Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut lở mồm long móng (LMLM)

ViƯn Thó y Bé KH CN Bé KH CN ViƯn Thó y Bé KH CN ViƯn Thó y Bé khoa học, công nghệ môi trờng Viện Thú Y 86, Đờng Trờng Chinh - Đống Đa Hà Nội Báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.06: Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhợc độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM) Chủ nhiệm đề tài: TS Tô Long Thành 6102 19/9/2006 Hà Nội 2005 Bản quyền 2005 thuộc Viện Thú y Đơn xin chép toàn phần tài liệu phải gửi đến Viện tr−ëng ViƯn Thó y trõ tr−êng hỵp sư dơng víi mục đích nghiên cứu Mục lục Trang Các đề tài nhánh đề tài kc.04.06 Danh sách cán tham gia Danh sách đon vị tham gia, phối hợp tóm tắt Báo cáo Những từ viết tắt Lời nói đầu Chơng I Tổng quan tài liệu 1.1 Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 1.1.1 Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng 1.1.1.1 Lịch sử nghiªn cøu vỊ bƯnh tơ hut trïng trªn thÕ giíi 1.1.1.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng Việt Nam 1.1.2 Tóm lợc nghiên cứu vacxin phòng bƯnh tơ hut trïng 1.1.3 Vi khn Pasteurella multocida 1.1.3.1 §Ỉc tÝnh sinh vËt häc cđa vi khn P multocida 1.1.3.2 Đặc tính hình thái vi khuẩn 1.1.3.3 Tính chất bắt màu vi khuẩn 1.1.3.4 Đặc tính nuôi cấy vi khuẩn P multocida 1.1.3.5 Đặc tính sinh hoá Pasteurella multocida 1.1.3.6 Giáp mô vi khuẩn Pasteurella multocida 1.1.3.7 §éc tè cđa Pasteurella multocida 1.1.4 CÊu trúc kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida 1.1.4.1 Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen) 1.1.4.2 Kháng nguyên thân (O) - Somatic antigen 1.1.5 C¸c type hut häc cđa P multocida 1.2 Bệnh vấn đề an toàn, vệ sinh thùc phÈm vi khuÈn Salmonella spp g©y gia cầm 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Salmonella 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nớc 1.2.3 Đặc điểm Salmonella 1.2.4 Tình trạng ngộ độc thức ăn Salmonella 1.2.5 Biện pháp phòng bệnh 1.2.6 vắc-xin chống Salmonella cho gà 1.2.6.1 Một số loại vaccine chống Salmonella 1.2.6.2 Sơ lợc kháng nguyên roi S typhimurium 1.2.6.3 Kháng nguyên roi Salmonella typhimurium có khả bảo hộ cho gà chống Salmonella 13 14 24 24 24 24 25 26 27 27 27 28 28 31 32 32 33 33 34 35 37 37 39 41 41 42 43 43 44 45 1.2.6.4 Khả sinh đáp ứng miễn dịch protein flagellin 1.3 BÖnh Lë måm Long mãng 1.3.1 BÖnh Lở mồm Long móng tình hình nghiên cứu bƯnh trong, ngoµi n−íc 1.3.1.1 BƯnh Lë måm Long mãng, tình hình bệnh giới Việt Nam 1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM giới 1.3.1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM nớc 1.3.2 Vi rút gây bệnh LMLM 1.3.2.1 Hình thái học 1.3.2.2 Sức đề kháng vi rút 1.3.2.3 Đặc tính nuôi cấy 1.3.3 Các phơng pháp chẩn đoán 1.3.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 1.3.3.2 Đại cơng chẩn đoán phòng thí nghiệm 1.3.3.3 Chẩn đoán huyết học 1.3.3.3.1 Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) 1.3.3.3.2 Phản ứng trung hoà vi rút 1.3.3.3.3 Phản ứng ELISA 1.3.3.3.4 Các phản ứng huyết học khác 1.3.3.4 Chẩn đoán vi rút học 1.3.3.5 Chẩn đoán kỹ thuật RT-PCR Chơng II: Nguyên liệu phơng pháp nghiên cứu A Nguyên liệu 2.1 Nghiên cứu phát triển hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất lợng cao 2.1.1 Động vật thí nghiệm 2.1.2 Vi khuẩn gây bƯnh tơ hut trïng 2.1.3 Dơng m¸y mãc thÝ nghiệm 2.1.4 Môi trờng, hoá chất 2.2 Sản xuất vắc xin phòng bệnh S enteritidis S typhimurium công nghệ vi khuẩn 2.2.1 Động vật sản phẩm động vật 2.2.2 Các loại môi trờng thông thờng 2.2.3 Các loại môi trờng chuyên biết 2.2.4 Các trang thiết bị phòng thí nghiệm cần thiết khác 2.3 Sản xuất vắc xin phòng bệnh S.enteritidis S typhimurium vi khn biÕn n¹p 2.3.1 Chđng vi sinh vËt 2.3.2 §éng vËt 2.3.3 Plasmid 46 47 47 47 49 51 52 52 52 52 53 53 53 54 54 55 55 56 56 56 58 58 58 58 58 58 58 59 59 59 60 62 62 62 62 62 2.3.4 Môi trờng nuôi cấy 2.3.5 Các dung dịch 2.4 §Þnh type vi rót LMLM b»ng kü tht RT-PCR 2.4.1 Bệnh phẩm 2.4.2 Nguồn bệnh phẩm 2.4.3 