Xác định hóa chất bảo vệ thực vật carbamat trong một số loại rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)

Chương 1. TỔNG QUAN3 1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật3 1.1.1 Định nghĩa. 3 1.1.2. Phân loại 3

1.1.3 Tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật [9] 4

1.1.4 Tình hình tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả 5

1.1.5 Tình hình ngộ độc hóa chất bảo vệ thực vật 6

1.2 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat 7

1.2.1 Giới thiệu chung 7

1.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 12

1.3.3 Phương pháp phân tích dòng chảy (flow injection analysis – FIA) 13

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản 14

1.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 15

1.3.6 Phương pháp sắc ký khí 16

1.3.7 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 19

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.1.2.1 Xây dựng phương pháp 20

2.1.2.2 Ứng dụng phương pháp 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu 20

2.2.2.5 Detector khối phổ (Mass Spectrometry) 24

2.3 Phương tiện nghiên cứu 28

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 28

2.3.1.1 Thiết bị 28

2.3.1.2 Dụng cụ 29

2.3.3 Dung môi, hóa chất 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Tối ưu các điều kiện xác định carbamat bằng LC/MS/MS 31

3.1.1 Chọn các điều kiện chạy của detector khối phổ 31

3.1.1.1 Khảo sát điều kiện bắn phá đối với ion mẹ 31

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện bắn phá ion con 33

3.1.2 Chọn pha tĩnh 35

3.1.3 Chọn pha động 36

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 39

3.2.1 Khảo sát lập đường chuẩn 39

3.2.2 Giới hạn phát hiện LOD [10] 42

3.2.3 Giới hạn định lượng LOQ [10] 43

3.2.4 Độ chính xác của phép đo 44

3.3 Khảo sát điều kiện xử lí mẫu 45

3.3.1 Khảo sát dung môi chiết 46

3.3.2 Khảo sát dung môi rửa giải 48

3.3.3 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải 50

3.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 51

3.4 Phân tích mẫu thực tế 53

Chương 4 KẾT LUẬN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 66

MỞ ĐẦU

Theo dự báo của Uỷ ban Dân số và Phát triển của Liên hợp quốc, vào giữa thế kỉ XXI dân số thế giới sẽ tăng thêm 03 tỉ người Dân số ngày càng tăng nhanh đã tạo ra gánh nặng cho nền sản xuất nông nghiệp lương thực, vì cùng với một diện tích canh tác nhất định và đang có xu hướng bị thu hẹp lại phải cung cấp đủ số lượng lương thực cho số đầu người luôn gia tăng Để tăng năng suất lao động, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp đan xen như: thâm canh tăng vụ, cải tiến giống ; một trong những biện pháp không thể thiếu là sử dụng thuốc bảo vệ thực vật [9]

Thuốc bảo vệ thực vật được coi là một vũ khí có hiệu quả của con người trong việc phòng chống dịch hại, bảo vệ cây trồng Bên cạnh ưu điểm là bảo vệ năng suất cây trồng, thuốc bảo vệ thực vật còn gây ra nhiều tác tác hại khác như làm ô nhiễm môi trường, gây độc cho người và gia súc, tăng chi phi sản xuất, và nhất là để lại tồn dư trong nông sản gây ảnh hưởng đến chất lượng nông sản và sức khỏe người tiêu dùng Tác động tiêu cực của thuốc bảo vệ thực vật càng trở nên nghiêm trọng khi con người sử dụng không đúng cách và quá lạm dụng vào thuốc

Hóa chất bảo vệ thực vật có nhiều nhóm hóa chất khác nhau, trong đó có bốn nhóm chính là: lân hữu cơ, clo hữu cơ, carbamat và pyrethroid Nhóm clo hữu cơ đã bị cấm sử dụng, nhóm pyrethroid vẫn đang được sử dụng nhưng độc tính thấp, ít có khả năng gây nhiễm độc cho người sử dụng Còn lại 2 nhóm: lân hữu cơ và carbamat đang được dùng rộng rãi trong nông nghiệp , có độc tính cao và là nguyên nhân chính của phần lớn các vụ ngộ độc do ăn rau quả nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật ở nước ta hiện nay

Với những lí do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Xác định hóa chất bảo vệ

thực vật carbamat trong một số loại rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)”.

Mục tiêu thực hiện đề tài luận văn là:

1 Xây dựng phương pháp xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật carbamat trong rau quả, bao gồm:

 Thẩm định phương pháp đã xây dựng

2 Áp dụng phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật carbamate để khảo sát một số mẫu rau quả trên địa bàn Hà Nội.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật1.1.1 Định nghĩa

Hóa chất bảo vệ thực vật là những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học được dùng để phòng và trừ sinh vật gây hại cây trồng và nông sản Hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều nhóm khác nhau, gọi theo tên nhóm sinh vật gây hại, như thuốc trừ sâu dùng để trừ sâu hại, thuốc trừ bệnh dùng để trừ bệnh cây…

1.1.2 Phân loại [9]

Các loại hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều loại, chủ yếu gồm 4 nhóm chính: - Nhóm Clo hữu cơ (organnochlorine) là các dẫn xuất clo của một số hợp chất hữu cơ như diphenyletan, cyclodien, benzen, hexan Nhóm này bao gồm những hợp chất hữu cơ rất bền vững trong môi trường tự nhiên và thời gian bán phân huỷ dài (ví dụ như DDT có thời gian bán phân huỷ là 20 năm, chúng ít bị đào thải và tích luỹ vào cơ thể sinh vật qua chuỗi thức ăn) Đại diện của nhóm này là Aldrin, Dieldrin, DDT, Heptachlo, Lindan, Methoxychlor

- Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus) đều là các este, là các dẫn xuất hữu cơ của acid photphoric Nhóm này có thời gian bán phân huỷ ngắn hơn so với nhóm Clo hữu cơ và được sử dụng rộng rãi hơn Nhóm này tác động vào thần kinh của côn trùng bằng cách ngăn cản sự tạo thành men Cholinestaza làm cho thần kinh hoạt động kém, làm yếu cơ, gây choáng váng và chết Nhóm này bao gồm một số hợp chất như parathion, malathion, diclovos, clopyrifos…

- Nhóm Carbamat là các dẫn xuất hữu cơ của acid cacbamic, gồm những hoá chất ít bền vững hơn trong môi trường tự nhiên, song cũng có độc tính cao đối với người và động vật Khi sử dụng, chúng tác động trực tiếp vào men Cholinestraza của hệ thần kinh và có cơ chế gây độc giống như nhóm lân hữu cơ Đại diện cho nhóm này như: carbofuran, carbaryl, carbosulfan, isoprocarb, methomyl…

- Nhóm Pyrethroid là những thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên, là hỗn hợp của các este khác nhau với cấu trúc phức tạp được tách ra từ hoa của những giống

cúc nào đó Đại diện của nhóm này gồm cypermethrin, permethrin, fenvalarate, deltamethrin,…

Ngoài ra, còn có một số nhóm khác như: các chất trừ sâu vô cơ (nhóm asen), nhóm thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, virus (thuốc trừ nấm, trừ vi khuẩn…), nhóm các hợp chất vô cơ (hợp chất của đồng, thủy ngân, …).

