Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut lở mồm long móng (LMLM)

Để thực hiện các mục tiêu của Đề tài theo như Hợp đồng đã yêu cầu, chúng tôi đã lựa chọn; với sự chấp thuận của Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi Trường, 4 đề tài nhánh xem Bảng 1 với các nộ

86, Đường Trường Chinh - Đống Đa – Hà Nội

Báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.06:

Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác

định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM)

Chủ nhiệm đề tài: TS Tô Long Thành

6102

19/9/2006

Hà Nội – 2005

Bản quyền 2005 thuộc Viện Thú y

Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện trưởng Viện Thú y trừ trường hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu.

Bộ KH CN

Viện Thú y

Mục lục

Trang

1.1.1 Vài nét về lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng 24

1.1.1.1 Lịch sử nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trên thế giới 24

1.1.1.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam 25

1.1.2 Tóm lược về nghiên cứu vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng 26

1.1.3 Vi khuẩn Pasteurella multocida 27

1.1.3.1 Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn P multocida 27

1.1.3.2 Đặc tính hình thái của vi khuẩn 27

1.1.3.3 Tính chất bắt màu của vi khuẩn 28 1.1.3.4 Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn P multocida 28 1.1.3.5 Đặc tính sinh hoá của Pasteurella multocida 31

1.1.3.6 Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida 32

1.1.3.7 Độc tố của Pasteurella multocida 32 1.1.4 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 33

1.1.4.1 Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen) 33

1.1.4.2 Kháng nguyên thân (O) - Somatic antigen 34

1.1.5 Các type huyết thanh học của P multocida 35

1.2 Bệnh và vấn đề an toàn, vệ sinh thực phẩm do vi khuẩn Salmonella

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella 37

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 39

1.2.4 Tình trạng ngộ độc thức ăn do Salmonella 41

1.2.6 vắc-xin chống Salmonella cho gà 43

1.2.6.1 Một số loại vaccine chống Salmonella 43

1.2.6.2 Sơ lược về kháng nguyên roi của S typhimurium 44

1.2.6.3 Kháng nguyên roi của Salmonella typhimurium có

1.2.6.4 Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein flagellin 46

1.3.1 Bệnh Lở mồm Long móng và tình hình

nghiên cứu về bệnh trong, ngoài nước 47

1.3.1.1 Bệnh Lở mồm Long móng, tình hình bệnh

trên thế giới và ở Việt Nam 47

1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới 49

1.3.1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trong nước 51

1.3.3.2 Đại cương về chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 53

1.3.3.3.1 Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) 54 1.3.3.3.2 Phản ứng trung hoà vi rút 55

2.1 Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng

2.1.2 Vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng 58

2.2 Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S enteritidis và

2.2.1 Động vật và sản phẩm động vật 59

2.2.2 Các loại môi trường thông thường 59

2.2.3 Các loại môi trường chuyên biết 60

2.2.4 Các trang thiết bị phòng thí nghiệm cần thiết khác 62

2.3 Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và

2.3.4 Môi trường nuôi cấy 63

2.4.4 Tế bào BHK- 21 và môi trường nuôi cấy tế bào 65

2.4.5 Hoá chất, vật liệu và thiết bị để tiến hành phản ứng RT-PCR. 65

2.4.5.2 Các hoá chất, vật liệu cần thiết tiến hành phản ứng RT-

3.1 Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ

huyết trùng trâu bò chất lượng cao

66

3.1.1 Kiểm tra giống vi khuẩn dùng để nghiên cứu và sản xuất

3.1.2 Xác định đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hoá của vi

khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò chủng IR 67

3.1.3 Kiểm tra độc lực của vi khuẩn đối với chuột nhắt trắng 69

3.1.4 Sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có chất bổ trợ keo phèn – Saponin. 71

3.1.5.3.2 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của vacxin đối với trâu, bò. 72

3.1.6.1 Phương pháp tính chỉ số miễn dịch 76 3.1.6.2 Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê 76

3.2 Sản xuất vắc xin phòng chống S enteritidis và S typhimurium

3.2.1 Các phương pháp vi sinh vật học thông thường 77

3.2.2 Các phương pháp sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin 77

3.3 Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và S typhimurium

3.3.1 Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn 78

3.3.2 Phương pháp tổng hợp chuỗi (PCR) 78

3.3.3 Xử lý ADN bằng enzym hạn chế 78

3.3.6 Tách chiết ADN plasmid từ E coli 80

3.3.7 Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp 81

3.3.8 Biến nạp plasmid vào nấm men P pastoris bằng xung điện. 82

3.4.1 Các phương pháp chẩn đoán, định typ vi rút LMLM của

Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế 84

3.4.2 Phương pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm. 84

3.4.3 Phương pháp RT-PCR để chẩn đoán định type vi rút LMLM. 86

3.4.3.1 Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô 86

3.4.3.2 Tạo cADN bằng phản ứng sao chép ngược 86

3.4.4 Tách dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho serotype O

của vi rút gây bệnh LMLM phân lập tại Việt nam 88

3.4.4.1 Lai sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCRR2.1 và biến nạp

vào tế bào khả biến (competent E coli cells) 88

3.4.5 Phương pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút gây bệnh LMLM 90

3.4.5.1 Phương pháp nuôi tế bào BHK-21 (Baby Hamster Kidney - 21) 90

3.4.5.2 Phương pháp tách tế bào bám dính 90

3.4.5.3 Phương pháp gây nhiễm vi rút LMLM lên tế bào BHK-21 90

Chương III Kết quả nghiên cứu và thảo luận 92

4.1 Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ

4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ

trâu bò chết của các địa phương 92

4.1.2 Tính tương đồng kháng nguyên giữa vi khuẩn P multocida

chủng IR với đại diện các chủng P multocida phân lập được 95

4.1.3 Kết quả xác định liều kháng nguyên thích hợp kích thích khả

năng sản sinh miễn dịch tốt nhất trên trâu bò

96

4.1.4 Kết quả xác định công thức bổ trợ thích hợp và theo dõi độ

dài miễn dịch của vắc xin keo phèn-saponin

97

4.1.5 Kết quả chế vắc xin tụ huyết trùng trâu bò keo phèn-

saponin chủng IR

98

4.1.6 Tính tương đồng kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida

chủng IR với các chủng P multocida khác đang sử dụng chế vắc xin THT

4.2 Sản xuất vắc xin phòng chống S enteritidis và S typhimurium

4.2.1 Kết quả điều tra một vài đặc điểm dịch tễ tại 4 cơ sở chăn

4.2.2 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp 100

4.2.3 Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn

4.2.4 Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập

4.2.5 Kết quả thử khả năng mọc của các chủng Salmonella trên

các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau 105

4.2.6 Kết quả thử đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella 106

4.2.7 Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập

4.2.10 Kết quả thử thuần khiết vacxin 108

4.2.11 Kết quả thử vô trùng của vacxin 108

4.2.12 Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trắng 109

4.2.13 Kết quả thử an toàn trên gà mái hậu bị 110

4.2.14 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 110

4.2.15 Kết quả thử nghiệm hiệu lực của vác xin trên gà 111

4.2.16 Thí nghiệm xác định liều sử dụng của vacxin 111

4.3 Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S enteritidis và S typhimurium

bằng vi khuẩn biến nạp

113

4.3.1 Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E coli BL21 113

4.3.1.1 Đưa gen vào vectơ pCR2.1 113

4.3.1.1.3 Đưa sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1 115

4.3.1.2 Đưa gen vào vectơ biểu hiện pET22b(+) 119

4.3.1.3 Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E coli BL21 120

4.3.2 Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong nấm men P pastoris 122

4.3.2.2 Đưa gen vào vectơ tách dòng pCR2.1 123

4.3.2.3 Đưa gen vào vectơ biểu hiện pPIC9 123

4.3.2.4 Biểu hiện gen trong nấm men P pastoris 125

4.3.3.1 Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp FliC 126

4.3.3.2 Gây miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp FliC và kháng

nguyên toàn phần trên gà hậu bị 127

4.3.4 Tinh sạch protein tái tổ hợp GM3 131

4.3.5 Nghiên cứu khả năng bảo hộ của protein tái tổ hợp Flic3 và Gm3 132

4.4.1 Khái quát tình hình dịch bệnh LMLM tại Việt Nam

trong vòng 5 năm trở lại đây thời gian gần đây 134

4.4.2 Diễn biến lâm sàng của bệnh trên bò và lợn 136

4.4.3 Thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm từ gia súc

4.4.3.1 Thu thập bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 138 4.4.3.2 Vận chuyển bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139 4.4.3.3 Bảo quản mẫu bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139 4.4.4 Thiết lập phương pháp RT–PCR để phát hiện vi rút

gây bệnh LMLM bằng mẫu ARN đã biết 140

4.4.5 Chẩn đoán định type các mẫu bệnh phẩm thu thập

tại tỉnh Qủang Trị

143

4.4.6 Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi dùng

trong chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM

145

4.4.7 Kết quả ứng dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán định

typ vi rút LMLM từ các bệnh phẩm thu thập từ thực địa

147

4.4.8 Tách dòng và giải trình trình tự đoạn gene mã hoá cho

serotype O của vi rut LMLM thu thập tại tỉnh Qủang Trị

149

4.4.8.1 Tách dòng đoạn gene đặc hiệu chung để nhận biết các

type O, A, C, và asia-1 và đoạn gene đặc hiệu cho typ O 149

4.4.8.2 Kết quả giải trình trình tự nuclêotide 151 4.4.9 Kết quả phân lập vi rút trên tế bào dòng BHK-21 153

4.4.9.1 Điều kiện làm việc với vi rút LMLM 153 4.4.9.2 Kết quả nuôi cấy và duy trì tế bào BHK-21 153