Dung dịch bảo quản bệnh phẩm 2.4.4 Tế bào BHK- 21 môi trờng nuôi cấy tế bào 2.4.5 Hoá chất, vật liệu thiết bị để tiến hành phản ứng RT-PCR 2.4.5.1 Mẫu ARN chuẩn 2.4.5.2 Các hoá chất, vật liệu cần thiết tiến hành phản ứng RT- 63 63 64 64 64 64 65 65 65 65 PCR 2.4.5.3 C¸c hãa chất, vật liệu cần thiết cho việc tách dòng (cloning) 2.4.5.4 Thiết bị, máy móc 2.4.5.5 Các cặp mồi đặc hiƯu víi vi rót LMLM type O, A , C Asia-1 B Phơng pháp nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu phát triển hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất lợng cao 3.1.1 Kiểm tra giống vi khuẩn dùng để nghiên cứu sản xuất vacxin 3.1.2 Xác định đặc điểm hình thái đặc tính sinh hoá vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò chủng IR 3.1.3 Kiểm tra độc lực vi khuẩn chuột nhắt trắng 3.1.4 Sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có chất bổ trợ keo phèn Saponin 3.1.5 Kiểm nghiệm vắc xin 3.1.5.1 Kiểm tra vô trùng vắc xin 3.1.5.2 Kiểm tra an toµn vacxin 3.1.5.3 KiĨm tra hiƯu lùc cđa vacxin 3.1.5.3.1 KiĨm tra hiƯu lùc cđa vacxin phßng thÝ nghiệm 3.1.5.3.2 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch vacxin trâu, bò 3.1.6 Phơng pháp xử lý số liệu 3.1.6.1 Phơng pháp tính số miễn dịch 3.1.6.2 Phơng pháp xử lý số liệu toán thống kê 3.2 Sản xuất vắc xin phòng chống S enteritidis S typhimurium công nghệ vi khuẩn 3.2.1 Các phơng pháp vi sinh vật học thông thờng 3.2.2 Các phơng pháp sản xuất kiểm nghiệm vắc xin 3.3 Sản xuất vắc xin phòng bệnh S.enteritidis S typhimurium vi khuẩn biến nạp 3.3.1 Tách chiết ADN hệ gen vi khuẩn 3.3.2 Phơng pháp tổng hợp chuỗi (PCR) 65 66 66 66 66 66 67 69 71 72 72 72 72 72 72 76 76 76 77 77 77 78 78 78 3.3.3 Xö lý ADN b»ng enzym hạn chế 3.3.4 Phản ứng nối ghép gen 3.3.5 Biến nạp vào E coli 3.3.6 Tách chiết ADN plasmid từ E coli 3.3.7 Cảm ứng biểu protein tái tổ hợp 3.3.8 Biến nạp plasmid vào nấm men P pastoris xung điện 3.3.9 Western Blot, ELISA 3.4 Định type vi rót LMLM b»ng kü tht RT-PCR 3.4.1 C¸c phơng pháp chẩn đoán, định typ vi rút LMLM Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế 3.4.2 Phơng pháp thu thập, vận chuyển bảo quản bệnh phẩm 3.4.3 Phơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định type vi rút LMLM 3.4.3.1 Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô 3.4.3.2 Tạo cADN phản ứng chép ngợc 3.4.3.3 Ph¶n øng PCR 3.4.3.5 KiĨm tra s¶n phÈm PCR 3.4.4 Tách dòng giải trình tự đoạn gen mà hóa cho serotype O cđa vi rót g©y bƯnh LMLM ph©n lập Việt nam 3.4.4.1 Lai sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCRR2.1 biến nạp vào tế bào khả biến (competent E coli cells) 3.4.4.2 Tách chiết Plasmid 3.4.4.3 Cắt enzym giới hạn 3.4.5 Phơng pháp nuôi cấy tế bào gây nhiễm vi rút gây bệnh LMLM 3.4.5.1 Phơng pháp nuôi tế bào BHK-21 (Baby Hamster Kidney - 21) 3.4.5.2 Phơng pháp tách tế bào bám dính 3.4.5.3 Phơng pháp gây nhiễm vi rút LMLM lên tế bào BHK-21 Chơng III Kết nghiên cứu thảo luận 4.1 Nghiên cứu phát triển hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất lợng cao 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ trâu bò chết địa phơng 4.1.2 Tính tơng đồng kháng nguyên vi khuẩn P multocida chủng IR với đại diện chủng P multocida phân lập đợc 4.1.3 Kết xác định liều kháng nguyên thích hợp kích thích khả sản sinh miễn dịch tốt trâu bò 4.1.4 Kết xác định công thức bổ trợ thích hợp theo dõi độ dài miễn dịch vắc xin keo phèn-saponin 4.1.5 Kết chế vắc xin tụ huyết trùng trâu bò keo phènsaponin chủng IR 4.1.6 Tính tơng đồng kháng nguyên cđa vi khn P.multocida chđng IR víi c¸c chđng P multocida khác sử dụng chế vắc xin THT trâu bò Việt Nam 78 79 79 80 81 82 83 84 84 84 86 86 86 86 87 88 88 89 89 90 90 90 90 92 92 92 95 96 97 98 99 4.2 Sản xuất vắc xin phòng chống S enteritidis S typhimurium công nghệ vi khuẩn 4.2.1 Kết điều tra vài đặc điểm dịch tễ sở chăn nuôi gà giống 4.2.2 Kết xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp 4.2.3 Kết giám định số đặc tính sinh hoá vi khuẩn Salmonella phân lập đợc 4.2.4 