Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa,... Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất.
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector. Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ.
2.2.2.5.1. Nguồn ion
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử. Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB). Dưới đây là hai phương pháp ion hóa được sử dụng trên thiết bị Finnigan LCQDUO:
a) Ion hóa phun điện tử – ESI
Kĩ thuật này chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí. Dung dịch mẫu được dẫn vào vùng có trường điện từ mạnh được duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ. Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi. Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm.
Hình 2.2.Kĩ thuật ESI bắn phá với chế độ ion dương
Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol,... và các chất phân cực có khối lượng phân tử nhỏ.
b) Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển – APCI
Đây cũng là một kĩ thuật ion hóa mềm. APCI được sử dụng để phân tích các chất có khối lượng phân tử trung bình. Kĩ thuật này có thể bắn phá ở 2 chế độ: ion âm và ion dương.
Hình 2.3.Kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương
Chất phân tích và dung môi ở dạng lỏng được chuyển thành các giọt nhỏ rồi hóa hơi ở nhiệt độ cao khoảng 500°C. Một điện thế cao từ 3 – 5kV tạo ra các electrron và ion hóa chất phân tích. Đối với kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương, sự ion hóa mẫu được thực hiện qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn thứ nhất: − + −+N →N + e e . 2 2 2 Giai đoạn thứ hai:
. 2 2 2 . 2+ +H O→N +H O+ N . 3 2 . 2O H O H O HO H + + → ++
Giai đoạn thứ ba:
O H H M M O H3 + + →( + )+ + 2
APCI là một kĩ thuật ion hóa mạnh, nó không bị ảnh hưởng khi thay đổi đệm chạy và nồng độ đệm. Nó được sử dụng để ion hóa các chất có khối lượng phân tử nhỏ (có khối lượng phân tử < 2000u).
a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)
Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua. Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc khối. Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này.
b) Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)
Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dưới. Trái với lại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đường cong ổn định được bẫy lại cho đến khi một điện áp RF được đặt trên điện cực vòng. Các ion khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và sẽ có hướng đi về phía detector. Do điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu được một phổ khối lượng đầy đủ.
Các ion tồn tại trong bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu được các mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần). Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thường chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần.
c) Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)
Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng lượng. Do các ion có cùng năng lượng nhưng lại khác nhau về khối lượng nên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có vận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này được gọi là thiết bị phân tích thời gian bay do tỉ số m/z được xác định bởi thời gian bay của các ion. Thời gian bay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lượng,
gian bay thấp nhưng nó có ưu điểm là khối lượng ion có thể phân tích không bị hạn chế.
2.2.2.5.3. Bộ phận phát hiện
Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.
Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron.
Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phôtpho và giải phóng ra các photon. Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron. Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn.