấy trên giá thể xốp, thông thoáng

(Zobayed và ctv, 2000 và 20001) Việc sử dụng các loại giá thể xốp thoáng khí như Florialite (Afreen và ctv, 2000), vermiculite (Kirdmanee và ctv, 1995) cũng giúp rễ phát triển tốt hơn và cây tăng trưởng mạnh mẽ hơn trong điều kiện quang tự dưỡng Casanova (2008) cho thấy khi tăng nồng độ agar thì số chồi, bề dày của lá và trọng

lượng tươi ở cây hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) sẽ giảm

2.2.5.4 Ánh sáng: Trong nhân giống in vitro, cây sử dụng nguồn ánh sáng nhân tạo

(chủ yếu là ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang) để tổng hợp hydratcarbon Cây nuôi cấy theo phương pháp quang dị dưỡng truyền thống thường được chiếu sáng với cường độ ánh sáng thấp (khoảng 30 – 40 µmol m-2 s-1) và môi trường nuôi cấy luôn bổ sung đường Do đó, chức năng quang hợp của lá bị ức chế làm cho cây tăng trưởng

quang dị dưỡng có khả năng quang hợp yếu (Kozai, 1991) Trái lại, cây nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng có khả năng quang hợp cao khi môi trường nuôi cấy được cung

cấp cường độ ánh sáng (PPF) cao và thời gian chiếu sáng gia tăng (Kozai và Iwanami, 1988; Kozai và ctv, 1986, 1987, 1988)

2.2.5.5 Nồng độ CO 2: Cây nuôi cấy quang dị dưỡng in vitro bắt đầu hấp thụ CO2 khi được chiếu sáng nhưng do bình nuôi cấy kín nên nồng độ CO2 nhanh chóng giảm xuống điểm bù CO2 (50 – 100 mol m-2 s-1), kết quả là cây có hiệu suất quang hợp

thuần thấp trong suốt thời gian chiếu sáng còn lại Khi cây tiếp tục tăng trưởng thì nhu cầu CO2 tăng nhưng do bình kín khí thì nồng độ CO2 không thể tăng theo nhu cầu của cây, kết quả là sự tăng trưởng và phát triển của cây bị kìm hãm Vấn đề này được khắc phục trong phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng do nồng độ CO2 được giữ trong phòng nuôi cao do có sự trao đổi khí giữa không khí của bình nuôi và phòng nuôi Bình nuôi được gắn các màng lọc khí trên nắp hay thành bình cho phép khuyếch tán khí CO2 giữa trong và ngoài bình hay bằng cách bơm khí để làm giàu khí CO2trong bình (Kozai, 2005) Nguyễn Trí Minh (2008) khi nghiên cứu trên cây dâu tây (Fragaria Ananassa Duch.) đã cho thấy rằng nồng độ khí CO2 rất quan trọng đối với

tăng trưởng của cây dâu tây in vitro, khi nồng độ CO2 thấp thì việc tăng cường độ ánh sáng lên cao là không hiệu quả vì cây không sử dụng hết lượng ánh sáng được cung cấp

2.2.5.6 Nhiệt độ

Nói chung, nhiệt độ ảnh hưởng lên sự quang hợp của cây và sự nhạy cảm với O2 trong quang hợp tăng theo nhiệt độ Trong hệ thống nuôi cấy truyền thống, khi bình nuôi được đậy kín thì nhiệt độ tương đối không đổi theo thời gian và luôn cao hơn nhiệt độ trong phòng nuôi từ 1 – 2oC Tuy nhiên, trong hệ thống nuôi cấy quang tự dưỡng, bình nuôi được thông khí tự nhiên hay bằng bơm thì nhiệt độ không phụ thuộc vào hệ thống kín trong bình mà phụ thuộc vào nhiệt độ của phòng nuôi (Kozai và ctv, 2005)

2.2.5.7 Độ ẩm tương đối: Do phải ngăn cản sự xâm nhập của các nấm khuẩn, bình

nuôi cấy thường kín trong nuôi cấy truyền thống Mặt khác, sự bốc hơi nước từ môi trường dinh dưỡng trong bình và sự thoát hơi nước của lá làm tăng lượng hơi nước chứa trong bình kín khí Do đó, độ ẩm tương đối trong bình nuôi thường cao hơn 95% (Kozai và ctv, 1993) Tuy nhiên, trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng, độ ẩm trong bình có thể giảm bằng cách tăng lượng trao đổi khí hay qua phương pháp khuyếch tán khí tự nhiên hay bơm khí trực tiếp Bằng cách sử dụng phương pháp bơm khí trực tiếp, độ ẩm trong bình có thể kiểm soát một cách dễ dàng hơn (Kozai và ctv, 1995)