1.1.3 Tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật [9]

Hầu hết hóa chất bảo vệ thực vật đều độc với con người và động vật máu nóng ở các mức độ khác nhau Theo đặc tính hóa chất bảo vệ thực vật được chia làm hai loại: chất độc cấp tính và chất độc mãn tính

vào cơ thể Ở dưới liều gây chết, chúng không đủ khả năng gây tử vong, dần dần bị phân giải và bài tiết ra ngoài Loại này bao gồm các hợp chất Pyrethroid, những hợp chất Phốt pho hữu cơ, Carbamat, thuốc có nguồn gốc sinh vật

bền, khó bị phân giải và bài tiết ra ngoài Thuốc loại này gồm nhiều hợp chất chứa Clo hữu cơ, chứa Thạch tín (Asen), Chì, Thuỷ ngân; đây là những loại rất nguy hiểm cho sức khoẻ

Hóa chất bảo vệ thực vật có thể thâm nhập vào cơ thể con người và động vật qua nhiều con đường khác nhau; thông thường qua 03 đường chính: hô hấp, tiêu hoá và tiếp xúc trực tiếp Khi tiếp xúc với hóa chất bảo vệ thực vật, con người có thể bị nhiễm độc cấp tính hoặc mãn tính, tùy thuộc vào phạm vi ảnh hưởng của thuốc.

Nhiễm độc cấp tính: Là nhiễm độc tức thời khi một lượng đủ lớn hoá chất bảo vệ thực vật thâm nhập vào cơ thể Những triệu chứng nhiễm độc tăng tỉ lệ với việc tiếp xúc và trong một số trường hợp nặng có thể dẫn tới tử vong Biểu hiện bệnh lý của nhiễm độc cấp tính: mệt mỏi, ngứa da, đau đầu, lợm giọng, buồn nôn, hoa mắt

chóng mặt, khô họng, mất ngủ, tăng tiết nước bọt, yếu cơ, chảy nước mắt, sảy thai, nếu nặng có thể gây tử vong

Nhiễm độc mãn tính: Là nhiễm độc gây ra do tích luỹ dần dần trong cơ thể Thông thường, không có triệu chứng nào xuất hiện ngay trong mỗi lần nhiễm Sau một thời gian dài, một lượng chất độc lớn tích tụ trong cơ thể sẽ gây ra các triệu chứng lâm sàng Biểu hiện bệnh lý của nhiễm độc mãn tính: kích thích các tế bào ung thư phát triển, gây đẻ quái thai, dị dạng, suy giảm trí nhớ và khả năng tập trung, suy nhược nghiêm trọng, ảnh hưởng đến hệ thần kinh, gây tổn hại cho gan, thận và não.

1.1.4 Tình hình tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả

Theo báo cáo của Cục Bảo vệ thực vật, có 23% số hộ nông dân vi phạm quy định về sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, dẫn đến tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật trên nông sản Một số loại thuốc trừ sâu độc hại đã bị cấm sử dụng nhưng hiện vẫn có nhiều người tìm cách đưa về nông thôn Số mẫu rau, quả tươi có dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật chiếm từ 30-60%, trong đó số mẫu rau, quả có dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật vượt quá giới hạn cho phép chiếm từ 4-16%, một số hóa chất bảo vệ thực vật bị cấm sử dụng như Methamidophos vẫn còn dư lượng trong rau [7]

Trong năm 2006, Chi cục bảo vệ thực vật TP Hồ Chí Minh đã kiểm tra 790 mẫu của 52 đơn vị kinh doanh rau an toàn trên địa bàn thành phố, phát hiện 26 mẫu

có dư lượng thuốc trừ sâu, chiếm tỷ lệ 3,29% Nấm rơm Trà Vinh, cần tây, cải thìa,

xà lách xong, bồ ngót, bông cải xanh (súp lơ), rau dền, cần là những loại rau ăn lá có tỷ lệ dư lượng thuốc trừ sâu cao (3,94%) Đặc biệt là tình trạng vượt nhiễm thuốc trừ sâu đối với các loại rau củ quả, trái cây nhập khẩu từ Trung Quốc Kết quả kiểm tra của Chi cục bảo vệ thực vật TP.HCM cho thấy, có 5 trong tổng số 26 mẫu hàng Trung Quốc được kiểm tra có kết quả lượng thuốc trừ sâu tồn dư cao, chiếm tỷ lệ đến 19,23% [3]

Đầu năm 2009, Cục Bảo vệ thực vật đã lấy 25 mẫu rau và năm mẫu quả tại các tỉnh phía Bắc (TP Hà Nội và tỉnh Vĩnh Phúc) để kiểm định Kết quả có 11 mẫu rau có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật ở mức độ khác nhau Ở các tỉnh phía Nam,

trên 35 mẫu rau và 5 mẫu quả lấy ở TP Hồ Chí Minh, Bình Dương, Tiền Giang, kết quả trên 50% mẫu có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật ở mức độ khác nhau [11]

Tại TP Hồ Chí Minh, trong sáu tháng đầu năm 2009, qua kiểm nghiệm hơn 2.200 mẫu rau, quả tại ba chợ đầu mối (Bình Điền, Hóc Môn, Thủ Đức), phát hiện 50 mẫu dương tính (tỷ lệ 2,4%), cao hơn so với cùng kỳ năm 2008 là 1,3% Còn tại Bình Dương, phân tích gần 310 mẫu rau lấy ở các chợ, vùng sản xuất, bếp ăn tập thể trong tám tháng đầu năm 2009 có gần 80 mẫu có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật [11]