4.4.9.3 Kết quả gây nhiễm bệnh phẩm nghi có chứa vi rút

III VÒ gi¶i ph¸p khoa häc c«ng nghÖ 164

Các đề tài nhánh của đề tài kc.04.06

nhiệm đề tài nhánh

1 KC.04.06.01

Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao

ThS Hoàng Xuân Nghinh

4 KC.04.06.04

Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR)

TS Tô Long Thành

Viện Thú y

Danh s¸ch c¸n bé tham gia

chuyªn m«n

C¬ quan c«ng t¸c

20 Th¸i Kim Thanh KTV ViÖn Thó y

21 Hoµng Quang Tháa Th.S TT Thó y vïng Hµ Néi

24 NguyÔn ThÞ Hoa Lý TS Trung t©m kiÓm tra VÖ

sinh Thó y TW2

30 NguyÔn ThÞ Trung Th.S ViÖn C«ng nghÖ SH

Danh sách các đơn vị tham gia, phối hợp

8 Chi Cục Thú y tỉnh Thái Bình

10 Chi Cục Thú y tỉnh Thừa Thiên Huế

11 Chi Cục Thú y tỉnh Quảng Trị

- Tạo công nghệ sản xuất vắc xin nhược độc biến nạp gen phòng bệnh cho gà

- Tạo chủng vi khuẩn tụ huyết trùng để sản xuất vắc xin

- Định type vi rut LMLM để lựa chọn vắc xin phù hợp

Đề tài được thực hiện từ tháng 11 năm 2001 và kết thúc vào tháng 12 năm 2004 với tổng số kinh phí là 2700 triệu đồng trong đó kinh phí từ ngân sách nhà nước là 2600 triệu đồng

Để thực hiện các mục tiêu của Đề tài theo như Hợp đồng đã yêu cầu, chúng tôi

đã lựa chọn; với sự chấp thuận của Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi Trường, 4 đề tài nhánh (xem Bảng 1) với các nội dung nghiên cứu khác nhau nhằm đưa ra các công nghệ sản xuất thích hợp để có được các loại vắc xin sẽ được sử dụng trong phòng chống bệnh Tụ huyết trùng trâu bò – là bệnh gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi trâu bò

của nước ta và vấn đề ô nhiễm thực phẩm do Salmonella enteritidis và Salmonella typhi

murium gây ra ở các sản phẩm của từ gia cầm – đây là những mầm bệnh có tầm quan

trọng về y tế, đặc biệt liên quan đến vấn đề an toàn thực phẩm Đối với bệnh Lở mồm Long móng (LMLM) – là một bệnh đặc biệt nguy hiểm của động vật guốc chẵn, mục tiêu của đề tài là thiết lập phương pháp chẩn đoán-định type vi rút gây bệnh LMLM bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR) Một trong những ứng dụng thực tiễn của phương pháp này là xác định type vi rút gây bệnh LMLM một cách nhanh chóng và chính xác để lựa chọn và sử dụng vắc xin thích hợp

Bảng 1 Phân công chủ đề nghiên cứu và Chủ trì các Đề tài nhánh

1 KC.04.06.01

Nghiên cứu phát triển

và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất lượng cao

Hoàng Xuân Nghinh Viện TY

Đề tài bắt đầu được thực hiện vào cuối tháng 10 năm 2001 và kết thúc vào tháng

12 năm 2004 theo như thời lượng cho phép của Hợp đồng Nhìn chung, theo kế hoạch nghiên cứu đã được xác định cho từng năm, các đề tài nhánh đều hoàn thành công việc

đúng tiến độ Kết quả của từng đề tài nhánh mà chúng tôi tập hợp sau đây sẽ chứng

nhiệm chương trình KC-04 đã thống nhất đánh giá và ghi nhận những cố gắng đã đạt

được của các đề tài nhánh thực hiện trên đối tượng gia cầm nhằm hoàn thành các nội dung của đề tài theo đúng tiến độ đề ra Chúng ta đều biết trong thời gian thực hiện đề tài, dịch cúm gia cầm do vi rút H5N1 nổ ra vào cuối năm 2003 và vẫn âm ỉ cho đến hiện nay đã gây ảnh hưởng không nhỏ đến việc thực hiện các thực nghiệm trên bản

Bằng việc phân lập vi khuẩn P multocida gây bệnh Tụ huyết trùng trâu bò từ

trâu bò bị bệnh tại một số địa phương trong nước và so sánh tính tương đồng kháng nguyên của chúng với các chủng vi khuẩn hiện đang được sử dụng để chế tạo vắc xin,

các tác giả đã lựa chọn chủng IR của vi khuẩn P multocida để chế tạo vắc xin Đề tài

nhấn mạnh vào hai yếu tố nhằm nâng cao hiệu quả của vắc xin: (i) xác định liều kháng nguyên kích thích sinh miễn dịch tốt nhất và (ii) cải tiến công thức của chất bổ trợ, dùng hỗn hợp saponin và keo phèn để tạo đáp ứng miễn dịch cao và độ dài miễn dịch tốt hơn so với các vắc xin đang được sử dụng trong nước Sau khi thử nghiệm vắc xin với kết quả khả quan ở một số địa phương như Phú Thọ và Bắc Giang, vắc xin đã được kiểm nghiệm tại Cục Thú y với kết quả đạt yêu cầu

Các kết quả thu được được tóm tắt như sau:

- Phân lập được 16 chủng vi khuẩn Pasteurella multocida từ trâu bò chết ở một

số địa phương trong nước

- Chọn vi khuẩn Pasteurella multocida chủng IR là chủng gốc để chế vắc xin

- Xác định tính tương đồng kháng nguyên giữa vi khuẩn Pasteurella multocida

chủng IR với các chủng đại diện phân lập được từ các địa phương

- Xác định liều kháng nguyên thích hợp là 25 tỷ vi khuẩn/1 liều vắc xin

- Công thức bổ trợ thích hợp: Saponin 1%, keo phèn 20%

- Độ dài miễn dịch chắc chắn của vắc xin trên bản động vật: ít nhất 6 tháng

- Có thể dùng các vi khuẩn Pasteurella multocida chủng IR; 4 chủng: Pb1,

Pb2, Pbu1, Pbu2; chủng P52 để chế vắc xin

- Vắc xin được kiểm nghiệm cấp quốc gia: Đạt yêu cầu

Trong quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu đã đề ra, đề tài đã tiếp nhận 5 sinh viên đại học Thú y thực tập tốt nghiệp với kết quả bảo vệ báo cáo tốt nghiệp đạt kết quả cao (xem Phụ Lục)

2 KC.04.06.02: Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S enteritidis và S typhi

murium bằng công nghệ vi khuẩn

Đề tài được tiến hành với bước điều tra cơ bản nhằm xác định tỷ lệ nhiễm vi

khuẩn Salmonella spp trên các đối tượng gia cầm của một số trại chăn nuôi Từ những chủng Salmonella phân lập được, các tác giả đã định type và lưu giữ được các chủng vi khuẩn S typhi murium và S enteritidis Bằng các kỹ thuật vi sinh vật học, các tác giả đã chọn được một chủng S typhi murium và một chủng S enteritidis để sản xuất vắc xin

vô hoạt kep phèn Kết quả thử nghiệm vắc xin cho thấy vắc xin bảo hộ tốt cho chuột và

an toàn cho gà được dùng vắc xin

Các kết quả cụ thể như sau:

- Đã xác định được tỉ lệ nhiễm Salmonella spp trên gà và vịt ở miền Bắc, miền Trung và miền Nam Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên gia cầm của Việt Nam la 4,24%

- Đã phân lập và định týp được 2 chủng Salmonella typhi murium (7,55%) và Salmonella enteritidis (1,80%) trong tổng số vi khuẩn Salmonella phân lập được

- Đã thử độc lực và khả năng sống sót của 13 chủng vi khuẩn phân lập được

- Xác định được chỉ tiêu LD50 của 13 chủng phân lập được với kết quả từ 10-2,7

đến 10-3,2

- Chọn được 2 chủng S enteritidis (E17) và S typhi murium (T6) có các đặc

tính sinh vật hóa học điển hình, có độc lực cao, khả năng sống sót cao để sản xuất vacxin vô hoạt keo phèn

- Đã sản xuất thử nghiệm thành công 2 loại vacxin vô hoạt keo phèn S enteritidis (E17) và S typhi murium (T6), với kết quả bảo hộ tốt trên chuột nhắt trắng

và an toàn trên gà thí nghiệm

- Đã xác định được liều vacxin có hiệu giá kháng thể cao nhất là 2,5 ml/ con

Trong quá trình thực hiện, đề tài đã tiếp nhận 1 sinh viên đại học Thú y thực tập tốt nghiệp và 1 hoạc viên thạc sỹ Đề tài đã công bố 2 bài báo (xem Phụ Lục)

3 KC.04.06.03: Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S enteritidis và S typhi

murium bằng vi khuẩn biến nạp

Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, các tác giả đã tách dòng các đoạn gen mã

hóa cho kháng nguyên lông H:i của vi khuẩn S typhi murium, H:g,m và kháng nguyên lông sef14 của vi khuẩn S enteritidis Các đoạn gen này đã được biểu hiện trong vi khuẩn E Coli và khả năng sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp FliC3 và