Kết thử độc lực chủng Salmonella phân lập đợc chuột nhắt trắng 4.2.5 Kết thử khả mọc chủng Salmonella loại môi trờng dinh dỡng khác 4.2.6 Kết thử đặc tính sinh hóa chủng Salmonella 4.2.7 Kết thử độc lực chủng Salmonella phân lập đợc 4.2.8 Kết xác định LD 50 chủng Salmonella phân lập đợc 4.2.9 Sản xuất thử nghiệm vacxin S enteritidis S Typhimurium vô hoạt keo phèn 4.2.10 Kết thử khiết vacxin 4.2.11 Kết thử vô trùng vacxin 4.2.12 Kết thử an toàn chuột nhắt trắng 4.2.13 Kết thử an toàn gà mái hậu bị 4.2.14 Kết kiểm tra hiệu lực vacxin chuột nhắt trắng 4.2.15 Kết thử nghiệm hiệu lực vác xin gà 4.2.16 Thí nghiệm xác định liều sử dụng vacxin 4.3 Sản xuất vắc xin phòng bệnh S enteritidis S typhimurium vi khuẩn biến nạp 4.3.1 BiĨu hiƯn gen fliC3, gm3, sef14 E coli BL21 4.3.1.1 Đa gen vào vectơ pCR2.1 4.3.1.1.1 Tách chiết ADN hệ gen vi khuẩn 4.3.1.1.2.Nhân đoạn gen fliC3, gm3, sef14 tõ hƯ gen S typhimurium, S enteritidis 4.3.1.1.3 §−a sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1 4.3.1.2 Đa gen vào vectơ biểu pET22b(+) 4.3.1.3 Biểu gen fliC3, gm3, sef14 E coli BL21 4.3.2 BiĨu hiƯn gen fliC3, gm3, sef14 nÊm men P pastoris 4.3.2.1 Nhân gen PCR 4.3.2.2 Đa gen vào vectơ tách dòng pCR2.1 4.3.2.3 Đa gen vào vectơ biểu pPIC9 4.3.2.4 BiĨu hiƯn gen nÊm men P pastoris 4.3.3 Thử đáp ứng miễn dịch gà với kháng nguyên tái tổ hợp Flic3 99 99 100 102 104 105 106 106 107 108 108 108 109 110 110 111 111 113 113 113 113 114 115 119 120 122 122 123 123 125 126 4.3.3.1 Tinh kháng nguyên tái tổ hợp FliC 4.3.3.2 Gây miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp FliC kháng nguyên toàn phần gà hậu bị 4.3.3.3 Western blot ELISA 4.3.4 Tinh protein tái tổ hợp GM3 4.3.5 Nghiên cứu khả bảo hộ protein tái tổ hợp Flic3 Gm3 4.4 Định type vi rút LMLM kỹ thuật RT-PCR 4.4.1 Khái quát tình hình dịch bệnh LMLM Việt Nam vòng năm trở lại thời gian gần 4.4.2 Diễn biến lâm sàng bệnh bò lợn 4.4.3 Thu thập, vận chuyển bảo quản bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bƯnh 4.4.3.1 Thu thËp bƯnh phÈm tõ gia sóc nghi m¾c bƯnh LMLM 4.4.3.2 VËn chun bƯnh phÈm tõ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 4.4.3.3 Bảo quản mẫu bệnh phÈm tõ gia sóc nghi m¾c bƯnh LMLM 126 127 127 131 132 134 134 136 138 138 139 139 4.4.4 Thiết lập phơng pháp RTPCR để phát vi rút gây bệnh LMLM mẫu ARN đà biết 4.4.5 Chẩn đoán định type mẫu bệnh phẩm thu thập 140 143 tỉnh Qủang Trị 4.4.6 Kết xác định tính đặc hiệu cặp mồi dùng 145 chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM 4.4.7 Kết ứng dụng phơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định 147 typ vi rút LMLM từ bệnh phẩm thu thập từ thực địa 4.4.8 Tách dòng giải trình trình tự đoạn gene mà hoá cho serotype O cđa vi rut LMLM thu thËp t¹i tØnh Qđang Trị 4.4.8.1 Tách dòng đoạn gene đặc hiệu chung để nhận biết type O, A, C, asia-1 đoạn gene đặc hiệu cho typ O 4.4.8.2 Kết giải trình trình tự nuclêotide 4.4.9 Kết phân lập vi rút tế bào dòng BHK-21 4.4.9.1 Điều kiện làm việc với vi rút LMLM 4.4.9.2 Kết nuôi cấy trì tế bào BHK-21 4.4.9.3 Kết g©y nhiƠm bƯnh phÈm nghi cã chøa vi rót LMLM lên tế bào BHK-21 4.4.9.4 So sánh chẩn đoán vi rút LMLM RT-PCR từ bệnh phẩm biểu mô từ bệnh phẩm biểu mô đà cấy chuyển tế bào 4.4.10 So sánh phơng pháp ELISA RT-PCR để chẩn đoánđịnh typ virut LMLM 4.4.11 Nhận xét tổng quan phơng pháp RT-PCR chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM Chơng IVKết luận đề nghị Kết luận I Các tiêu sản phẩm II Về nội dung phơng pháp sử dông 149 149 151 153 153 153 155 156 158 160 163 163 163 163 III Về giải pháp khoa học công nghệ IV Các sản phẩm cụ thể Đề nghị Lời cảm ơn Tài liệu tham khảo 164 165 165 166 167 Các đề tài nhánh đề tài kc.04.06 TT Mà số Tên đề tài nhánh Cơ quan chủ nhiệm đề tài nhánh Nghiên cứu phát triển hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng KC.04.06.01 trâu bò chất lợng cao Viện Thú y ThS Hoàng Xuân Nghinh Sản xuất vắc xin phòng bƯnh S enteritidis vµ S typhi murium b»ng KC.04.06.02 công nghệ vi khuẩn Viện Thú