Trên thế giới, tại Ấn Độ, Cuộc điều tra được Bộ Nông nghiệp Ấn Độ tiến hành trong một năm từ tháng 11 năm 2007 đến tháng 10 năm 2008 trên toàn đất nước Ấn Độ Kết quả là 18% rau và 12% hoa quả nội địa và nhập khẩu của Ấn Độ đều có dư lượng thuốc trừ sâu, kể cả những loại thuốc trừ sâu bị cấm, trong đó 4% lượng rau và 2% lượng hoa quả có dư lượng thuốc trừ sâu cao hơn mức cho phép Khoảng 18% (664 mẫu) trong tổng số 3.648 mẫu rau như mướp tây, cà chua, bắp cải và súp lơ đều có dư lượng thuốc trừ sâu Các loại rau như bắp cải, súp lơ và cà chua có dư lượng thuốc trừ sâu lớn nhất Các loại thuốc trừ sâu tìm thấy trong các loại quả chủ yếu là chlorpyriphos, monocrotophos, profenophos và cypermethrin.[1]

1.1.5 Tình hình ngộ độc hóa chất bảo vệ thực vật

Theo thống kê của Tổ chức Lao động Quốc tế ILO, trên thế giới, hàng năm có trên 40.000 người chết vì ngộ độc rau trên tổng số 2 triệu người ngộ độc Tại Việt Nam, con số người bị ngộ độc cũng không nhỏ Từ năm 1993 - 1998, hàng chục ngàn người bị nhiễm độc do ăn phải rau quả còn dư lượng thuốc trừ sâu Nặng nhất ở Đồng bằng sông Cửu Long, năm 1995 có 13.000 người nhiễm độc, trong đó có 354 người chết [8]

Năm 1990, một thống kê quý của Tổ chức y tế thế giới (WHO) cho thấy có khoảng 25 triệu lao động trong ngành nông nghiệp bị nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật mỗi năm Cho đến nay, chúng ta vẫn chưa có những con số ước tính trên phạm vi toàn cầu, nhưng hiện có đến 1,3 tỷ lao động trong ngành nông nghiệp và có thể hàng triệu ca nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật vẫn đang xảy ra hàng năm [2]

Năm 2000, Bộ y tế Braxin ước tính trong một năm nước này có 300.000 ca nhiễm độc và 5.000 ca tử vong do hóa chất bảo vệ thực vật Trong một nghiên cứu ở Inđônêxia, 21% trong số các ca liên quan đến hóa chất bảo vệ thực vật có những dấu hiệu hay triệu chứng về tâm thần, hô hấp và tiêu hoá Trong một cuộc khảo sát của Liên hợp quốc, 88% nông dân Campuchia sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật đã từng có triệu chứng nhiễm độc [2]

1.2 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat1.2.1 Giới thiệu chung

Thuốc trừ sâu carbamat là các dẫn xuất của acid cacbamic có tính độc trừ sâu Các thuốc carbamat thường không có tính độc vạn năng như thuốc lân hữu cơ Nhiều hợp chất trong nhóm tuy có hiệu lực cao với sâu hại nhưng không có tác dụng trừ nhện hoặc chỉ có tác dụng trừ một số thuộc nhóm này mà không trừ được nhóm sâu khác Một số thuốc trong nhóm còn có cả tác dụng trừ tuyến trùng

Về cơ chế tác động của thuốc trừ sâu carbamat tương tự như các thuốc trừ sâu lân hữu cơ Các thuốc carbamat kìm hãm men cholinesteraza bằng cách cacbaryl hóa các vị trí hoạt động của toàn men Quá trình cacbaryl hóa cũng là quá trình thuận nghịch Nhưng sự liên kết giữa các thuốc carbamat với cholinesteraza thường không bền, nên có trường hợp sâu hại phục hồi được Các thuốc lân hữu cơ chỉ kết hợp với các gốc hoạt động của men, nên các thuốc lân hữu cơ có độ thủy phân càng mạnh, càng dễ gây độc cho côn trùng ; ngược lại các thuốc carbamat chỉ ức chế được men cholinesteraza khi toàn bộ phân tử của chúng gắn được lên bề mặt của men Các chất carbamat càng bền, càng ức chế men cholinesteraza mạnh Cả lân hữu cơ và carbamat đều kìm hãm vị trí men tác động, dẫn đến hệ thần kinh không kiểm soát được, làm mất khả năng phối hợp giữa các cơ quan, giải phóng quá mức hormon, sinh vật mất nước và chết

Các thuốc carbamat an toàn với cây, ít độc đối với cá hơn các thuốc lân hữu cơ; không tồn lưu quá lâu trên nông sản và môi trường sống Độ độc của thuốc đối với động vật máu nóng rất khác nhau, tùy thuộc vào loại thuốc

Các chất chủ yếu thuộc nhóm bao gồm: carbaryl, methiocarb, pirimicarb, oxamyl, carbendazim, propoxur, aminocarb, aldicarb…

1.2.2 Carbofuran [13]

Carbofuran là một trong những thuốc trừ sâu nhóm carbamat độc nhất, có tên là 2,3-dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranyl methylcarbamate, tên thương mại là Furadan, Curater.

Carbofuran là một trong những thuốc trừ sâu có độc tính cao đối với con người Nó có thể xâm nhập vào cơ thể qua hô hấp, qua miệng và qua da Triệu chứng khi bị ngộ độc carbofuran: buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy, giảm tầm nhìn… Ở liều cao có thể gây tử vong Chỉ cần uống 1ml carbofuran cũng có thể dẫn tới tử vong

Theo WHO, mức hấp thụ hàng ngày cho phép (ADI) của carbofuran là 0,01mg/kg trọng lượng cơ thể Liều gây chết trung bình đối với chuột qua miệng là LD50 = 5mg/kg

1.2.3 Carbaryl [20]

Carbaryl có tên là 1-naphthyl methylcarbamate, tên thương mại là Sevin, là một loại thuốc trừ sâu nhóm carbamat Carbayl là tinh thể màu trắng, tan kém trong nước nhưng tan nhiều trong dung môi phân cực như đimethyl sulfoxide và đimethyl formaldehyde.

Công thức phân tử: C12H15NO3.M = 221,25g/mol.

tnc = 151°C.d = 1,18g/cm3.

Công thức phân tử C12H11NO2.M = 201,2g/mol.

ts = 145°C.d = 1,232g/cm3.