Gm3 được xác định là tương tự như kháng nguyên tự nhiên Thử nghiệm công cường

độc cho gà được dùng vắc xin tái tổ hợp cho thấy vắc xin tái tổ hợp bảo hộ được cho gà

chống lại vi khuẩn Salmonella

Các kết quả thu được như sau:

- Đã tách dòng thành công các đoạn gen mã hoá cho kháng nguyên roi H:i của

vi khuẩn S typhi murium, H:g,m và kháng nguyên lông sef14 của vi khuẩn S Enteritidis

- Biểu hiện thành công gen mã hoá kháng nguyên roi của S typhi murium và S enteritidis trong vi khuẩn E Coli BL21

- Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp FliC3 và Gm3

được xác định là tương tự như kháng nguyên tự nhiên

- Đã tạo thành công vacxin tái tổ hợp chống Salmonella ở gà

Thêm vào đó: Đề tài đã đào tạo được 2 sinh viên đại học và 1 thạc sỹ khoa học,

được nhận giải Báo cáo Khoa học ấn tượng của Hội Nghị Công nghệ sinh học toàn quốc năm 2003, Giải nhì Hội nghị Khoa học Thanh niên của Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Đề tài đã công bố 03 ấn phẩm (xem Phụ Lục) có liên quan đến nội dung khoa học của đề tài

4 KC.04.06.04: Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR

Với hơn 250 bệnh phẩm thu thập được từ các ổ dịch của trâu bò và lợn nghi là mắc bệnh Lở mồm Long móng (LMLM), lần đầu tiên ở Việt Nam, các tác giả đã áp dụng thành công kỹ thuật RT-PCR nhằm chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM Thêm vào đó, các tác giả đã phân lập thành công vi rút gây bệnh LMLM từ bệnh phẩm thu thập ở một số địa phương trên nuôi cấy tế bào dong BHK-21 và đây chính là phương pháp làm tăng số lượng vi rút và sau đó tiến hành định type bằng phương pháp RT-PCR từ những bệnh phẩm chất lượng kém hoặc số lượng vi rút trong bệnh phẩm không đủ để tiến hành ngay phương pháp RT-PCR

Các kết quả cụ thể đã thu được như sau:

- Đã ứng dụng thành công phương pháp RT-PCR trong điều kiện trang thiết bị và nghiên cứu của Việt Nam với các mẫu ARN chuẩn chiết tách từ vi rút LMLM của Việt Nam, nhận từ Phòng thí nghiệm Tham chiếu về bệnh LMLM Pirbright, Anh quốc

- Đã sử dụng phương pháp RT-PCR đối với bệnh phẩm biểu mô thu thập từ gia súc (trâu, bò, lợn) nghi mắc bệnh LMLM với kết quả của phương pháp đạt độ đặc hiệu cao Trong trường hợp chỉ cần xác định mầm bệnh có phải là vi rút gây bệnh LMLM hay không, chỉ cần sử dụng cặp mồi 1F/1R dặc hiệu chung cho tất cả các typ vi rút gây bệnh LMLM nhằm có câu trả lời nhanh nhất để triển khai các biện pháp khống chế bệnh

- Đã duy trì, bảo quản và phục hồi tế bào BHK-21 một cách dễ dàng và nó trở thành nguyên liệu quí cho các nghiên cứu sâu hơn về vi rút LMLM Sử dụng tế bào này, đã phân lập thành công vi rút gây bệnh LMLM ở tỉnh Quảng Trị và đã khẳng định đây là một vi rút typ O bằng phương pháp RT-PCR Đây là một phương pháp thay thế trong trường hợp số lượng vi rút trên bệnh phẩm thấp, cần gây nhiễm lên tế bào cảm thụ để tăng số lượng vi rút và sau đó tiến hành định type bằng phương pháp RT-PCR

Thêm vào đó, đề tài đã hướng dẫn 3 sinh viên đại học Thú y, 1 Thạc sỹ Thú y và công bố 4 bài báo (xem phần Phụ Lục)

dNTP Deroxyribonucleotide 5’-triphosphates DTT Dithiothretiol

EDTA Ethylen diamin tetra axit axetic

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FAO Food and Agricultural Organization FCS Fetal Calf Serum

FMD Foot and Mouth Disease

RT-PCR Reverse Trancription- Polymerase Chain Reaction

Taq pholymerase Polymerase cña Thermus aquaticus

TCID50 50% Tissue Culture Infectious Dose

Trypsin- EDTA Ethylene- Diamine- Tetra-Acetate WRL World Reference Laboratory X-gal 5-Bromo-4chlorua-3 indolyl-β-O galactosyranozit

Lời nói đầu

Lịch sử nghiên cứu và phát triển vắc xin đã có chiều dài hơn 200 năm kể từ lần

đầu tiên khi Edward Jenner thử nghiệm dùng vắc xin chống bệnh đậu mùa cho cậu bé James Phipps tám tuổi sống tại một làng quê nước Anh vào năm 1795 Nhờ đó mà cậu

bé đã được cứu sống khi dịch bệnh đã lan rộng, cướp đi sinh mạng của bao người Cách phòng bệnh như vậy trên thực tế đã tồn tại trong dân gian của các nước Trung Quốc, ấn

Độ, và Ba Tư từ hơn một ngàn năm trước Tuy nhiên, Jenner là nhà khoa học đầu tiên

đã xem xét vấn đề một cách có hệ thống, vì vậy ông được xem là người khởi đầu cho ngành vắc-xin học Gần một thế kỉ sau, vào năm 1885, Louis Pasteur đã chế tạo thành công vắc xin chống bệnh dại và đã chứng minh khả năng bảo vệ cơ thể chống lại bệnh truyền nhiễm bằng chính tác nhân gây bệnh đó nhưng đã bị làm suy yếu đi hoặc đã bị giết chết Qua các công trình nghiên cứu, Pasteur đã phát hiện ra vai trò của các vi sinh vật trong thế giới sống Nhờ đó, ông không chỉ đánh đổ được thuyết tự sinh duy tâm mà còn đặt nền móng cho sự phát triển của ngành vắc-xin học hiện đại Loại vaccine này

đã được sử dụng rộng rãi vào cuối thế kỷ XIX tuy nhiên khả năng phòng bệnh của loại vắc xin này chưa cao

Với đặc điểm của ngành Thú y, phòng bệnh luôn được coi là là tốt hơn điều trị, nên có thể nói vắc xin hiện nay vẫn được coi là biện pháp chủ yếu để phòng bệnh cho gia súc và gia cầm Việc điều trị gia súc và gia cầm, ngoài tốn kém về chi phí thuốc còn

có thể gây nên hiện tượng kháng thuốc kháng sinh đối với vi sinh vật và tạo nên các chất tồn dư trong sản phẩm động vật mà nó có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của người tiêu dùng Hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi rõ ràng phụ thuộc nhiều vào việc phải hay không phải điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm

Trong số các loại vắc xin dùng trong y học nói chung và thú y học nói riêng, hai loại được dùng phổ biến là vắc xin vô hoạt (vi sinh vật đã được giết chết) và vắc xin nhược độc (vi sinh vật vẫn còn sống nhưng không có khả năng gây bệnh) Mặc dù trước

đây vắc xin nhược độc được coi là tạo được miễn dịch cao hơn và dài hơn so với vắc xin vô hoạt; nhưng đến nay với các chất bổ trợ mới, vắc xin vô hoạt đã dần dần thay thế cho vắc xin nhược độc trên thị trường thế giới, nhất là tại các nước có trình độ phát triển khoa học kỹ thuật cao người ta không muốn gặp phải nguy cơ xuất hiện lại các chủng

vi sinh vật có khả năng gây bệnh cho gia súc và gia cầm từ vắc xin, dù là với một xác suất nhỏ nhất

Như đã nói ở trên, để khắc phục các nhược điểm của vắc xin được tạo ra từ vi khuẩn đã được vô hoạt, các nhà khoa học đã nghiên cứu ra vắc xin sống bằng cách làm suy yếu vi khuẩn Loại vắc xin này có khả năng bảo vệ cơ thể rất tốt nhưng nó lại có rủi

ro rất lớn đối với những cơ thể có sức đề kháng kém Do nhược điểm đó mà vắc xin sống nhược độc đã ra đời Loại vắc xin này được điều chế bằng cách làm bất hoạt hoặc phá huỷ các gen mã hoá cho độc lực của tác nhân gây bệnh Vì nguồn kháng nguyên hầu như không bị thay đổi nên vắc xin này cũng có hiệu lực rất cao, khả năng bảo vệ cơ thể rất tốt Nhưng các nghiên cứu về mức độ an toàn của vắc xin cho thấy, các chủng vắc xin được tạo ra lại có tính di truyền không ổn định Các gen độc đã bị bất hoạt nhưng sau một thời gian nó có thể phục hồi và vì thế vắc xin sống nhược độc cũng còn mang rủi ro lớn Gần đây, nhờ sự phát triển như vũ bão của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã nghĩ ra việc tạo vắc xin phòng bệnh mới dựa vào kháng nguyên tiểu phần Vì là kháng nguyên tiểu phần nên vắc xin này sẽ có độ an toàn rất cao và khả năng bảo

hộ vẫn được đảm bảo Đây là loại vắc xin đang được quan tâm nghiên cứu hàng đầu và

sẽ được sử dụng rộng rãi trong một tương lai không xa

Trong số các tác nhân gây bệnh quan trọng nhất ở vật nuôi, phải kể đến vi rut gây bệnh Lở mồm long móng (LMLM) (Loeffler và Frosch, 1898), vi rut Dịch tả lợn (USA, 1833; trích dẫn theo Sharma, 1995), vi rut gây bệnh Newcastle (Kranevel, 1926),

vi rut dại (Zinke, 1804) Với vi khuẩn gây thiệt hại nhiều nhất cho ngành chăn nuôi phải kể đến là tụ huyết trùng trâu bò, tụ huyết trùng lợn, tụ huyết trùng gia cầm do vi

khuẩn Pasteurella multocida, và các bệnh của gia súc gia cầm do vi khuẩn Salmonella spp (Salmonellosis) ở các nước có nền khoa học phát triển cao, người ta đã sản xuất

thành công các loại vắc xin tương ứng đối với các bệnh kể trên Ví dụ, đối với vắc xin LMLM, hiện nay có 8 nước sản xuất, mà chủ yếu là Pháp, Anh, Hà lan và Nga (Liên xô cũ)… với sản phẩm là vắc xin vô hoạt dùng bổ trợ dầu ở châu á, Trung quốc và Thái lan cũng tiến hành sản xuất vắc xin LMLM với số lượng hạn chế, chủ yếu để dùng trong nước Đối với các bệnh khác, mặc dù chủng vi sinh vật dùng để sản xuất vắc xin

có thể khác nhau, nhưng hầu hết các nước đều tự chủ sản xuất và tự đảm bảo được nhu cầu vắc xin trong nước