y TS Trần Thị Hạnh Sản xuất vắc xin phòng bệnh S KC.04.06.03 enteritidis vµ S typhi murium b»ng vi khuÈn biến nạp Viện Công nghệ Sinh học TS Trơng Nam Hải Định type vi rút LMLM kỹ thuật KC.04.06.04 sinh học phân tử (RT-PCR) TS Tô Long Thành ViƯn Thó y Danh s¸ch c¸n bé tham gia TT Họ Tên Học vị Cơ quan công tác chuyên môn Trơng Văn Dung PGS TS Viện Thú y Hoàng Xuân Nghinh Th.S Viện Thú y Đỗ Tuấn Cơng BSTY Viện Thú y Trần Ngọc ánh Th.S Viện Thú y Nguyễn Lại Hoàn TS Viện Thú y Trơng Thị Hồng Hoa BSTY Viện Thú y Lê Văn Phan BSTY Viện Thú y Nguyễn Thị Bích BSTY Viện Thú y Đặng Vũ Hoàng BSTY Viện Thú y 10 Trần Thị Thanh Hà BSTY Viện Thú y 11 Trần Thu Hiền Th.S Công Ty Hanvet 12 Nguyễn Thị Nguyệt Th.S Công Ty Hanvet 13 Nguyễn Lê Văn Th.S Viện Chăn nuôi 14 Trần Thị Hạnh TS Viện Thú y 15 Nguyễn Tiến Thành BSTY Viện Thú y 16 Đặng Thị Thanh Sơn BSTY ViƯn Thó y 17 Ng« Chung Thđy BSTY ViƯn Thó y 18 TrÞnh Phó Ngäc TS ViƯn Thó y 19 Đặng Đình Thởng BSTY Viện Thú y 4.4.2 Diễn biến lâm sàng bệnh bò lợn Triệu chứng lâm sàng trâu bò thay đổi tuỳ theo thời gian mắc bệnh Khi mắc bệnh, trâu bò sốt cao (400C- 41,50C) Con vật lờ đờ, uể oải, ăn, lông dựng, bứt rứt, khó chịu run rẩy Khi đà tạo mụn nớc miệng, lỡi, bờ kẽ móng, vật có biểu lâm sàng đặc trng: Nhai nhóp nhép, run môi, chảy nớc dÃi, run chân khập khiễng, đứng lên nằm xuống khó khăn Khi mụn nớc vỡ có dịch màu vàng nhạt, thân nhiệt hạ xuống bình thờng Quan sát thấy mụn nớc sau vÕt lt ë mâm, l−ìi, xoang miƯng, nóm vó vµ da móng móng dới bàn chân số địa phơng khác nh Lạng Sơn, Phú Thọchúng đà quan sát lợn nghi bị bệnh LMLM Lợn có mụn nớc bờ móng kẽ móng mõm, mũi Các mụn nứoc lợn vỡ dễ bị nhiễm khuẩn kế phát Thông qua triệu chứng lâm sàng đợc miêu tả nh cộng với so sánh, tham khảo với tài liệu tác giả triệu chứng gia súc mắc bệnh LMLM, mặt chẩn đoán lâm sàng, cho đàn gia súc mà tiến hành lấy bệnh phẩm nghi bị mắc bệnh LMLM Phần lớn bệnh phẩm đợc thu thập từ gia súc có triệu chứng lâm sàng nghi bị bệnh LMLM 4.4.3 Thu thập, vận chuyển bảo quản bệnh phẩm từ gia súc nghi m¾c bƯnh Thu thËp bƯnh phÈm tõ gia sóc nghi mắc bệnh LMLM Nh đà nói phần Nguyên Liệu, chóng t«i cã hai ngn bƯnh phÈm tõ gia sóc nghi bị bệnh LMLM: bệnh phẩm Bộ môn HS-MD-BL trùc tiÕp lÊy vµ bƯnh phÈm Chi cơc Thó y số tỉnh Trung tâm Thú y vùng Thành phố Hồ Chí Minh gửi đến Tổng số mẫu từ hai nguồn kể mà đà tiến hành chẩn đoán lu giữ 250 mÉu bƯnh phÈm biĨu m« VËn chun bƯnh phÈm tõ gia súc nghi mắc bệnh LMLM Đối với bệnh phẩm trực tiếp thu thập từ thực địa, lọ đựng bệnh phẩm đợc đặt vào hộp nhựa có sẵn đá đợc vận chuyển phòng thí nghiệm Đối víi bƯnh phÈm c¸c Chi cơc Thó y thu thập, lọ đựng bệnh phẩm đợc đặt hộp xốp có túi làm lạnh chèn xung quanh đợc gửi phát chuyển nhanh tới Viện Thú y Bảo quản mẫu bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM Sau mẫu bệnh phẩm đến nơi, bệnh phẩm đợc bảo quản - 800C 4.4.4 Thiết lập phơng pháp RTPCR để phát vi rút gây bệnh LMLM mẫu ARN đà biết 55 Để thiết lập phơng pháp RT - PCR, đà sử dụng mẫu chuẩn mẫu ARN chiết tách từ bệnh phẩm nghi LMLM Việt Nam, đà đợc xác định chứa vi Hình 4.1: PCR với cặp mồi 1F/1R đặc hiệu cho typ O, A, C Asia vi rut LMLM với sản phẩm có độ dài 328 cặp bazơ Từ 1-14 mẫu ARN chuẩn đặc hiệu cho typ O nhận từ Phòng thí nghiệm chn qc tÕ vỊ LMLM (WRL) Pirbright M lµ chØ thị phân tử rút LMLM type O, nhận từ phòng thÝ nghiƯm chn Qc tÕ Pirbright, Anh Qc Chóng t«i đà dùng cặp mồi 1F/1R đợc công bố đặc hiệu với typ O, A, C Asial vi rút LMLM để thiết lập phơng pháp RT - PCR Việt Nam Kết đợc nêu hình 4.1 cho thấy: với cặp mồi 1F/1R, 14 mẫu ARN cho kết PCR dơng tính với sản phẩm có độ dài 328 bp (mũi tên), hoàn toàn trùng hợp với Hình 4.2 PCR với cặp mồi P33/P38 đặc hiệu cho typ O vi rút LMLM với sản phẩm có độ dài 405 bp Từ 1-14 chủng chuẩn đặc hiệu cho typ O nhận tõ phßng thÝ nghiƯm chn qc tÕ vỊ LMLM (WRL), Pirbright, Anh Quốc M thị phân tử kết đà công bố cặp mồi Với kết dơng tính 100%, chứng tỏ độ nhạy cao, cặp mồi hoàn toàn thích hợp để sử dụng chẩn