2.2.5.8 Khí ethylen: Trong các mô sống của cây nuôi cấy, không chỉ những cơ quan

quang hợp mà tất cả các cơ quan đều cần sự trao đổi khí cho hoạt động của chúng (hô hấp) Việc ngăn cản trao đổi khí trong vài giờ thường gây hại cho các tế bào đang tăng trưởng (Kozai và Kubota, 2005) Thể tích khí trong môi trường nuôi ở hệ thống truyền thống thường nhỏ và khả năng trao đổi khí thấp Do đó, khí ethylene tích tụ trong bình ngày càng nhiều Khi nồng độ ethylene trên 0,1 μmol mol-1 trong bình nuôi cấy thì sự tăng trưởng của cây sẽ bị ức chế và dẫn đến những hư hỏng về hình thái như hiện tượng thủy tinh thể (Zoybayed, 2000) Trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng do tăng trường sự trao đổi khí với môi trường bên ngoài nên không còn sự tích lủy ethylen ở nồng độ cao gây nguy hiểm cho sự tăng trưởng của cây

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng Điểm về Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, Thủ Đức

Thời gian thí nghiệm từ 02/2010 đến 06/2010

3.2 Vật liệu

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

3.2.1.1 Thiết bị

Các thiết bị trong phòng sáng:

Kệ được trang bị bằng bóng đèn huỳnh quang 1,2 m, công suất 40w (bóng đèn

do công ty Điện Quang, Tp Hồ Chí Minh sản xuất)

Tủ cấy vô trùng ESCO (công ty Esco Micro, Singapore)

Máy đo pH hiệu ORION (Orion Reaseach, Inc., USA)

Cân phân tích TE 1502S (Sartorius, Gemany)

Cân phân tích LIBROR-430 (Shimadzu Copration, Japan)

Tủ sấy SANYO MOV-212 (SANYO electric Co Ltd., Japan)

Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HV–85 Hiclave, Japan

Máy đo cường độ ánh sáng model LI-250A (LI-COR, USA)

Thước đo đường kính thân Absolute Digimatic No CD-611CSX (Mitutoyo Co., Japan)

Máy đo diện tích lá LI-3100C (LI-COR, USA)

Máy đo mật độ quang model 4001/4, GENESYS 20 (Thermo electron Co., USA)

Máy đo nồng độ khí CO2 và nhiệt độ Telaire 7001, (MicroDAQ.com, Ltd., USA)

Tủ vi khí hậu model PGC–9/2 (Percival, USA)

3.2.1.2 Dụng cụ

Hệ thống trao đổi khí tự nhiên:

Bình thủy tinh dung tích 550 ml dùng trong cấy chuyền tạo số lượng mẫu cây ban đầu cho thí nghiệm

Sử dụng hộp Magenta GA-7 (thể tích 370 ml), (Sigma Co Ltd., USA)

Sử dụng màng lọc millipore có đường kính 2 cm và có đường kính lỗ trên màng 0.45 µm do hãng Millipore, Tokyo, Japan sản xuất

Hệ thống bơm khí trực tiếp bao gồm các thiết bị sau:

Hộp nuôi cấy bằng polycarbonate có kích thước 45 x 25 x 15 (cm)

Bơm RAMBO EP-9000 (China), công suất 6,5 Wh-1

Bơm Resun® ACO-004 (Japan), công suất 10,5 Wh-1

Flow metter RK 1150 (công ty Kojima, Japan)

Hệ thống ống dẫn khí từ bơm vào hộp nuôi cấy và hệ thống ống dẫn khí từ hộp

ra ngoài môi trường

Màng lọc Whatman (đường kính 5 cm) có lỗ nhỏ trên màng (đường kính 0,2 μm) (Japan)

Hệ thống ống phân phối khí nằm ngang đường kính 5mm, được đục nhiều lỗ nhỏ

Hình 3.1 Sơ đồ của hệ thống bơm khí trực tiếp