Carbaryl là một chất ức chế men cholinesteraza và có độc với con người Nó được xếp vào loại chất gây ung thư đối với con người Carbaryl là một chất rắn, có màu trắng hoặc xám tùy thuộc vào độ tinh khiết của nó, tinh thể không mùi Carbaryl là một thuốc trừ sâu có độc tính trung bình Khi tiếp xúc với carbaryl có thể gây ra ngộ độc cấp và mãn tính với các triệu chứng như: buồn nôn, chuột rút dạ dày, tiêu chảy Các triệu chứng khác ở liều lượng cao bao gồm đổ mồ hôi, làm mờ của tầm nhìn, và co giật, ảnh hưởng đến phổi, thận và gan

Mức hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của carbaryl là 0,1mg/kg trọng lượng cơ thể Đối với chuột, liều gây chết trung bình qua miệng LD50 = 250 – 850mg/kg, liều gây chết trung bình qua hô hấp LC50 = 0,005 – 0,023mg/kg.

Fenobucarb tan kém trong nước, tan tốt trong các dung môi Acetone, Benzene, Toluene, xylene Fenobucarb được sử dụng làm thuốc trừ sâu trên lúa và bông, rất

độc hại đối với con người, nó ảnh hưởng đến hệ thần kinh, bộ phận sinh sản, gây ung thư và ngộ độc cấp tính Liều gây chết trung bình qua miệng đối với chuột là 410mg/kg.

Đối với chuột, liều gây chết trung bình qua miệng là 90 – 128mg/kg, qua da là 800 – 1000mg/kg Theo WHO, mức hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của propoxur là 0,02mg/kg trọng lượng cơ thể

1.2.6 Giới hạn cho phép

Dư lượng là phần còn lại của hoạt chất, các sản phẩm chuyển hóa và các thành phần khác có trong thuốc, tồn tại trên cây trồng, nông sản, đất, nước sau một thời gian dưới tác động của hệ sống và điều kiện ngoại cảnh Dư lượng của thuốc được tính bằng mg thuốc có trong 1kg nông sản, đất hay nước.

Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) là giới hạn dư lượng của một loại thuốc, được phép tồn tại về mặt pháp lí hoặc xem như có thể chấp nhận được ở trong hay trên nông sản, thức ăn gia súc mà không gây hại cho người sử dụng và vật nuôi khi ăn các nông sản đó.

Bảng 1 Mức dư lượng tối đa cho phép sử dụng thuốc trừ sâu carbamat ở một

số quốc gia [6]

Việt Nam(Quyết định 46/2007/QĐ-

Trong phương pháp này, người ta phân cực điện cực giọt thủy ngân bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với thời gian để nghiên cứu các quá trình khử cực của chất phân tích trên điện cực đó Vì vậy, thiết bị cực phổ gồm hai phần chính là máy cực phổ và hệ điện cực bao gồm điện cực giọt thuỷ ngân và điện cực so sánh Đường cực phổ biểu diễn sự phụ thuộc của chiều cao cường độ dòng với nồng độ

hiện đại như cực phổ sóng vuông, cực phổ xung vi phân [5]

A Guiberteau , T Galeano Diáz, F Salinas và J.M Ortiz [12] đã xác định carbaryl và carbofuran bằng phương pháp cực phổ xung vi phân Phương pháp được

ứng dụng xác định các mẫu nước sông Các mẫu nước sau khi xử lí sẽ được xác định bằng phương pháp cực phổ xung vi phân với các điều kiện sau: tốc độ quét 20mV/s (bước nhảy thế: 5mV, khoảng thời gian 0,25s), biên độ xung 50mV trong khoảng từ

1.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Các tác giả Urmila Tamrakar, Vinay K Gupta và Ajai K Pillai [32] đã xác định đồng thời 3 loại thuốc trừ sâu nhóm carbamat bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử Phương pháp dựa trên sự tạo mầu của carbamat với thuốc thử p-aminoacetanlide Khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert - Beer của carbaryl, propoxur và carbosulfan tương ứng là 0,04 – 0,36µg/ml, 0,032 – 0,32µg/ml và 0,08 – 0,64µg/ml Phương pháp đã được áp dụng để phân tích thuốc trừ sâu nhóm carbamat trên các mẫu rau, đất, thức ăn, nước … với hiệu suất thu hồi khoảng 95%.

Tác giả L Alvarez-Rodriguez [26] đã xác định thuốc trừ sâu carbamat như carbaryl, bendiocarb, carbofuran, methiocarb, promecarb và propoxur bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử tại bước sóng 510nm Các thuốc trừ sâu được thủy phân trong môi trường kiềm nhẹ tạo thành 1-naphtol hoặc phenolate, sau đó nó sẽ tạo mầu với diazo trimethylanilin có chứa mixen natri dodecyl sunfat Giới hạn phát hiện của phương pháp trong khoảng 0,2 – 2mg/ml.

Phương pháp xác định carbosulfan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử đã được các tác giả Y.Koteswara Rao, K Lokanath Swaroop, P.Chiranjeevi, B Rangamannar [35] đề cập Carbosulfan được thủy phân trong môi trường kiềm tạo thành hợp chất phenolic và tạo cặp với 2, 4-dimethoxy aniline trong môi trường có chứa chất oxi hóa K2Cr2O7 để tạo thành một hợp chất mang màu cyanogen Chất cyanogen này được chiết vào chloroform tại pH=3,5 và đo phổ tại bước sóng 430nm Khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert - Beer của carbosulfan là 0,1 – 1,0ppm Độ thu hồi của phương pháp trên các mẫu nước uống, gạo và lúa mì đều trên 93%

Tác giả O Bhargavi và cộng sự [31] đã phát triển một kĩ thuật quang phổ hấp thụ phân tử đơn giản và nhạy xác định carbofuran trong các mẫu nước và mẫu hạt Carbofuran được thủy phân trong môi trường kiềm và tương tác với muối diazo 4, 4-azo-bis-3, 3’, 5, 5’-tetrabromo aniline tạo thành chất mầu đỏ và xác định tại bước sóng 470nm Khoảng tuân theo định luật Lambert - Beer của carbofuran là 0,1 – 16,0µg/ml

Các phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử chỉ phân tích được một loại carbamat nào đó hoặc phân tích đồng thời một số carbamat Hơn nữa, phương pháp có độ nhạy kém Do đó, hiện nay phương pháp này rất ít được ứng dụng để phân tích carbamat.