đoán phát có mặt vi rút gây bệnh LMLM Việt Nam 56 Bên cạnh cặp mồi 1F/1R tiến hành phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi P33/P38 đặc hiệu cho typ O với kết đợc trình bày Hình 4.2 cho thấy sản phẩm PCR có độ dài 405 cặp bazơ (mũi tên) Kết hoàn toàn trùng hợp với kết mà Phòng thí nghiệm Pirbright đà tiến hành 4.4.5 Chẩn đoán định type mẫu bệnh phẩm thu thập tỉnh Qủang Trị Vào tháng năm 2003, tỉnh Quảng Trị (QT), có dịch bò lợn với triệu chứng lâm sàng nghi bệnh LMLM (Hình 4.3) Chúng đà tiến hành khám lấy Hình 4.3 ảnh chụp bò có triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh LMLM Đà tiến hành lấy mẫu biểu mô bò Bệnh phẩm đợc bảo quản 4oC dung địch đệm phốt phát-glycerine có bổ sung kháng sinh Sau đợc vận chuyển đến phòng thí nghiệm, bệnh phẩm đợc bảo quản 80oC dùng mẫu bệnh phẩm biểu mô bò mắc bệnh giai đoạn đầu Kết RT-PCR bệnh phẩm từ QT đợc trình bày Hình 4.4 Kết Hình 4.4A cho thấy, sè mÉu bÖnh phÈm thu thËp tõ QT cho kết dơng tính với cặp mồi 1F/1R cặp mồi đặc hiệu chung Kết 4.4B cho thấy số bệnh phẩm cho phản ứng dơng tính với cặp mồi P33/P38, cặp mồi đặc hiệu cho type O Đợc dùng nh đối chúng dơng (type O) phản ứng, mẫu chuẩn (dải P, Hình 4.4B) ARN mà WRL, Pirbright gửi cho cho kết tơng tự Hình 4.4 Hình A Kết RT-PCR dùng cặp mồi 1F/1R đặc hiệu chung để nhận biết type O,A,C, Asia-1 vi rút LMLM Sản phẩm PCR đặc hiệu có độ dài 328 cặp bazơ (mũi tên) Hình B Kết phơng pháp RTPCR với cặp mồi P33/P38 đặc hiệu cho type O virus LMLM Sản phẩm PCR đặc hiệu có độ dài 405 cặp bazơ (mũi tên) Từ QT1- QT3 mẫu bệnh phẩm bểu mô thu thập QT P mẫu chuẩn nhận từ Phòng Thí nghiệm Chuẩn Quốc tế LMLM, WRL-Pirbright M thị phân tử QT1 QT2 QT3 M A P QT1 QT2 QT3 M B 4.4.6 Kết xác định tính đặc hiệu cặp mồi dùng chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM 57 Tính đặc hiệu cỈp måi P33/P38 (typ O), P33/P37 (type A), P33/P40 (type C) P33/P74 (typ Asia-1) đợc kiểm tra với ARN chuẩn nhận từ WRL, Pirbright mẫu ARN chiết tách từ bệnh phẩm mà thu thập đợc từ QT Hình 4.5 Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi: 1F/1R, P33/P38, P33/P87, P33/P40, P33/P74 với mẫu chuẩn nhận từ WRL, Pirbright đà đợc xác định typ O mẫu ARN chiết tách từ bệnh phẩm biểu mô thu thập QT P1, P2, P4, P7, P9, P11 mẫu chuẩn nhận từ phòng thÝ nghiƯm chn qc tÕ vỊ LMLM (WRL), Pirbright, Anh Quốc QT3, QT5, QT8, QT10, QT12 mẫu bệnh phẩm biểu mô thu thập từ thực địa M thị phân tử Kết trình bày hình 4.5 cho thấy với cặp mồi 1F/1R P33/P38, phản ứng PCR cho kết dơng tính với mẫu chn nhËn tõ Phßng ThÝ nghiƯm WRL/FMD cđa Pirbright – ký hiƯu lµ P (giÕng 2, 4) vµ víi mÉu bƯnh phÈm thu thËp tõ QT – Ký hiƯu lµ QT (giếng 3, 5) Sản phẩm PCR đặc hiệu với cặp mồi 1F/1R có độ dài 328 cặp bazơ cặp mồi P33/P38 sản phẩm PCR có độ dài 420 cặp bazơ Kết trùng hợp với kết khác đà đợc công bố cặp mồi Kết hình 4.5 cho thấy: cặp mồi đặc hiệu type lại (P33/P40, P33/P74, P33/P87), phản ứng RT-PCR cho kết âm tính Điều chứng tỏ cặp mồi hoàn toàn đặc hiệu chúng không bắt cặp với chuỗi ADN khuôn tạo thành từ mÉu ARN chuÈn (giÕng 7, 9, 11) còng nh− mÉu ARN tách chiết từ mẫu bệnh phẩm thực địa (giếng 8, 10 12) Từ kết trên, cho bệnh phẩm mà thu thập đợc có chứa vi rút gây bệnh LMLM type O chúng có phản ứng RT-PCR dơng tính với cặp mồi 1F/1R (giếng 3), cặp mồi P33/P38 (giếng 5) nhng âm tính với cặp mồi đặc hiệu type lại (giếng 8, 10 12) 4.4.7 Kết ứng dụng phơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định typ vi rút gây bệnh LMLM từ bệnh phẩm thu thập từ thực địa Tổng số mẫu bệnh phẩm biểu mô mà trực tiếp thu thập từ ổ dịch nhận từ Chi cục Thú y, Trung tâm Thú y vùng Thành phố Hồ Chí Minh gửi đến 251 mẫu Nh nhận xét phần trên, thời gian chúng tối tiến hành nghiên cứu, mẫu bệnh phẩm đợc xác định mang vi rut LMLM thuéc typ A, C hay Asia-1 KÕt trùng hợp với thông báo Cục Thú y tháng năm 2004 thời điểm vi rút gây bệnh LMLM Việt Nam typ O dựa kết phơng pháp ELISA phat định type vi rút 58 Bảng 4.2 Chẩn đoán định typ vi rút LMLM từ bệnh phẩm thực