Đối với bệnh tụ huyết trùng trâu bò, hầu hết các nước có bệnh đều sản xuất vắc

xin từ một chủng vi khuẩn P multocida nào đó và đều tiến hành các chương trình tiêm

phòng (Ramdan và Adler, 1993) Nhìn chung, vắc xin chống bệnh tụ huyết trùng trâu

bò thường được dùng là vắc xin chết với bổ trợ keo phèn hoặc bổ trợ dầu ở Iran, người

ta lại ưa dùng vắc xin với bổ trợ saponin và dạng cải tiến sau này được gọi là vắc xin phocmôn hóa có bổ trợ saponin (Theo FAO, 1979) Cũng đã có những tác giả đề xuất việc dùng vắc xin là chất chiết đã được tinh khiết (purified extracts) như Penn và Nagy (1974, 1976), Muniandy và cs (1993) Cũng có một số thông báo về việc dùng vắc xin nhược độc (Adelberg và cs, 1965; Oeschger và Berlyn, 1974; De Alwis và Carter, 1980) Tựu chung lại, muốn một vắc xin có hiệu quả trong việc phòng chốnng bệnh tụ huyết trùng trâu bò, ngoài các yếu tố quan trọng như nồng độ kháng nguyên , thì sự tương đồng giữa chủng vi khuẩn dùng để chế vắc xin và chủng vi khuẩn gây bệnh ngoài thực địa là điều kiện hết sức quan trọng

Với nhũng thành tựu của sinh học phân tử (SHPT), khoa học càng ngày càng hiểu biết rõ ràng hơn về bản chất gây bệnh của vi sinh vật, khả năng phòng vệ của cơ thể vật chủ với mầm bệnh và các yếu tố đóng vai trò quyết định trong đáp ứng của vật chủ đối với vi sinh vật (Zinkarnagel, 1999) Càng ngày, người ta càng hiểu chắc chắn hơn rằng không phải vật chủ hình thành đáp ứng miễn dịch đối với toàn bộ prôtêin cấu trúc của một vi sinh vật gây bệnh nào đó Nói cách khác, không phải tất cả kháng nguyên (prôtêin) đều có khả năng gây đáp ứng miễn dịch (đặc biệt là miễn dịch phòng hộ) tương tự như nhau Chính vì thế, càng ngày càng thấy nhiều nghiên cứu về vắc xin tái tổ hợp (recombinant vaccines) dùng phòng bệnh cho gia súc, gia cầm, ví dụ như đối với bệnh LMLM (Bergmann và cs, 2000) Cedillo-Barron, 2001; Mason và Grubman, 2001), bệnh Newcastle (Carpentier, 1994; Wu, 2000; Huang, 2001), bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm của lợn (Sestak et al., 1998, Tuboly, 2001) tức là các vắc xin trong

đó không có mầm bệnh (cho dù là nhược độc hoặc vô hoạt) mà chỉ có các kháng nguyên (tức là các prôtêin) có khả năng kích thích cơ thể vật chủ sản sinh đáp ứng miễn dịch phòng hộ

Việc ứng dụng các kỹ thuật SHPT để sản xuất các vắc xin tái tổ hợp nhằm tạo ra một vắc xin an toàn, có tính sinh miễn dịch cao ứng dụng trong phòng bệnh cho gia súc

và gia cầm đã và đang được thực hiện ở hầu hết các quốc gia tiên tiến trên thế giới Các

tác nhân gây bệnh quan trọng này đã được nghiên cứu rất chi tiết ở mức độ phân tử Trình tự nhiều gen quan trọng mã hóa cho các protein khác nhau của các đối tượng này như gen mã hóa cho protein vỏ, gen mã hóa cho kháng nguyên liên kết, kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu (HA) cũng như neuraminidaza (NA) của các vi rút, gen mã hóa cho các độc tố cũng như các tính trạng khác nhau của vi khuẩn đã được đăng ký trong Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế Có thể truy cập và ghi chép lại trình tự các bộ gen hoặc các đoạn gen quan trọng của hầu hết các mầm bệnh nguy hiểm cho gia súc và gia cầm tại Website của Viện Hàn lâm Y học Hoa kỳ và các Websites có liên quan theo địa chỉ: (<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>)

Để sản xuất một vắc xin có hiệu quả phòng hộ cao, việc lựa chọn chủng vi sinh vật để chế vẵc xin phù hợp về tính kháng nguyên với chủng vi rut gây bệnh ngoài thực

địa là điều hết sức quan trọng Điều này trở nên rất rõ ràng và hiển nhiên khi chúng ta biết rằng đối với vi rut LMLM có 7 type huyết thanh và hơn 70 dưới type (subtypes)

(Kitching, 1999, 2000) Đối với vi khuẩn P multocida người ta đã phân lập được hàng

ngàn chủng vi khuẩn với phân nhóm A, B, D, và E với tính chất gây bệnh và tính kháng nguyên hoàn toàn khác biệt nhau (de Alwis, 1996, 1998) Cũng tương tự như vậy, trong

thiên nhiên tồn tại hàng ngàn chủng vi khuẩn Salmonella mà khả năng gây bệnh cũng

như tính kháng nguyên của chúng đối với cùng một vật chủ hoặc với các vật chủ khác nhau thì hoàn toàn khác nhau Cũng chính vì lẽ đó, hàng loạt kỹ thuật sinh học phân tử như: Ribotyping, PCR, lai phân tử, RFLP, điện di trường xung điện v.v đã được sử dụng để phát hiện cũng như định type các tác nhân gây bệnh Đặc biệt đối với các tác nhân gây bệnh nguy hiểm có thể gây thành đại dịch và có tính biến đổi kháng nguyên rất phức tạp như vi rut gây bệnh LMLM, vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng thì việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định typ một các chính xác các chủng vi rút hay

vi khuẩn phân lập đều được tất cả các nước trên thế giới đặc biệt quan tâm Đã có rất nhiều công trình công bố về việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định typ vi

khuẩn P multocida và xác định typ và subtyp của vi rut LMLM Việc định subtyp một

cách chính xác bằng kỹ thuật sinh học phân tử là cực kỳ quan trọng vì nó giúp ta tìm ra qui luật lưu hành của tác nhân gây bệnh, chọn chủng chính xác, thích hợp cho việc sản xuất và ứng dụng vắc xin một cách hiệu quả Đó cũng chính là lý do tại sao đối với các nước chưa tự xác định được subtyp của chủng vi rut LMLM lưu hành trong các ổ dịch

của nước mình đều phải gửi bệnh phẩm đến Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế tại Pirbright, Vương quốc Anh Trong hoàn cảnh nước ta, việc ứng dụng kỹ thuật SHPT trong việc định typ vi rút LMLM trở nên cấp thiết để chúng ta có thể chủ động trong công việc này, không phải mua Kit ELISA của nước ngoài, và sau đó tạo cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn ở mức độ sub-typ

Các prôtêin tái tổ hợp dùng trong nghiên cứu và phòng chống các bệnh LMLM (Leippert, 2001; Nayak và cs, 2001), Newcastle (Baumans, 2001), và Gumboro (Gomes, 2000) cũng đã được nhiều nước như Mỹ, Nhật bản, Australia, Pháp, Canada, Anh v.v nghiên cứu thành công để từng bước thay thế cho các kháng nguyên toàn thân vi khuẩn hay toàn thân vi rut Người ta đã tách được gen mã hóa cho kháng nguyên glycoprotein vỏ của nhiều loại vi rut, ví dụ như vi rut LMLM, Gumbro, gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng của vi rut Newcastle như kháng nguyên liên kết, kháng nguyên ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên neuraminidaza sau đó cho biểu hiện

thành công với vi rut đậu gà hoặc Baculovirut hay trong vi khuẩn Salmonella (xem

Shieh và cs, 2001) Càng ngày càng thấy xuất hiện nhiều vacxin thế hệ mới trên thị trường Rõ ràng đây là một hướng nghiên cứu mới trong tương lai nhằm mang lại hiệu quả của công việc phát hiện bệnh, phòng trị bệnh tốt mà lại đảm bảo dịch bệnh không

có cơ hội trở lại, tạo điều kiện cho công cuộc khống chế dẫn đến tiêu diệt bệnh được dễ dàng Đây là một trong những điều kiện cơ bản nhằm tạo ra một đàn gia súc gia cầm sạch bệnh với thịt và sản phẩm khác từ động vật có chất lượng tốt cho nhân dân tiêu dùng và đảm bảo chất lượng cho xuất khẩu