1.3.3 Phương pháp phân tích dòng chảy (flow injection analysis – FIA)

Phân tích dòng chảy là một kĩ thuật phân tích động, trong đó mẫu phân tích ở dạng lỏng được bơm vào dòng chất mang chuyển động liên tục Sau đó trong vòng phản ứng chất phân tích sẽ phản ứng với thuốc thử có trong dòng chất mang, hay được bơm trực tiếp vào đầu vòng phản ứng, để tạo ra một sản phẩm có thể phát hiện được theo một tính chất hóa lí nào đó nhờ một loại detector phù hợp Các tính chất hóa lí đó thường là: sự hấp thụ quang phân tử UV-VIS và nguyên tử, tính chất phát xạ của nguyên tử, tính chất huỳnh quang, sự thay đổi chiết suất, tính chất điện hóa Ứng với mỗi tính chất người ta có một loại detector [4]

Tác giả Ana M García-Campana và cộng sự [23] đã phát triển phương pháp mới để xác định carbaryl trong thực phẩm thực vật và nước tự nhiên bằng kĩ thuật phân tích dòng chảy Đối với mẫu nước, lọc qua màng lọc 0,45µm rồi tiến hành phân tích Đối với mẫu quả, tiến hành chiết mẫu bằng etylacetat và làm sạch qua các loại cột chiết pha rắn như nhôm oxit, SAX, C18, silica Hiệu suất chiết tốt nhất khi sử dụng cột nhôm oxit Carbayl chỉ phát huỳnh quang khi có của chất oxi hóa KMnO4 trong môi trường kiềm nhẹ Hệ thống phân tích dòng chảy để xác định carbaryl gồm 3 kênh chứa 3 dung dịch khác nhau: NaOH, luminol và KMnO4 Tại các điều kiện tối ưu, khoảng tuyến tính carbaryl từ 5 – 100ng/ml và giới hạn phát hiện là 4,9ng/ml

Đây là một phương pháp đơn giản, nhanh và dễ dàng kết hợp với phương pháp sắc ký lỏng để xác định đồng thời một số carbamat.

Một phương pháp xác định carbaryl bằng kĩ thuật phân tích dòng chảy sử dụng detector UV – Vis đã được các tác giả Karim D Khalaf, A Morales-Rubio và M de la Guardia [25] nghiên cứu Mẫu được chiết với xylen và bơm vào hệ thống phân tích dòng chảy Tại đây, carbaryl sẽ phản ứng với naphtholate và dung dịch p-aminophenol 50pg/ml trong sự có mặt của dung dịch KIO4 0,004M để tạo thành hợp chất mang màu iodophenol Chất này được xác định bằng detector UV – Vis tại

H2O và NaOH Phương pháp có giới hạn phát hiện 26,5ng/ml với tần suất bơm mẫu 110 lần/giờ Độ thu hồi carbaryl trên các nền mẫu khác nhau khá cao từ 95 – 102%.

Một phương pháp phân tích dòng chảy sử dụng detector huỳnh quang để xác định carbofuran đã được đề cập Phương pháp dựa trên phản ứng của carbofuran với KMnO4 và luminol trong môi trường kiềm nhẹ sẽ tạ thành hợp chất màu Carbofuran bị oxi hóa tạo thành anion 3-aminophthalate – dạng kích thích bền và được xác định bằng detector huỳnh quang Khoảng tuyến tính của carbofuran từ 0,06 – 0,5µg/ml, giới hạn phát hiện 0,02µg/ml Phương pháp đã ứng dụng thành công xác định dư lượng carbofuran trong mẫu rau diếp.[24]

Phương pháp phân tích dòng chảy có ưu điểm là nhanh, thiết bị phân tích dễ kiếm và rẻ tiền Tuy nhiên, phương pháp không thể xác định đồng thời các chất carbamat Do vậy, phương pháp cũng ít được ứng dụng để phân tích carbamat.

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản

Ling Wang và cộng sự [34] đã tách và xác định dư lượng thuốc trừ sâu carbamat bằng phương pháp điện di mao quản đẳng áp Cột mao quản có đường kính 75µm được nhồi hạt ODS 3µm Pha động bao gồm 30% acetonitril và 70% dung dịch đệm CH3COONH4 5mM (pH=6,5) chứa 1mM SDS và 0,01% trietylamine (TEA) Tại các điều kiện tối ưu, 10 carbamat đã được tách nhanh trong vòng 20 phút Các mẫu rau được làm sạch qua SPE Phương pháp có giới hạn phát hiện từ 0,05 – 1,6mg/

kg và hiệu suất thu hồi từ 51,3 – 109,2% với độ lệch chuẩn RSD < 11,4% Phương pháp đã được áp dụng để xác định 10 loại carbamat trong một số loại rau.

Xác định dư lượng fenoxycarb trong lúa mì bằng phương pháp điện di mao quản khô và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Các mẫu bột mì được chiết với aceton rồi được làm sạch bằng cách chiết lỏng-lỏng với diclometan Phương pháp HPLC sử dụng detector UV tại bước sóng λ = 199nm, cột C18 và pha động là MeOH : H2O = 6 : 4 (theo thể tích) Phương pháp điện di sử dụng mao quản đường kính 50µm x 48,5cm x 48cm chiều dài hiệu dụng, thế giữa hai đầu là 30kV, dung dịch đêm CH3COONH4 20mM (pH=9) trong 95% MeOH Cả hai phương pháp đều có giới han phát hiện thấp 0,008mg/kg đối với HPLC và 0,024mg/kg đối với điện di mao quản khô và hiệu suất thu hồi cao trên 85% Hai phương pháp đã được ứng dụng để xác định fenoxycarb trong các mẫu lúa mì.[28]

Phương pháp sắc ký mao quản điện động học mixen đã xác định đồng thời aldicarb, carbofuran và một số dạng chuyển hóa của nó trong nước bề mặt Các mẫu được được làm sạch qua cột chiết pha rắn có chứa 500mg than hoạt tính Các chất được tách bằng hệ thống sắc ký mao quản điện động học mixen sử dụng cột mao quản có đường kính 75µm, chiều dài hiệu dụng của cột 50cm Các chất được tách trong môi trường đệm natri borat/acid clohidric (20mM, pH=8) và sử dụng natri dodecyl sunfat 140mM làm chất hoạt động bề mặt để tạo ra các mixen Các điều kiện chạy máy: điện thế tách 23kV, thời gian bơm mẫu 12s, nhiệt độ cột tách 25°C và detector UV tại bước sóng 210nm Phương pháp có giới hạn phát hiện từ 2 – 7,4µg/l, độ thu hồi cao từ 77 – 97% với độ lệch chuẩn tương đối 2 – 7%.[15]