địa Loại mẫu lợng Kết 1F/1R A 30 - số B 251 Sè P33/P38 % Sè l−ỵng P33/P74 % Sè l−ỵng 30 100 P33/P87 % Sè l−ỵng 30 100 + 0 0 - 33 13 83 33 + 218 87 168 67 30* 100 % Sè l−ỵng 30 100 P33/P40 l−ỵng 30 100 0 30* 100 % 30 100 30* 100 Chú thích: A: Bệnh phẩm "âm": tế bào BHK-21 không đợc gây nhiễm bệnh phẩm da mô bào động vật thu thập lò mổ B: Bệnh phẩm biểu mô động vật nghi bị bệnh LMLM thu thập từ thực địa * 30 mẫu bệnh phẩm thực địa lấy 15 mẫu âm tính với cặp mồi 1F/1R 15 mẫu dơng tính với cặp mồi 1F/1R 1F/1R: cặp mồi đặc hiệu chung (universal primers), P33/P38: cặp mồi đặc hiệu cho vi rút type O, P33/P74: cặp mồi đặc hiệu cho type Asia-1, P33/P87: cặp mồi đặc hiệu cho type typ A P33/P40: cặp mồi đặc hiệu cho type C Trong trình ứng dụng phơng pháp RT-PCR vào việc chẩn đoán mẫu bệnh phẩm từ thực địa, nhận thấy số thí nghiệm cho kết dơng tính với cặp mồi 1F/1R (đặc hiệu chung cho type O, A, C Asia-1) nhng âm tính với tất cặp mồi đặc hiệu cho type riêng biệt Những trờng hợp rơi vào mẫu bệnh phẩm lợn Chúng đà gửi mẫu sang Viện Công nghệ sinh học để tiến hành giải mà gen Kết so sánh với ngân hàng gen cho thấy c¸c mÉu bƯnh phÈm cã chøa vi rót LMLM thc typ O Nguyên nhân tợng độ nhạy cặp mồi P33/P38 cha cao với mẫu dịch phẩm từ lợn Việt Nam thuộc type O Cathay Do đó, cần phải tiến hành thêm thí nghiệm để tìm cho đợc cặp mồi thÝch hỵp nhÊt cho mÉu bƯnh phÈm cđa lỵn type O Cathay 4.4.8 Tách dòng giải trình trình tự đoạn gene mà hoá cho serotype O vi rut gây bệnh Lở mồm long móng thu thập tỉnh Qủang Trị Tiến hành tách dòng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCRTM2.1 với Kit HÃng Invitrogen biến nạp vào vi khuẩn E.coli chủng DH-5 Các khuẩn lạc E.coli có chứa đoạn ADN ngoại lai đợc tách từ khuẩn lạc riêng rẽ màu trắng phơng pháp miniprep sau đợc tuyển chọn 59 0 cách chạy điện di gel agarose % Chọn plasmid có kích thớc lớn plasmid gốc (tách từ khuẩn lạc màu xanh) Kết đợc trình bày hình 4.6 10 11 12 10 11 12 13 14 15 16 17 A B Hình 4.6: (A) Điện di gel agarose 1% để chọn plasmid mang gene đặc hiệu cho typ O Kênh từ 1-6 từ 8-12 plasmit tách từ khuẩn lạc màu trắng Kênh plasmit tách từ khuẩn lạc màu xanh (B) Điện di để chọn plasmit mang gene đặc hiệu chung để nhận biết typ O, A, C, Asia-1 Kênh từ 1-8 từ 10-17 plasmit tách từ khuẩn lạc màu trắng Kênh plasmit tách từ khuẩn lạc màu xanh Trong số plasmid kể trên, đà chọn plasmid có khả mang gene đặc hiệu cho typ O (Hình 4.6A) 10 plasmid có khả mang gene đặc hiệu chung để nhận biết type O, A, C, Asia-1 (Hình 4.6B) cắt enzym giới hạn EcoRI Sau đợc cắt enzym này, đoạn ADN ngoại lai đợc tách khỏi vectơ pCRTM2.1 Kết thực nghiệm đợc trình bày ë h×nh 4.7 M A M 10 11 B Hình 4.7 Điện di gel agarose 1% để kiểm tra plasmid có khả mang đoạn ADN ngoại lai sau đợc cắt enzym giới hạn EcoRI M thị phân tử (A) Các plasmit có khả mang đoạn gene đặc hiệu cho typ O Kênh từ 1-5 7-9 dòng plasmit đợc cắt EcoRI, kênh sản phẩm PCR trớc gắn vào vectơ tách dòng (B) Các plasmid có khả mang đoạn gene đặc hiệu chung để nhận biết typ O, A, C, Asia-1 Kênh từ 1-7 9-11 plasmid đợc cắt EcoRI Kênh sản phẩm PCR trớc gắn vào vectơ tách dòng Kết thực nghiệm trình bày hình 4.7A 4.7B cho thấy sau cắt enzym EcoRI đoạn ADN ngoại lai đợc tách khỏi vectơ pCRTM2.1 có độ dài tơng ứng với đoạn ADN trớc gắn vào vectơ Dựa vào kết trên, đà 60 thu đợc dòng plasmid mang đoạn ADN ngoại lai đặc hiệu cho type O dòng plasmid mang đoạn ADN ngoại lai đặc hiệu chung để nhận biết type O, A, C, Asia-1 Các dòng plasmit mang đoạn ADN ngoại lai đợc tinh chế cách kết tủa với PEG-6000 (Hình 4.8) trình tự nucleotid đợc xác đinh máy xác định trình tự ADN tự động Từ sản phẩm PCR với cặp mồi 1F/1R, tách dòng đoạn gene ký hiệu P1 P2 đại diện cho mẫu ARN chuẩn nhận từ Phòng Thí nghiệm chuẩn WRL, Pirbright đoạn gen P54 đại diện cho mẫu bệnh phẩm QT Với cặp mồi P33/P38, đà tách dòng đoạn gene khác P9 đại diện cho mẫu ARN nhận từ Phòng Thí nghiệm chuẩn WRL, Pirbright P55 đại diện cho mÉu bÖnh phÈm tõ QT P1 P2 P54 P9 P55 Hình 4.8 Kết