Vi khuẩn Salmonella, tác nhân gây bệnh cho hầu hết các loài gia súc, gia cầm và

người đã được biết đến từ hàng trăm năm nay (Trích dẫn theo Hahn G, 1993) Nhờ có

khả năng thích ứng với nhiều loại vật chủ, nên số lượng serotyp Salmonella không

ngừng gia tăng kể từ khi nó được phát hiện và được công nhận là tác nhân gây bệnh lần

đầu tiên vào năm 1885 ở đầu thập kỷ 90, số lượng chủng Salmonella đã vào khoảng

2000 (Wilcock, Schwartz 1992) Chỉ 5 năm sau, con số đó đã đạt đến 3000 (Plonait,

Bickhardt 1997) Bệnh do Salmonella spp gây ra được phát hiện ở khắp các châu lục trên thế giới Bệnh ở bê nghé chủ yếu do 2 loài S dublin và S typhi murium Đặc biệt, ở

gà bệnh do các loài Salmonella gây ra được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Ngoài 2 loài Salmonella là S pullorum và S gallinarum gây bệnh đặc hiệu cho gà sinh sản còn

có hai loài khác là S typhi murium và S enteritidis nhiễm trên gà mọi lứa tuổi Hiện nay, S typhi murium và S enteritidis vẫn còn đang là vấn đề nan giải ngay cả với các quốc gia có nền kinh tế phát triển ở Mỹ, thiệt hại do S typhi murium và S enteritidis

gây ra hàng năm ước tính 77 triệu USD ở úc, cũng thường phải tốn kém hàng trăm

ngàn USD để ngăn chặn các ổ dịch do S typhi murium gây nên ở người Salmonella

spp cũng được đánh giá là tác nhân quan trọng gây ngộ độc thực phẩm cũng như gây nhiễm khuẩn đường tiêu hoá ở Đức, năm 1994 đã thông báo có 1,6 triệu người bị ngộ

độc thực phẩm do Salmonella ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 112,6 triệu người bị ngộ độc

thực phẩm ở Canada cứ 11 người dân thì có 1 người bị ngộ độc thực phẩm Chính vì

những tác hại to lớn của vi khuẩn Salmonella mà hầu hết các nước trên thế giới đã đầu

tư nghiên cứu tìm các giải pháp phòng chống Đến nay, đã có nhiều loại vacxin ra đời,

đã hạn chế được đáng kể thiệt hại do Salmonella spp gây ra Các nhà nghiên cứu ở Đức cho rằng sử dụng vacxin sống đột biến gen Zoosaloral H và TAD Salmonella VACRT,

với những lợi thế là vừa tạo miễn dịch dịch thể vừa tạo miễn dịch tế bào, có ý nghĩa đặc

biệt quan trọng đối với việc phòng chống bệnh do Salmonella gây ra ở gà, và cũng là

biện pháp hữu hiệu ngăn chặn nguồn tàng trữ và lây lan mầm bệnh quan trọng nhất cho người (Martinvà cs, 1996)

Việt nam là một nước nằm ở vùng nhiệt đới có độ ẩm cao rất phù hợp với sự phát triển của nhiều loại vi sinh và và cũng chính vì thế nhiều bệnh truyền nhiểm dễ dàng phát sinh không những ở người mà cả ở vật nuôi Hàng năm, các bệnh ở vật nuôi,

đặc biệt là các bệnh LMLM, bệnh tụ huyết trùng, bệnh Newcastle, và bệnh do

Salmonella gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi của nước ta

Đối với tình hình trong nước, bệnh Lở mồm Long móng là bệnh nguy hiểm nhất của gia súc, được xếp hàng đầu trong danh sách các bệnh bảng A của Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Nha Trang (Trung bộ) (năm 1898)

và sau đó là ở Nam bộ (1920) Năm 1937-1940, có dịch ở Quảng ngãi Năm 1952, bệnh phát ra ở Thừa thiên, đến 1953-1954 lan tràn vào miền Nam Trung bộ, ra miền Bắc Trung bộ (khu 4), khu 3, khu Tả ngạn, trung và thượng du Bắc bộ, Việt bắc và Tây bắc (Điện biên) Tháng 4 năm 1955, bệnh lại tái phát ở khu 3 và lan sang các khu Tả ngạn, Việt bắc, vào khu 4 (Trích dẫn theo Nguyễn Vĩnh Phước, 1974) Có thể nói, trước đây bệnh xảy ra lẻ tẻ trong khắp cả nước Năm 1999, bệnh xảy ra tại 60 trong số 61 tỉnh,

thành của Việt nam (Theo tài liệu của Cục Thú y, Bộ NN và PTNT) Ngoài khả năng gây chết trực tiếp cho gia súc non do bội nhiễm vi khuẩn, gia súc bị bệnh LMLM bỏ ăn (do đau miệng), không có khả năng cày kéo và trở nên gầy yếu, kém tiết sữa và đây chính là các thiệt hại chủ yếu đối với ngành chăn nuôi và ngành trồng trọt Mặt khác, theo qui định của Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE), không được xuất và nhập động vật (trâu bò, lợn, dê ) và sản phẩm động vật khi chúng bị mắc bệnh LMLM Có thể nói, bệnh LMLM là bệnh gây trở ngại lớn nhất cho thương mại quốc tế đối với động vật và các sản phẩm từ động vật Đặc biệt, bệnh đã gây trở ngại cho việc thương mại theo trục Bắc-Nam Bệnh Lở mồm long móng xảy ra thành dịch địa phương hoặc dịch lẻ tẻ chủ yếu ở các nước phương Nam (ngoại trừ ổ dịch Lở mồm long móng gần đây ở Vương Quốc Anh xảy ra từ tháng 3 năm 2001) và điều này là cơ sở cho việc cấm vận gia súc sống cũng như các sản phẩm thịt tươi từ các nước phía Nam lên các nước không có dịch LMLM ở phía Bắc

Mặc dù LMLM là một bệnh đã được thừa nhận là phổ biến ở Việt Nam Hiện tại, chúng ta chưa nghiên cứu về bệnh này nên cũng chưa nghiên cứu sản xuất vắc xin cũng như nghiên cứu các phương pháp chẩn đoán định type Để phòng chống bệnh, hiện tại, chúng ta phải nhập vắc xin từ nước ngoài và chủ yếu là từ các công ty như Merial, Intervet, Bayer và một số ít của Virbac Theo phân loại hiện nay, vi rut gây bệnh LMLM có 7 typ với hơn 70 biến chủng dưới typ (sub-typ) (Kitching, 2000) và các chủng dùng dể sản xuất vắc xin bán tại Việt nam chỉ là 3 đối với vắc xin của Merial và

là 2 đối với vắc xin của Intervet Chúng ta đã nhập và triển khai tiêm chủng phòng bệnh LMLM, tuy nhiên bệnh vẫn tồn tại thành dịch địa phương trong ở nhiều vùng trong cả nước (Theo tài liệu của Phòng Dịch tễ, Cục Thú y) Chẩn đoán và định subtyp một cách chính xác sẽ giúp chúng ta tìm ra nguồn gốc của bệnh, định hướng cho việc nhập vắc xin để hạn chế và từng bước tiến tới thanh toán bệnh này Cho đến nay chưa có một cơ

sở nào trong nước tiến hành phân lập vi rút cũng như ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định typ và subtyp một cách chính xác loại vi rut nguy hiểm này Để chẩn

đoán (và đồng thời là định typ), Cục Thú y hàng năm phải mua Kit chẩn đoán ELISA của nước ngoài và phải gửi bệnh phẩm tới Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế về LMLM ở Pỉbright (Anh quốc) để nhờ xác định subtyp

Chính vì những lý do trên đây, chúng ta cần phải xây dựng một phòng thí nghiệm nghiên cứu về bệnh LMLM, phải tiến hành phân lập vi rút mở đường cho việc chủ động xác định typ và subtyp của vi rút tại Việt nam Rõ ràng đây là một công việc hết sức khó khăn, đòi hỏi sự đầu tư của nhà nước để xây dựng cơ sở vật chất và đội ngũ cán bộ khoa học kỹ thuật có đủ khả năng nghiên cứu về căn bệnh nguy hiểm này Cũng rất rõ ràng là nếu chúng ta không bắt tay vào việc xây dựng một phòng thí nghiệm chuyên hóa, không đào tạo đội ngũ cán bộ và không tiến hành phân lập vi rút LMLM gây ra các ổ dịch ở Việt nam thì chúng ta không thể chủ động phòng chống bệnh, không thể hội nhập kinh tế với các nước

Bệnh tụ huyết trùng (THT) tồn tại ở hầu hết tất cả các nước trên thế giới được nhiều nhà nghiên cứu khẳng định là bệnh theo mùa vụ (Vitoz, 1952, Phan Thanh Phượng, 1969, De Alwis, 1992 ) Bệnh thường xảy ra vào trước và sau mùa mưa lũ và vào những nơi mà có khí hậu ẩm ướt, nắng, nóng nhiều, mưa nhiều Do đó, bệnh thường thấy ở vùng Đông Nam châu á Cho đến nay bệnh tụ huyết trùng ở gia súc gia cầm vẫn còn là mối quan tâm lớn của nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước ở vùng Đông Nam châu á, vì những bệnh này vẫn còn gây nhiều thiệt hại lớn cho chăn nuôi ở những nước trong vùng ở Việt nam, bệnh THT vẫn còn là một bệnh gây nhiều thiệt hại trong chăn nuôi gia súc gia cầm Nhiều vụ dịch tụ huyết trùng xảy ra nhưng chúng ta chưa xác định được type vi khuẩn một cách chính xác, nên việc đề xuất biện pháp khống chế chưa phù hợp, do đó hiệu quả phòng chống bệnh chưa được cao, hoặc không có hiệu quả Tình trạng này làm ảnh hưởng nặng nề đến năng suất chăn nuôi