Kĩ thuật điện di mao quản là một kĩ thuật mới được phát triển khoảng hơn 10 năm trở lại đây Đây là một kĩ thuật có thời gian phân tích nhanh, tốn ít dung môi và hóa chất Việc xác định các hóa chất bảo vệ thực vật bằng thiết bị này vẫn đang được nghiên cứu và chưa có nhiều loại thuốc trừ sâu được xác định bằng phương pháp này

1.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tác giả Elvira Grou và cộng sự [16] đã xác định thuốc bảo vệ thực vật carbamat trong đất và nước bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV ở bước sóng 254nm Các mẫu nước được chiết lỏng lỏng với diclometan, các mẫu đất được làm sạch bằng cột florisil Dịch chiết được đem cô quay đến cạn, hòa cặn bằng 1ml metanol và đem đo Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với mẫu nước từ 0,005 – 0,01µg/g, đối với mẫu đất từ 0,05 – 0,1µg/g

Tác giả Feng Tang và cộng sự [17] đã xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat trong sau bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC tại 2 bước sóng λ = 243nm và λ = 207nm Phương pháp có hiệu suất thu hồi từ 70,13 – 103,7% tại nồng độ 1 – 5mg/kg

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detetor huỳnh quang xác định đồng thời các chất carbamat như aldicarb, propoxur, carbofuran, carbaryl và methiocarb trong mật Mẫu được chiết bằng methanol và cho qua cột florisil để làm sạch Sử dụng dung môi diclometan:hexan = 1:1 rửa giải các chất carbamat ra khỏi cột Dịch rửa giải đem cô quay ở 40°C đến cạn và hòa cặn bằng 1ml acetonitril Các chất carbamat được tách và xác định đồng thời bằng hệ thống sắc ký lỏng với detector huỳnh quang ghép nối với tiền cột Phương pháp có giới hạn phát hiện thấp từ 4 – 5ng/g và độ thu hồi tương đối cao từ 72,02 – 92,02% ứng với nồng độ từ 50 – 200ng/g.[18]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp thông dụng để xác định các hợp chất hữu cơ Phương pháp này đã được ứng dụng để xác định đồng thời các chất carbamat Tuy nhiên, phương pháp có độ nhạy kém khi sử dụng detector UV, còn khi sử dụng detector huỳnh quang, phương pháp có độ nhạy tốt hơn nhưng chỉ có thể nhận biết chất phân tích thông qua thời gian lưu Đối với những nền mẫu phức tạp, các chất phân tích rất dễ bị ảnh hưởng bởi nền mẫu, nếu chỉ dựa vào thời gian lưu sẽ rất khó để có thể khẳng định chất cần phân tích.

1.3.6 Phương pháp sắc ký khí

Xác định ethylcarbamat trong đồ uống bằng phương pháp sắc ký khí với detector bắt điện tử và sắc ký khí khối phổ Các mẫu được pha loãng bằng ethanol 10% rồi được chiết bằng diclometan Dịch chiết được đem cô đến gần cạn và đem đo Phương pháp này đã được đánh giá ở 5 phòng thí nghiệm với 4 phòng sử dụng detector ECD và 1 phòng sử dụng detector MS Giới hạn phát hiện của phương pháp thấp, khoảng 5µg/kg đối với detector ECD và 0,5µg/kg đối với detector MS.[14]

Xác định thuốc trừ sâu carbamat và nhóm nito hữu cơ trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Phương pháp đã xác định đồng thời 29 loại thuốc trừ sâu trong một số thực phẩm như táo, khoai tây, gạo, chuối… Mẫu được chiết bằng aceton và được làm sạch bằng 3 loại cột chiết pha rắn khác nhau: cột diatomaceous, cột diatomit kết hợp với cột C18, cột florisil Hiệu suất chiết các mẫu thực phẩm bằng 3 loại cột đều trên 80% Sau đó, mẫu được xác định bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Chương trình chạy khối phổ được chia làm 7 cửa sổ thời gian lưu và mỗi cửa sổ có từ 10 – 15 mảnh ion con Giới hạn phát hiện của phương pháp thấp từ 0,01 – 0,1µg/ml [27]

Xác định đa dư lượng thuốc trừ sâu trong nước táo bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ Mẫu nước táo được chiết bằng phương pháp khuếch tán trên nền pha rắn diatomaceous (tảo cát) và rửa giải bằng dung môi hexan:diclometan = 1:1 tốc độ 5ml/phút Phương pháp có độ thu hồi 70 – 110% và hệ số biến thiên từ 1,62 – 18,3% với khoảng nồng độ 0,01 – 0,2mg/kg [33]

Phương pháp sắc ký khí đã được ứng dụng rộng rãi để xác định các hóa chất bảo vệ thực vật như các chất clo hữu cơ, lân hữu cơ, pyrethroid và carbamat Tuy nhiên phương pháp chỉ phân tích được những chất dễ bay hơi, còn các chất khó bay hơi thì phải tạo dẫn xuất nên tốn thời gian và hóa chất Hơn nữa, để phân tích được đồng thời các chất thì cần thời gian phân tích dài Do vậy, phương pháp ít được ứng dụng để phân tích carbamat

1.3.7 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Gianni Sagratini và cộng sự [19] đã xác định dư lượng thuốc trừ sâu carbamat và phenylure trong một số loại quả bằng phương pháp vi chiết pha rắn và sắc ký lỏng khối phổ Điều kiện chiết mẫu tối ưu ở nhiệt độ 20°C, thời gian hấp phụ mẫu là 90 phút và thể tích mẫu 1ml Các sợi silica được phủ 3 loại chất hấp phụ: cacbowax 50µm, polydimetylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB) 60µm và polyacrylat 85µm Giới hạn định lượng của phương pháp từ 0,005 – 0,05µg/ml, tùy thuộc từng chất Phương pháp đã được ứng dụng để xác định thuốc trừ sâu trong các mẫu quả.