tinh dòng plasmid mang đoạn ADN ngoại lai PEG 6000 Kết giải trình trình tự nuclêotide Trình tự đoạn gene kể đợc so sánh với trình tự đoạn gene vi rút LMLM đà đăng ký ngân hàng liệu gene chơng trình FASTA địa chỉ: http://www.ebi.ac.uk/ Kết cho thấy: P1 có độ tơng đồng cao 97.256 %; P2: 97.866 %; P54: 95.427 %; P9: 99.005 %, vµ P55: 96.766 % so với trình tự đà đợc công bố Ngân hàng liệu gene Điều chứng tỏ mẫu ARN nhận từ Phòng Thí nghiệm WRL, Pirbright đợc chiết t¸ch tõ bƯnh phÈm cã chøa vi rót LMLM type O mẫu bệnh phẩm từ QT mà thu thập đợc chứa vi rút type O 4.4.9 Kết phân lập vi rút tế bào dòng BHK-21 61 Nuôi cấy trì tế bào BHK-21 Sau nuôi cấy tế bào BHK-21, nhận thấy đặc điểm, hình thái, tính chất tế bào BHK-21 không thay đổi so với tế bào gốc đợc nhận từ Pháp Các kết nuôi cấy, trì, bảo quản hồi phục tế bào phù hợp với tính chất dòng tế bào mà tác giả nớc đà mô tả Một sau tiến hành nuôi cấy, quan sát dới kính hiển vi quang học thấy tế bào bắt dầu bám dính xuống bề mặt đáy chai Sau khoảng 6-9 tế bào phát triển dài đầu bám dính với Sau từ 24- 48 tế bào bám thành lớp xuống bề mặt đáy chai kết nối với thành hình mạng, có cụm tế bào mọc chồng lên Kết nuôi cấy tế bào đợc ghi lại Hình 4.9 Hình 4.9A 24 sau nuôi cấy Hình 4.9B 48 sau nuôi cấy Kết trì, bảo quản, hồi phục sử dụng tế bào BHK-21 nghiên cứu vi rút gây bệnh LMLM đà đợc đăng Ký yếu 35 năm nghiên cứu phát triển Viện Thú y (1969-2004) đợc đăng T¹p chÝ Khoa häc Kü tht Thó y số năm 2005 (Trần Thị Thanh Hà cs, 2005) Gây nhiễm bệnh phẩm nghi vi rút LMLM lên tế bào BHK-21 Kết gây nhiễm đợc chụp lại thời điểm khác với CPE điển hình (xem hình 4.10) Hình 4.10A 48 h sau gây nhiễm Hình 4.10B 72 h sau gây nhiễm 62 Tiến hành phơng pháp RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho vi rút LMLM type O với kết thu đợc dơng tính, kết luận đà gây nhiễm phân lập thành công vi rút gây bệnh LMLM từ bệnh phẩm gia súc mắc bệnh QT lên tế bào Kết chi tiết đợc trình bày ấn phẩm đăng Tạp Chí Khoa học Kỹ thuật Thú y với tiêu đề Phân lập vi rút Lở mồm long móng từ ổ dịch tỉnh QT (Xem phần Phụ Lục) So sánh chẩn đoán vi rút gây bệnh LMLM RT-PCR từ bệnh phẩm biểu mô từ bệnh phẩm biểu mô đà cấy chuyển tế bào Bệnh phẩm biểu mô lấy từ gia súc có triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh LMLM từ thực địa sau kiểm tra phản ứng RT- PCR cho kết dơng tính, đà đợc Bộ Môn HS-MD-BL Viện Thú- y gây nhiễm thành công tế bào dòng BHK-21 Khi tế bào xuất CPE (bệnh tích tế bào) nghi vi rút LMLM gây với biểu hiện: tế bào co tròn lại bong tróc khỏi bề mặt đáy chai, lên trên, chiết tách ARN từ phần tế bào bị nhiễm tiến hành làm phản ứng RT- PCR với mẫu ARN (Hình 4.11) Hình 4.11A KÕt qu¶ RT-PCR víi mÉu bƯnh phÈm tr−íc nuôi cấy TB Hình 4.11B Kết RT-PCR với mẫu bệnh phẩm sau nuôi cấy TB Chúng nhận thấy: Các mẫu ARN chiết tách từ tế bào đợc gây nhiễm bệnh phẩm thu thập từ thực địa cho sản phẩm PCR băng ADN sáng hơn, gọn sắc nét so với mẫu ARN chiết tách từ bệnh phẩm thực địa cha gây nhiễm lên tế bào Từ kết đó, cho mẫu ARN chiết tách từ tế bào đợc gây nhiễm bệnh phẩm thực địa có độ tinh khiết cao so với mẫu ARN chiết tách từ bệnh phẩm thực địa Điều hoàn toàn phù hợp với phơng diện lý thuyết: sau nuôi cấy vi rút LMLM môi trờng tế bào với điều kiện đặc biệt mẫu ARN chiết tách 63 đợc tinh lọc hơn, không bị tạp lẫn thành phần khác mô bào, đồng thời với kết ứng dụng phơng pháp RT-PCR để chẩn đoán bệnh phẩm nghi từ thực địa nh đà trình bày phần 4.4.10 Kết so sánh phơng pháp ELISA RT-PCR để chẩn đoán-định typ virut LMLM Để sánh độ nhạy phơng pháp ELISA phơng pháp RT-PCR, đà phối hợp với TTTYVTPHCM tiến hành thực nghiệm TTTYVTPHCM đà gửi cho 17 bệnh phẩm (Bảng 4.3) đợc đánh số thứ tự nhng không ghi kết ELISA Chúng đà tiến hành phơng pháp RT-PCR bệnh phẩm gửi kết phơng pháp RTPCR lại cho TTTYVTPHCM (Hình 4.12) Sau nhận đợc kết RT-PCR, TTTYV TPHCM gửi lại cho kết phơng pháp ELISA đói Hình 4.12 Kết RT-PCR 17 bệnh phẩm với bệnh phẩm đà đợc đánh TTTYVTPHCM Giếng 12 thị phân tử, số kể Trong số 