Điểm qua tình hình bệnh THT trong những năm gần đây cho thấy: số địa phương bị bệnh THT trâu bò có chiều hướng gia tăng

Đối với bệnh tụ huyết trùng trâu bò, chúng ta đã có thể tự sản xuất được vắc xin bằng các chủng vi khuẩn nhập từ nước ngoài, tuy nhiên việc giám sát dịch tễ học đối

với vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng, đặc biệt là việc định typ

một cách chính xác là việc làm hết sức quan trọng Điều đó giúp chúng ta chọn chủng thích hợp để sản xuất và ứng dụng vắc xin một cách hiệu quả Thực tế cho thấy, có nơi

do tiêm phòng kém, nên dịch bệnh xảy ra, làm chết hàng ngàn gia súc, gia cầm; có nơi tiêm phòng xong dịch vẫn xảy ra Như vậy dịch có thể nổ ra do tiêm phòng kém, hoặc

do chẩn đoán chưa chính xác, hoặc có thể mầm gây bệnh là vi khuẩn serotyp khác với serotyp của chủng dùng để sản xuất vắc xin

Bởi thế, do những yêu cầu cấp bách của thực tế và do đặc điểm cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn tụ huyết trùng nên chúng ta phải có trong tay số liệu về các chủng

vi khuẩn P multocida phân lập được từ trâu bò bị bệnh THT ở các địa phương khác

nhau và so sánh các chủng này với các chủng đang dùng để chế vắc xin trong nước để tìm ra một chủng vắc xin thích hợp, cho hiệu quả phòng hộ cao

Bệnh do các loài Salmonella gây ra ở gia súc, gia cầm cũng đã được quan tâm

nghiên cứu từ cuối thập kỷ 70 Nguyễn Văn Lãm và cộng sự (1968) cũng đã phát hiện

được nguyên nhân gây bệnh phó thương hàn lợn con là loài S cholerae suis Tác giả cũng đã chế tạo thành công vacxin để phòng chống bệnh Sau đó cũng có nhiều công trình nghiên cứu khác đề cập đến loài vi khuẩn này với tác nhân gây bệnh ở nhiều loại gia súc gia cầm khác nhau được nuôi ở hầu hết các vùng trong cả nước (Đoàn Băng Tâm, 1987; Nguyễn Thị Nội, 1989; Lê Văn Tạo và cs, 1992; Vũ Bình MInh và Cù Hữu Phú, 1999; Trần Thị Hạnh và cs, 1997, 1998, 1999, 2000) Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu còn mang tính địa phương, cục bộ rời rạc, chưa tìm ra được những kết luận tầm quan trọng tính nguy hiểm của bệnh Đặc biệt là việc định typ một cách chính xác các serotyp gây bệnh còn nhiều hạn chế Do vậy mà các vacxin cũng như các biện pháp phòng chống bệnh hiện nay vẫn chưa thực sự có hiệu qủa ở nước ta cho đến nay mới chỉ có duy nhất vacxin phó thương hàn lợn phòng bệnh do S cholerae suis gây ra Còn

ở các gia súc khác và gia cầm thì hầu như chưa có vacxin Có lẽ đây cũng là một trong những yếu tố góp phần làm gia tăng nhanh chóng tình trạng ngộ độc thực phẩm cũng như bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hoá ở người trong những năm gần đây Bởi lẽ trong

các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Salmonella cũng được đánh giá là

một tác nhân quan trọng bên cạnh vi khuẩn Shigella và E coli Năm 1999, ở nước ta có

300 vụ ngộ độc thực phẩm với một số người bị bệnh là 7000 người, trong đó có 71 trường hợp tử vong Đến cuối năm 2000 số người ngộ độc thực phẩm đã tăng lên 9000 Trên đây là những con số rất đáng lo ngại cho người tiêu dùng trong và ngoài nước

Đây cũng là vấn đề cấp bách đặt ra đối với các tổ chức, các cơ quan hữu quan, các nhà quản lý và các nhà khoa học vì lợi ích kinh tế của quốc gia, vì sự an toàn của người tiêu dùng nói riêng và cho sức khoẻ cộng đồng nói chung Sử dụng vacxin có tác dụng

phòng bệnh đạt hiệu qủa cao là biện pháp tốt nhất để phòng chống dịch bệnh nói chung

và bệnh do Salmonella gây ra ở gia súc, gia cầm nói riêng

Xuất phát từ tình hình dịch bệnh trong nước và tri thức của nhân loại về chẩn

đoán và phòng trừ các bệnh của gia súc, chúng tôi đã nhận đơn đặt hàng của Bộ Khoa học và Công nghệ để thực hiện Đề tài Khoa học Công nghệ cấp Nhà nước mang mã số

KC.04.06 mang tiêu đề "Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vắc xin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gen xác định type vi rut

lở mồm long móng (LMLM)" Các mục tiêu của Đề tài là:

- Tạo công nghệ sản xuất vắc xin nhược độc, biến nạp gen phòng bệnh cho gà

- Lựa chọn chủng vi khuẩn tụ huyết trùng để sản xuất vắc xin

- Định type vi rut LMLM bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR) để kựa chọn vacxin phù hợp

Để thực hiện các mục tiêu này, như đã nói ở phần trên, Đề tài KC.04.06 được chia làm 4 nhánh với các nội dung khác nhau phù hợp với các mục tiêu cụ thể Tuy nhiên, trong báo cáo tổng thể này, chúng tôi sẽ cố gắng trình bày một cách liên hoàn các kết quả thu được theo các mục tiêu đã đề ra

Xin được trân trọng giới thiệu báo cáo này

Chương I

Tổng quan tài liệu

1.1 Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò

1.1.1 Vài nét về lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng

1.1.1.1 Lịch sử nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trên thế giới

Năm 1878, Bollinger là người đầu tiên phát hiện bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại

Đức

Năm 1879, Tousain phát hiện bệnh tụ huyết trùng ở gà

Năm 1880, Louis Pasteur, nhà vi trùng học người Pháp đã phát hiện được vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà (Fowl cholera)

Năm 1881, Gaffky phát hiện bệnh ở thỏ và đặt tên là bệnh bại huyết (Septicaemia disease)

Năm 1886, Loeffer phát hiện bệnh ở lợn

Hueppe, nhà giải phẫu bệnh lý học người Đức phát hiện thấy sự tương đồng về triệu chứng, bệnh tích ở bò, gà và thỏ mắc bệnh tụ huyết trùng

Năm 1887, Oroste và Armani phát hiện ra bệnh và đặt tên là Barbone

Trevissan đã đề nghị đặt tên chung cho giống vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng

là Pasteurella để tưởng nhớ đến nhà bác học Louis Pasteur, người đầu tiên phát hiện vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà Từ đó người ta căn cứ vào đặc tính sinh bệnh cụ thể cho từng loài vật, chia Pasteurella thành các loài khác nhau:

Pasteurella gây bệnh cho bò là: P boviseptica

Pasteurella gây bệnh cho trâu là: P bubaliseptica

Pasteurella gây bệnh cho lợn là: P suiseptica

Pasteurella gây bệnh chogia cầm là: P aviseptica

Năm 1939, Rosenbusch và Merchant đã đề nghị đặt tên chung cho vi khuẩn gây

bệnh tụ huyết trùng là: Pasteurella multocida để thể hiện cho khả năng gây bệnh cho

nhiều loài vật của vi khuẩn này

1.1.1.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam

Dương Thế Long (1994) đánh giá hiệu quả những biện pháp phòng trị bệnh THT trâu bò ở Sơn La trong giai đoạn 1990-1993, khẳng định: Tiêm phòng bệnh THT là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng hàng đầu Trâu bò được tiêm vacxin vào cuối tháng 3, đầu tháng 4 là thích hợp Cùng năm, tác giả tìm hiểu mối tương quan giữa các yếu tố khí hậu thời tiết và tình hình dịch bệnh THT trâu bò, cho biết: Các yếu tố mưa, nhiệt độ, ẩm độ, nắng tác động theo mức độ giảm dần đến tình hình phát sinh và phát triển dịch bệnh, tháng 6 là đỉnh cao của mùa dịch và trùng với mùa mưa của tỉnh Sơn

La

Phan Thanh Phượng và cộng sự, 1994 nghiên cứu biến động một số chỉ tiêu sinh

lý ở gia súc, gia cầm được tiêm vacxin THT có các bổ trợ khác nhau như: Marcol 52 và Montanid 888, parafin và lanolin, dầu lạc, … khẳng định rằng các chỉ tiêu sinh lý có biến động nằm trong giới hạn sinh lý bình thường

Nguyễn Ngã, 1995 nghiên cứu tính kháng nguyên và độc lực vi trùng gây bệnh THT trâu bò ở khu vực miền trung nhằm chọn giống vi khuẩn địa phương thích hợp có khả năng phối hợp với giống nước ngoài để chế tạo vacxin đạt hiệu lực cao Kết quả là

vi khuẩn P multocida chủng TS địa phương có khả năng bảo hộ cao và ổn định hơn cả