Xác định đồng thời hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat và lân hữu cơ trong rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Mẫu được chiết bằng acetonitril, sau đó được tách bằng cách chiết pha rắn khuếch tán (dispersive – SPE) với chất hấp phụ là primary secondary amine (amin bậc một hai) Hiệu suất thu hồi cao, từ 70 – 110% với RSD < 8% Giới hạn phát hiện thấp 0,5 – 10ng/ml, túy thuộc từng chất Phương pháp đã được ứng dụng để xác định thuốc trừ sâu trong rau quả Trong 25 mẫu rau quả được lấy từ các chợ, gần 70% mẫu chứa một hoặc vài loại thuốc trừ sâu, trên 30% mẫu còn lại chứa nhiều loại thuốc trừ sâu Tuy nhiên, tất cả các nồng độ thuốc trừ sâu tìm thấy đếu thấp hơn giới hạn cho phép.[29]

Xác định dư lượng carbamat trong rau quả bằng phương pháp khuếch tán trên nền pha rắn và sắc ký lỏng khối phổ Mẫu được chiết trên nền các pha rắn khác nhau: C8, C18, NH2, CN và phenyl Hiệu suất chiết tốt nhất trên nền pha rắn C8 đạt từ 64 – 106% với RSD 5 – 15% Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 0,001 – 0,01mg/kg, thấp hơn giới hạn cho phép của châu Âu từ 10 – 100 lần Phương pháp được ứng dụng để xác định carbamat trong các mẫu rau quả tại các chợ ở Valencian.[30]

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là một kĩ thuật mới được phát triển trong những năm gần đây Về cơ bản, nó là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ Phương pháp này tuy mới ra đời nhưng nó được ứng dụng rộng rãi để phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu đặc biệt là nhóm carbamat Phương pháp có thể phân tích đồng thời từ hàng chục đến hàng trăm các loại thuốc trừ sâu khác nhau Phương pháp có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện

thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kí lỏng thường không làm được

Với những ưu điểm trên, chúng tôi đã chọn phương pháp sắc kí lỏng khối phổ để nghiên cứu xác định đồng thời các chất carbamat.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Hiện nay, nhiều người nông dân đã lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật làm cho dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong nhiều mẫu rau vượt giới hạn cho phép hàng chục lần; nhất là các loại rau ăn lá như cải ngọt, mồng tơi, cải bẹ xanh, cải bắp, cải thảo, rau muống, dưa leo…Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong các loại rau quả quá cao đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường và sức khỏe con người, là nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm Do đó, đối tượng nghiên cứu là một số loại rau như rau cải, rau thơm, rau rền, bắp cải, và một số loại quả như cam, lê, táo, quýt… Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời các chất carbamat trong rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối-phổ khối phổ LC/MS/MS.

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau:

2.1.2.1 Xây dựng phương pháp

 Khảo sát phương pháp bao gồm:Điều kiện tách chiết mẫuĐiều kiện chạy máy Thẩm định phương pháp:

Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQKhoảng tuyến tính

Trong bản luận văn này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp chiết lỏng lỏng để tách chiết và làm giàu mẫu Thông thường, phương pháp này sử dụng hai pha lỏng không trộn lẫn Tuy nhiên, chúng tôi sử dụng một loại hạt nhồi là kieselguhr như chất mang trong sắc ký phân bố lỏng – lỏng

Kieselguhr hay còn gọi là diatomaecous earth (đất diatomit) hay Celite, có màu trắng ngà, có khoảng pH làm việc rộng từ 1 – 13 Nó được sử dụng để chiết lỏng

– lỏng các mẫu thực phẩm mà không cần dùng đến phễu chiết Mẫu sau khi chiết bằng dung môi phân cực ở dạng lỏng được đưa qua cột đã nhồi hạt kieselguhr và được giữ lại ở trên cột Sau đó chất phân tích được rửa giải bằng dung môi không phân cực

Sử dụng cột nhồi hạt kieselguhr có ưu điểm hơn so với chiết lỏng – lỏng thông thường như thời gian chiết nhanh hơn, không cần phải mất thời gian để tách lớp, lượng dung môi sử dụng rửa giải ít hơn nhiều, có độ thu hồi và độ lặp lại cao

2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

2.2.2.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Sơ đồ cấu tạo thiết bị HPLC được chỉ ra ở hình 2.1.

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có tính đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký phân bố lỏng – lỏng và sắc ký trao đổi lỏng – rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn…

2.2.2.2 Pha tĩnh trong HPLC

Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7mm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha ngược (RP-HPLC)

silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN ), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan, toluene Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực.

không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37, còn pha động phân cực: nước, methanol, axetonitril Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực

2.2.2.3 Pha động trong HPLC

Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhưng nhìn chung phải đáp ứng được các điều kiện sau:

hủy trong quá trình chạy sắc ký.

cân bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion tuỳ theo bản chất của từng loại sắc ký.

Có thể chia pha động làm hai loại:

nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực như MeOH, ACN Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết ngược.

xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluene Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ.

phát huỳnh quang Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần

phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.

kim loại chuyển tiếp

Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến như diot-aray, mass spectrometry, nó giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích Ngoài ra do kĩ thuật tin học phát triển, người phân tích có thể thực hiện phép tách theo chương trình định sẵn, có thể thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích.

2.2.2.5 Detector khối phổ (Mass Spectrometry)

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất.

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ.

2.2.2.5.1 Nguồn ion

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB) Dưới đây là hai phương pháp ion hóa được sử dụng trên thiết bị Finnigan LCQDUO:

a) Ion hóa phun điện tử – ESI

Kĩ thuật này chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí Dung dịch mẫu được dẫn vào vùng có trường điện từ mạnh được duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm.

Hình 2.2 Kĩ thuật ESI bắn phá với chế độ ion dương

Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol, và các chất phân cực có khối lượng phân tử nhỏ.

b) Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển – APCI

Đây cũng là một kĩ thuật ion hóa mềm APCI được sử dụng để phân tích các chất có khối lượng phân tử trung bình Kĩ thuật này có thể bắn phá ở 2 chế độ: ion âm và ion dương

Hình 2.3 Kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương

Chất phân tích và dung môi ở dạng lỏng được chuyển thành các giọt nhỏ rồi hóa hơi ở nhiệt độ cao khoảng 500°C Một điện thế cao từ 3 – 5kV tạo ra các electrron và ion hóa chất phân tích Đối với kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương, sự ion hóa mẫu được thực hiện qua 3 giai đoạn:

 Giai đoạn thứ nhất:

22 Giai đoạn thứ hai:

 Giai đoạn thứ ba:

APCI là một kĩ thuật ion hóa mạnh, nó không bị ảnh hưởng khi thay đổi đệm chạy và nồng độ đệm Nó được sử dụng để ion hóa các chất có khối lượng phân tử nhỏ (có khối lượng phân tử < 2000u).

2.2.2.5.2 Bộ phận phân tích khối lượng

a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)

Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF) Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc khối Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này.

b) Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dưới Trái với

lại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đường cong ổn định được bẫy lại cho đến khi một điện áp RF được đặt trên điện cực vòng Các ion khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và sẽ có hướng đi về phía detector Do điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu được một phổ khối lượng đầy đủ.