17 bệnh giếng 17 đối chứng âm (tế bào BHK-21 không phẩm, có 15 bệnh phẩm biểu đợc gây nhiễm) giếng 20 đối chứng dơng mô mụn nớc gia súc nghi (virut LMLM typ O phân lập QT) lại bệnh mắc bệnh LMLM bệnh phẩm giếng 18 vµ 19 lµ bƯnh phÈm tÕ bµo phÈm lµ tế bào đợc gây nhiễm đợc gây nhiễm virut LMLM typ O với bệnh phẩm đợc xác định phơng pháp ELISA có chứa virut LMLM typ O Từ hai kết này, sơ so sánh độ nhạy hai phơng pháp (Bảng 4.3) Kết phơng pháp RT-PCR cho thấy, số 17 bệnh phẩm , có 15 bệnh phẩm cho kết dơng tính với cặp mồi 1F/1R bênh phẩm cho kết âm tính với cặp mồi (bệnh phẩm số 6) Trong thí nghiệm đà sử dụng cặp mồi 1F/1R cặp mồi đặc hiệu chung cho tất virut LMLM (7 typ) Tiếp theo đó, đà dùng cặp mồi P33/P38 đặc hiệu với typ O virut LMLM bệnh phẩm kết cho thấy mẫu dơng tính với cặp mồi 1F/1R virut typ O (kết không trình bày) 64 Bảng 4.3 So sánh phơng pháp ELISA RT-PCR bệnh phẩm TTTYVTP HCM S T T 10 11 Ký hiƯu mÉu Lo¹i bÖnh phÈm 13-06-03-01 BM* 13-06-03-02 BM 13-06-03-03 BM 13-06-03-04 BM 13-06-03-05 BM 13-06-03-06 BM 13-06-03-07 BM 13-06-03-08 BM 13-06-03-09 BM 13-06-03-10 BM 13-06-03-11 BM 12 13 14 15 13-06-03-12 13-06-03-13 13-06-03-14 13-06-03-15 16 99- 174 TB 17 03-030 TB BM BM BM BM TB** TB ELISA + + + + + + + KÕt qu¶ RT-PCR Primers 1F/1R + + + + + + + + + + + + + + + + + + + *** + + + Ghi Chi tiết phơng Số thứ tự pháp RT-PCR trªn Gel 10 11 Chỉ thị phân tử 12 13 14 15 16 Đối chứng âm 17 o Sử lý 56 /60p 18 Sư lý 56o/60p 19 BƯnh phÈm QT 20 Ghi chú: *Biểu mô mụn nớc, ** Tế bào đợc gây nhiễm, *** Không làm Kết phơng pháp ELISA (Bảng 4.3) cho thấy số 17 bệnh phẩm, có 12 bệnh phẩm cho phản ứng dơng tính bệnh phẩm cho kết âm tính (bệnh phÈm 1, 3, 6, vµ 13) Cã thĨ thÊy rõ bệnh phẩm âm tính với hai phơng pháp bệnh phẩm (1, 3, 7, 13) dơng tính với phơng pháp RT-PCR Từ kết trên, bớc đầu kết luận phơng pháp RT-PCR nhậy phơng pháp ELISA việc chẩn đoán-định typ virut gây bệnh LMLM Để có kết luận xác, cần tiến hành hai phơng pháp với số lợng mẫu lớn 65 Chơng IV Kết luận đề nghị Kết luận Trong thời gian ba năm thực đề tài, với nỗ lực lớn - có lý khách quan trình thực đề tài, đặc biệt bệnh Cúm gia cầm xtừ cuối năm 2003 nay, tập thể cán chủ trì đề tài thành viên tham gia đề tài nhánh đà tích cực hoàn thành nội dung nghiên cứu đà đề Những kết nghiên cứu mà đề tài đà thu đợc, nh đà nêu tự đánh giá biểu qua đợt kiểm tra định kỳ Đề tài, vừa có ý nghĩa mặt khoa häc võa cã ý nghÜa vỊ mỈt thùc tÕ đợc tóm tắt lại nh sau: I Các tiêu sản phẩm Số lợng vắc xin sản xuất thử nghiệm vợt yêu cầu (yêu cầu 3000 liều vắc xin loại) vắc xin sản xuất công nghệ vi khuẩn Đối với vắc xin tái tổ hợp, Chủ trì đề tài nhánh đà có thuyết trình công nghệ sản xuất vắc xin tái tổ hợp với số lợng lớn nh điều kiện trang thiết bị phù hợp với nghiên cứu sản xuất qui mô nhỏ dới 1000 liều Phơng pháp RT-PCR ứng dụng để chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM phơng pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao so với phơng pháp ELISA phơng pháp đợc sử dụng thực tế chẩn đoán Việt Nam II Về nội dung phơng pháp sử dụng Những nội dung nghiên cứu Đề tài hoàn toàn với sau - Tìm công thức vắc xin chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò có hiệu lực phòng hộ cao so với vắc xin có - Vắc xin vô hoạt phòng chống vi khuẩn Salmonella enteritidis Salmonella typhimurium lần đợc nghiên cứu chế tạo Việt Nam 66 ... xin nhợc độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm ứng dụng kỹ thuật gen xác định type vi rut lở mồm long móng (LMLM)" Các mục tiêu Đề tài là: - Tạo công nghệ sản xuất vắc xin nhợc độc, biến... súc, gia cầm ứng dụng kỹ thuật gen xác định loại vi rut Lở mồm Long móng (LMLM) Mà số: KC.04.06 Thuộc Chơng trình Khoa học Công nghệ cấp Nhà nớc KC.04 nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ sinh... Phân Vi? ??n TY NT 15 ĐH Nông lâm Thủ §øc 16 Trung t©m kiĨm tra VƯ sinh Thó y TW2 tóm tắt Báo cáo Đề tài: Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhợc độc vô hoạt phòng bệnh cho giá súc, gia