Hoàng Đạo Phấn, 1996 nghiên cứu tác động của thực khuẩn thể đặc hiệu đối với

P multocida phân lập từ gia súc, gia cầm Kết quả cho thấy: 84,2% trong số 76 chủng

vi khuẩn bị dung giải bởi các thực khuẩn thể đặc hiệu

Nguyễn Thiên Thu và Nguyễn Ngã, 1996 phân lập và xác định type huyết thanh P.multocida ở trâu bò nuôi tại miền trung Việt Nam Kết quả: trong tổng số 469 bệnh phẩm (dịch ngoáy mũi) có 21 bệnh phẩm có vi khuẩn gây bệnh THT, dùng phản ứng IHA xác định thấy có 18/21 mẫu thuộc type B Carter - type gây bệnh THT có thể thấy ở hạch lympho, niêm mạc đường hô hấp trên của trâu bò - với hiệu giá ngưng kết 1/64

Trương Văn Dung, 1998 nghiên cứu đặc tính và định type huyết thanh học (HTH) vi khuẩn gây bệnh THT trâu bò phân lập được ở một số tỉnh phía bắc, kết quả là, trong 92 chủng có 14 chủng thuộc type A, 23 chủng thuộc type B, 30 chủng thuộc liên type A, B, D và 14 chủng không xác định

Đinh Duy Kháng và Lê Văn Phan, 2000 đã ứng dụng kỹ thuật PCR để định type

vi khuẩn P multocida phân lập ở miền Trung Việt Nam HB1, HB2 và HS1, HS2 là hai cặp mồi được dùng để xác định P multocida type B gây bại huyết, xuất huyết Trong số

7 chủng chuẩn quốc gia (I2, IR, 41, 43, 99, 483, 8936) thì chỉ có chủng IR là có hình

ảnh đặc trưng của type B TOX1, TOX2 là cặp mồi dùng để xác định P multocida type

A và D có gen độc tố (toxin) A đã xác định chỉ có chủng 99 mới có gen độc tố (toxin)

A

Cao Văn Hồng, 2002 nghiên cứu về mùa dịch và ảnh hưởng các yếu tố khí hậu

đến bệnh THT gia súc ở Đăk lăk Kết quả cho biết thời tiết có tác động đến bệnh THT gia súc, ảnh hưởng của lượng mưa đến số gia súc ốm do THT là rõ rệt nhất

Trương Văn Dung, Hoàng Xuân Nghinh và cộng sự, 2000 xác định type HTH vi khuẩn gây bệnh THT trâu bò:

- Type B gây bại huyết-xuất huyết (Haemorhagic Septicaemia)

- Type A, D gây viêm phổi bê, nghé (Bovine Pneumonic Pasteurellosis)

- Type D và Bordetella bronchiseptica gây viêm teo mũi truyền nhiễm

1.1.2 Tóm lược về nghiên cứu vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng

Phan Thanh Phượng và cộng sự nghiên cứu chế tạo vacxin nhũ hoá THT trâu bò

có hiệu lực miễn dịch cao nhằm thay thế vacxin keo phèn có hiệu lực miễn dịch thấp Kết quả: Chủng IR có bổ trợ lanolin và parafin có hoạt tính miễn dịch cao để chế vacxin nhũ hoá (kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y 1979- 1984)

Nguyễn Ngã, Lê Minh Tâm và Nguyễn Bá Cường nghiên cứu và sản xuất vacxin THT trâu bò chủng Iran (kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật Thú y 1985-1989)

Phan Thanh Phượng và cộng sự nghiên cứu vacxin nhũ hoá THT trâu bò trong sản xuất Kết quả: Sản xuất kháng nguyên trong bình lên men sục khí, tạo nhũ trong

máy gây nhũ, bảo quản vacxin trong tủ lạnh 4-100C, hiệu lực vacxin đạt 100% trong 12 tháng (công trình nghiên cứu KHKT 1990-1991)

Vacxin phòng bệnh THT có 3 loại: Vacxin vô hoạt không có chất bổ trợ (Bacterin), vacxin vô hoạt có chất bổ trợ và vacxin tổng hợp

Vacxin bacterin: Vi khuẩn được vô hoạt bằng formol với nồng độ 0,3%, vacxin

có độ dài miễn dịch ngắn 3-4 tháng Sau khi tiêm vacxin, có một tỷ lệ trâu bò phản ứng mạnh với vacxin, đôi khi có thể gây chết trâu bò Hiện nay không sử dụng

Vacxin vô hoạt có chất bổ trợ: Vi khuẩn sau khi được vô hoạt bằng formol 0,3%

được phối hợp với các chất bổ trợ như keo phèn, phèn chua hoặc dầu khoáng Vacxin này dễ bảo quản, độ an toàn cao, độ dài miễn dịch tương đối tốt 4-6 tháng Theo danh mục thuốc thú y năm 1998 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, nước ta hiện

đang sử dụng chủ yếu là vacxin vô hoạt có chất bổ trợ phòng bệnh THT, gồm:

* Vacxin THT trâu bò vô hoạt có bổ trợ phèn chua, chế từ chủng P52 do NAVETCO sản xuất

* Vacxin THT trâu bò vô hoạt có bổ trợ chất keo phèn chế từ chủng Pb1, Pb2, PbU1, PbU2 do Xí nghiệp thuốc thú y trung ương sản xuất

* Vacxin THT trâu bò vô hoạt có bổ trợ chất keo phèn, chế từ chủng IR do phân Viện Thú y miền trung sản xuất

* Vacxin THT trâu bò nhũ hoá, chế từ chủng IR có chất bổ trợ tạo nhũ là dầu khoáng do Viện Thú y sản xuất

Vacxin tổng hợp sinh học phân tử đã và đang có những bước tiến đáng kể, điều

đó cho phép ta nghĩ đến việc chế ra các loại vacxin tổng hợp, không những để phòng bệnh THT mà còn để phòng chống các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm khác trong tương lai

1.1.3 Vi khuẩn Pasteurella multocida

1.1.3.1 Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn P multocida

Vi khuẩn Pasteurella nằm trong bộ Eubacteriales, thuộc họ Parvobacteriaceae,

thuộc giống Pasteurella và chia làm ba loài, trong đó có loài gây bại huyết, xuất huyết

cho gia súc, gia cầm là: Passteurella multocida và Pasteurella haemolytica

1.1.3.2 Đặc tính hình thái của vi khuẩn

Pasteurella multocida là một cầu trực khuẩn nhỏ, có kích thước

0,25 -0,4 ì 0,4 -1,5 àm Vi khuẩn có giáp mô, không sinh nha bào, không lông, không

di động

1.1.3.3 Tính chất bắt màu của vi khuẩn

Pasteurella multocida bắt màu gram âm với thuốc nhuộm gram, vi khuẩn

thường dễ bắt màu với thuốc nhuộm anilin, tốt nhất với Methylen blue, đỏ Fucsin, có thể thấy khi dùng phương pháp nhuộm Giemsa và Wright Các chủng có hình thành giáp mô thì có thể nhuộm bằng phương pháp nhuộm Hiss và Zilnelson

Trong cơ thể gia súc mắc bệnh (máu và phủ tạng: gan, lách , phổi…) và trong môi trường mới nuôi cấy, vi khuẩn Pasteurella khi nhuộm màu có hiện tượng bắt màu sẫm ở hai đầu, còn ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn so với hai đầu, nên

người ta gọi Pasteurella là vi khuẩn lưỡng cực Manninger, 1919 giải thích tính lưỡng

cực của vi khuẩn, là do tế bào vi khuẩn đang trong giai đoạn phân chia, vi khuẩn tăng lên về kích thước, độc lực và nguyên sinh chất, khi đó nguyên sinh chất dung giải dồn

về hai đầu của vi khuẩn

Trong canh khuẩn thường thấy vi khuẩn hình trứng, hình cầu, đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Trong canh khuẩn già, vi khuẩn suy yếu, biến dạng, thay đổi hình thái như hình gậy dài, dùi cui, quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường, có khi dài 2 –

3 àm hay hơn nữa

1.1.3.4 Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn P multocida:

P multocida là loại vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí không bắt buộc, có thể nuôi

ở nhiệt độ từ 150C đến 380C (thích hợp nhất ở nhiệt độ 370C), pH từ 7,2 đến 7,4 Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém, trong môi trường có thêm huyết thanh, máu thì vi khuẩn phát triển tốt

* Trong môi trường nước thịt:

Sau 24 giờ nuôi cấy ở tủ ấm 370C canh khuẩn đục, lắc có hiện tượng vẩn như sương mù rồi lại mất, đáy ống có cặn nhầy, có khi sinh ra một màng mỏng trên mặt môi trường Môi trường có mùi tanh đặc trưng Theo Carter (1955), mùi tanh đặc trưng

nhất ở pha vi khuẩn phát triển nhanh, trong môi trường nước thịt, vi khuẩn P multocida

phát triển theo 4 pha lần lượt: Pha chậm, pha nhanh, pha cân bằng và pha suy thoái, để lâu thì mùi tanh giảm dần

* Trên môi trường thạch thường:

Sau khi nuôi cấy vi khuẩn 24 giờ ở 370C, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng S Khuẩn lạc nhỏ, trong suốt long lanh như hạt sương, mặt khuẩn lạc vồng Nuôi lâu khuẩn lạc có màu trắng ngà dính vào môi trường

Trên môi trường thạch thường, vi khuẩn P multocida phát triển thành những

dạng khuẩn lạc sau:

Khuẩn lạc dạng S (Smooth): Dạng khuẩn lạc trơn, rìa gọn, bóng láng, long lanh, mặt vồng, có dung quang sắc cầu vồng, là dạng khuẩn lạc của vi khuẩn có độc lực mạnh Vi khuẩn thuộc dạng khuẩn lạc này thường tạo thành lớp giáp mô dầy hơn vi khuẩn có dạng khuẩn lạc xù xì

Khuẩn lạc dạng R (Rough): Khuẩn lạc thường dẹt, có rìa nhám xù xì, nhám, có dung quang màu xanh Vi khuẩn có dạng khuẩn lạc này có độc lực yếu

Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): Khuẩn lạc nhầy ướt, có kích thước to nhất trong 3 loại khuẩn lạc, rìa nhẵn, dung quang sắc cầu vồng, vi khuẩn có độc lực yếu hơn độc lực của vi khuẩn cho khuẩn lạc dạng S

Hình dạng khuẩn lạc cũng có thể thay đổi, nếu nuôi cấy lâu ngày thì kích thước khuẩn lạc lớn hơn, nhớt và dính chặt vào mặt thạch (gọi là khuẩn lạc già) Nếu cấy chuyển nhiều lần thì giáp mô bị mất, kích thước của khuẩn lạc sẽ nhỏ lại, không màu và trong suốt

Những vi khuẩn có giáp mô lớn là những vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc dạng nhầy,

ít phát quang, có bờ tròn gọn, những vi khuẩn có giáp mô nhỏ hơn là những vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc trơn, bóng láng

* Trên môi trường thạch máu:

Vi khuẩn phát triển tốt hơn trong môi trường thạch thường P multocida không

làm dung huyết Kích thước khuẩn lạc to hơn khuẩn lạc trên môi trường thạch thường Môi trường này thường để giữ giống vi khuẩn

* Trên môi trường thạch huyết thanh:

Môi trường này dùng để giám định, phân lập và xác định độc lực của vi khuẩn

Pasteurella multocida Trên môi trường này, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc

đặc biệt, có hiện tượng phát quang khi xem khuẩn lạc dưới kính hiển vi có thị kính với

độ phóng đại thấp (20 lần) và góc chiếu tới 450 của ánh sáng đèn

Tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc khác nhau

Nếu vi khuẩn có độc lực cao thì khuẩn lạc của chúng quan sát thấy có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm khoảng 2/3 diện tích khuẩn lạc, 1/3 diện tích còn lại của khuẩn lạc là màu vàng và vàng da cam Khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent)

Nếu vi khuẩn có độc lực vừa thì khuẩn lạc của chúng quan sát thấy có màu xanh lơ ít hơn diện tích màu vàng da cam Khuẩn lạc loại này gọi là Fo (Orange Flourescent)

Nếu vi khuẩn có độc lực yếu, khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng dung quang, không màu và gọi là loại Nf (Not Fluorescent), khuẩn lạc nhỏ, tròn, trong suốt

Hiện tượng dung quang của khuẩn lạc xem rõ khi nuôi cấy vi khuẩn sau 16-18 giờ ở nhiệt độ 370C, nếu khuẩn lạc nuôi cấy quá giờ trên hiện tượng dung quang sẽ giảm và mất đi

Đặc tính dung quang của P multocida lần đầu tiên được Dekrut (1921) phát

hiện Những khuẩn lạc dạng S trên môi trường thạch đặc biệt sau 16 giờ đến không quá

24 giờ ở nhiệt độ 370C nuôi cấy thường có tính dung quang mạnh Khuẩn lạc dạng M

và R không có đặc tính này

Theo Smith, đặc tính dung quang có quan hệ chặt chẽ với sự tạo vỏ của P multocida Dựa vào đặc tính này người ta có thể chọn được những chủng vi khuẩn gây bệnh THT có tính kháng nguyên cao và khả năng gây miễn dịch tốt

* Trong môi trường gelatin:

Dọc theo đường cấy trích sâu, vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc mịn, hình

hạt, không làm tan chảy gelatin

1.1.3.5 Đặc tính sinh hoá của Pasteurella multocida

Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn P multocida đã được các nhà nghiên cứu khảo

sát dựa trên nguyên lý: Vi khuẩn là một tế bào sống nên khi được nuôi trong các môi

trường dinh dưỡng, quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào vi khuẩn sẽ tạo ra các

sản phẩm có thể làm thay đổi độ pH của môi trường Khi đó dựa vào các chất chỉ thị

màu thì người ta có thể xác định đặc tính sinh hoá của chúng

Một số đặc tính sinh hoá thông thường của P multocida

Đặc tính sinh hoá Phản ứng(+); (-)

Theo Carter năm 1984, vi khuẩn P multocida có các đặc tính sinh hoá sau:

- Dương tính trong phản ứng Oxydase và phản ứng Catalase

- Âm tính khi kiểm tra khả năng dung huyết, khả năng di động, khả năng làm

tan chảy Gelatin và khả năng mọc trên môi trường Macconkey

- Lên men, không sinh hơi các loại đường: Glucose, saccarose, manitose, sorbit

và xylose

- Không lên men các loại đường: Lactose, maltose, arabinose, rammose, salixin, dunxid và adonit

1.1.3.6 Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida

Giáp mô là một lớp vỏ nhầy bao bọc ngoài tế bào, được sinh ở điều kiện nhất

định trong quá trình sinh trưởng Giáp mô có tác dụng bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào và các tác động có hại của môi trường Giáp mô cũng là nơi dự trữ chất dinh dưỡng cho vi khuẩn

Theo Manniger, 1919 vi khuẩn có giáp mô thường có độc lực cao, nhưng độc lực của vi khuẩn phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của giáp mô hơn là sự có mặt của chúng

Theo Carter, 1967 vi khuẩn phân lập được từ động vật mắc bệnh cấp tính đa số

đều thấy có giáp mô và độc lực

Theo Bain, 1954 thành phần của giáp mô có chứa axít hyaluronic và gắn một lớp polysaccarit

Theo Carter, 1975 giáp mô của type A có cấu tạo bởi axít hyaluronic nhưng có

sự liên quan mật thiết với các thành phần khác như polysaccarit, protein và lipit

Theo Harmon, 1991 axít hyaluronic không gây hoạt hoá kháng thực bào, nhưng chất chiết giáp mô có thể ức chế khả năng thực bào của bạch cầu đa nhân trong máu bò Nếu tách axít hyaluronic khỏi giáp mô sẽ làm tăng khả năng bám dính của vi khuẩn lên

bề mặt tế bào động vật ký sinh và tăng tính mẫn cảm của vi khuẩn đối với sự thực bào

Theo Wilson, 1992 tính kháng nguyên giáp mô của P multocida xác định theo

type huyết thanh A, B, D, E, F

1.1.3.7 Độc tố của Pasteurella multocida

Theo Sawuata, 1984 một số chủng P multocida serotype D có sinh ra một yếu tố

được gọi là yếu tố sinh hoại tử da (Dermo Necroti Toxin - DNT) có bản chất là protein

Tác động của DNT là gây hoại tử biểu bì, gây độc với tế bào phổi bò, gây chết và ỉa chảy nhầy, teo lách ở chuột

Theo Rimeler 1989 và Brogden (1980 - 1982): Trong chất lọc canh trùng già có một loại độc tố có bản chất lipo-polysaccarit Khi tiêm chất này vào tĩnh mạch của trâu

bò sẽ gây phản ứng sốt, ỉa chảy ra máu, có thể tử vong

1.1.4 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida

Cấu trúc kháng nguyên của P multocida chưa biết đầy đủ, vi khuẩn có một

kháng nguyên thân (O) là gluxit - lipit – protein, độc đối với chuột nhắt và gây được miễn dịch Những chủng độc có một kháng nguyên phụ là kháng nguyên vỏ, có bản chất là polysaccarit, đây là một bán kháng nguyên, che lớp kháng nguyên thân O

Hiện nay, trong khi nghiên cứu chế vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng cho gia súc, gia cầm, một số tác giả đã tiến hành tách kháng nguyên thân (O) và kháng nguyên

vỏ (K) ra, sau đó mới trộn lẫn với nhau Mục đích là bộc lộ kháng nguyên thân (O) để tạo miễn dịch tốt hơn

Pasteurella multocida có tính kháng nguyên giao hỗ (tương đồng kháng

nguyên) tức là có khả năng miễn dịch chéo giữa các chủng, tính chất này nhiều hay ít phụ thuộc vào từng chủng Cách thử kháng nguyên giao hỗ là lấy vi khuẩn chế vacxin

đem tiêm cho thỏ rồi lấy vi khuẩn cường độc của các chủng Pasteurella khác thử

thách Nếu có kháng nguyên giao hỗ thì thỏ không chết

Kháng nguyên của Pasteurella multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi Cho đến nay, người ta đã xác định được vi khuẩn P multocida có 2 loại kháng nguyên: Kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K) và kháng

nguyên thân (kháng nguyên O) Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân bố

kháng nguyên P multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vacxin đặc hiệu Một

vacxin có hiệu lực tốt phải bao gồm các kháng nguyên tương ứng với các Serotype của các chủng phân lập được trong từng vùng hay khu vực

1.1.4.1 Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen)

Kháng nguyên vỏ K bao xung quanh thân vi khuẩn, che chở cho kháng nguyên

O khỏi bị thực bào tác động Đồng thời, kháng nguyên K ngăn cản sự tiếp xúc giữa