Các ion tồn tại trong bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu được các mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần) Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thường chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần.

c) Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)

Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng Do các ion có cùng năng lượng nhưng lại khác nhau về khối lượng nên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có vận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này được gọi là thiết bị phân tích thời gian bay do tỉ số m/z được xác định bởi thời gian bay của các ion Thời gian bay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động học của các ion Độ phân giải của bộ phân tích thời

gian bay thấp nhưng nó có ưu điểm là khối lượng ion có thể phân tích không bị hạn chế.

2.2.2.5.3 Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang

Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phôtpho và giải phóng ra các photon Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn.

2.3 Phương tiện nghiên cứu2.3.1 Thiết bị, dụng cụ2.3.1.1 Thiết bị

gồm: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS

 Máy đồng nhất mẫu. Máy li tâm MIKRO 22R.

 Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg). Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).

 Máy cất quay chân không Eyela.

2.3.3 Dung môi, hóa chất

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết.

o Methanol.o n-hexan.

o NaCl.

o Nước cất 2 lần.

* Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/l: Cân chính xác 0,1g chất chuẩn lần lượt của từng carbamat, hoà tan cho vào từng bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol Chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 – 5°C.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 10mg/l: lấy chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc của mỗi carbamat 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 200µg/l: lấy chính xác 0,2ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 10mg/l cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol.

* Chuẩn bị dung môi pha động

- Kênh A: dung dịch acid focmic 0,1% trong nước: lấy chính xác 1ml acid focmic vào bình định mức 1000ml và định mức đến vạch bằng nước cất.

- Kênh B: methanol.

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1 Tối ưu các điều kiện xác định carbamat bằng LC/MS/MS3.1.1 Chọn các điều kiện chạy của detector khối phổ

3.1.1.1 Khảo sát điều kiện bắn phá đối với ion mẹ

Các chất carbamat có khối lượng phân tử nhỏ và kém phân cực Qua tham khảo một số bài báo, chúng tôi khảo sát tiến hành xác định carbamat bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn ion dương Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, dùng xyranh 500µl bơm từng chuẩn carbamat 1000ppb vào detector để khảo sát Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất carbamat, tối ưu hóa từng ion mẹ, ta được điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1.

Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI

Tốc độ khí phun = 80 (arb)Tốc độ khí bổ trợ = 10 (arb)

Thế phun điện tử = 4kVNhiệt độ mao quản = 270 °C

Trong kĩ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn ion dương, các ion mẹ thường ở dạng (M+1) Tiến hành khảo sát bắn phá các ion mẹ, kết quả như sau:

Hình 3.1 Phổ khối ion mẹ của carbaryl

ks carbofuran #761RT:10.17AV:1NL:2.98E7

F:+ c ESI Full ms [ 150.00-230.00]

Hình 3.2 Phổ khối ion mẹ của carbofuran

T:+ c ESI Full ms [ 110.00-220.00]

118.98130.39144.39158.23168.22 175.26196.42205.01

Hình 3.3 Phổ khối ion mẹ của fenobucarb

ks propoxur #473RT:9.18AV:1NL:3.26E7

T:+ c ESI Full ms [ 110.00-230.00]

111.16 125.09 130.58 144.18 153.15 180.28 185.31 196.23 208.36211.93

Hình 3.4 Phổ khối ion mẹ của propoxur

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện bắn phá ion con

Detector được sử dụng trong nghiên cứu này là khối phổ hai lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc chọn được ion con là rất quan trọng Ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao thì cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá thích hợp Dùng xyranh 500µl bơm từng chuẩn vào detector và để máy tự động tối ưu hóa mức năng lượng bắn phá ion mẹ để tạo các ion con Kết quả thu được ở bảng 3.2.

Bảng 3.3 Năng lượng bắn phá và các ion con của carbamat

Carbamat Ion mẹ Năng lượng bắn phá

Hình 3.5 Phổ khối ion con của Carbofuran sau khi bắn phá

Fenobucarb #857RT:14.57AV:1NL:1.39E5

F:+ c ESI Full ms2 208.00@37.00 [ 55.00-230.00]

148.3585.61

F:+ c ESI Full ms2 210.00@45.00 [ 55.00-230.00]

Hình 3.7 Phổ khối ion con của Propoxur sau khi bắn phá

Carbaryl #1002RT:14.24AV:1NL:5.87E4F:+ c ESI Full ms2 202.00@45.00 [ 55.00-230.00]

102030405060708090100

3.1.3 Chọn pha động

Trong phương pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dương, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid focmic Dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp carbamat 1000ppb để khảo sát thành phần pha động khi có thêm chất trên, các điều kiện chạy máy được cố định như sau:

- Detector: khối phổ.

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thành phần pha động

Nhận xét: Sử dụng pha động là acid focmic 0,1% cho diện tích pic cao nhất, tăng độ nhạy của phương pháp Do đó, chúng tôi chọn pha động là methanol và dung dịch acid focmic 0,1% trong nước cho các khảo sát tiếp theo.

Trong phương pháp nghiên cứu, pha tĩnh sử dụng là cột C18, ít phân cực nên pha động phải là hệ dung môi phân cực Chất tan ít phân cực sẽ bị lưu giữ trong cột lâu hơn chất tan phân cực Do tính chất kém phân cực của các chất nhóm carbamat nên chúng tôi chọn pha động trên 2 kênh:

o Kênh B: dung môi methanol.

Chọn dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 chất nhóm carbamat 1000ppb để khảo sát tỉ lệ dung môi, cố định các điều kiện:

- Detector: MS/MS.

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi pha động được chỉ ra ở bảng dưới đây.

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi pha động tới thời gian lưu.

50 50 11,48 11,49 17,82 Không thấyNhận xét: Từ bảng kết quả trên ta thấy, khi để thành phần pha động chạy với chế độ đẳng dòng isocractic, tỉ lệ methanol càng cao, thời gian lưu càng giảm, các chất không tách ra khỏi nhau Hơn nữa, khi chất phân tích ra quá sớm, rất dễ bị ảnh hưởng bởi các tạp chất Ngược lại, khi lượng methanol càng giảm thì thời gian lưu tăng, các chất tách ra khỏi nhau nhưng thời gian chết giữa các chất cũng tăng theo, làm tăng thời gian phân tích và tốn dung môi Do đó, để có thể vừa tách được các chất, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi, chúng tôi tiến hành chạy pha động với chế độ gradient

Bảng 3.6 Chương trình chạy gradient rửa giải các chất carbamat

Tóm lại, các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký như sau:

nước, kênh B là dung môi MeOH.