Nghiên cứu tạo chế phẩm có khả năng kích thích tăng sinh tổng hợp melamin của tế bào melanocyte nhằm định hướng phát triển thuốc điều trị chứng bạc tóc sớm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI BÁO CÁO TỔNG KẾT KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm có khả kích thích tăng sinh tổng hợp melanin tế bào melanocyte nhằm định hƣớng phát triển thuốc điều trị chứng bạc tóc sớm Mã số đề tài: KLEPT.14.02 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Đình Thắng Hà Nội, 2017 PHẦN I THÔNG TIN CHUNG 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm có khả kích thích tăng sinh tổng hợp melanin tế bào melanocyte nhằm định hướng phát triển thuốc điều trị chứng bạc tóc sớm 1.2 Mã số: KLEPT.14.02 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Chức danh, học vị, họ tên Đơn vị công tác Vai trò thực đề tài TS Nguyễn Đình Thắng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Chủ nhiệm PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành viên PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành viên TS Phạm Thu Hường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành viên TS Phạm Lương Hằng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành viên ThS Lê Thị Liên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành viên CN Lê Minh Hiền Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành viên CN Phạm Ngọc Diệp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành viên CN Phạm Thị Hương Liên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành viên 10 CN Đặng Thị Hoài Thanh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành viên 1.4 Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2016 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 12 năm 2016 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2014 đến tháng 10 năm 2016 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): khơng (Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến Cơ quan quản lý) 1.7 Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt đề tài: 500 triệu đồng PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………………1 MỤC TIÊU…………………………………………………………………………………….2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………………………….2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Phƣơng pháp tách quần thể tế bào melanocyte từ gốc tóc Phƣơng pháp khảo sát tăng sinh tế bào .2 Thu mẫu mơ chân tóc làm tiêu mô .2 Phƣơng pháp tách chiết dƣợc chất có loại dƣợc liệu .2 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng melanin Phƣơng pháp tạo chế phẩm liposome mang dƣợc chất Phƣơng pháp thử nghiệm mơ hình phơi cá ngựa vằn Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Phân lập tế bào melanocyte từ hành tóc 4.2 Phân tích, đánh giá khác cấu trúc phân bố tế bào melanocyte hành tóc bạc hành tóc đen 4.3 Chiết xuất thu cao dịch chiết dƣợc chất có dƣợc liệu hà thủ ô đỏ .4 4.4 Khảo sát tác dụng dịch chiết xuất hà thủ ô đỏ lên khả tăng sinh nhƣ khả tổng hợp melanin tế bào melanoma SKMEL-28 4.5 Khảo sát tác dụng dịch chiết xuất hà thủ đỏ lên đƣờng điều hịa tổng hợp melanin tế bào melanocyte .5 4.6 Chế tạo hạt nanoliposome mang dƣợc chất chiết xuất từ hà thủ ô đỏ .5 4.7 Đánh giá độc tính nanoliposome mang đƣợc chất chiết xuất tế bào 4.8 Tác dụng độc tính nanoliposome lên phôi cá ngựa vằn sinh tổng hợp melanin melanocyte phôi cá ngựa vằn .8 4.9 Khảo sát tác dụng nanoliposome mang dƣợc chất chiết xuất hà thủ ô lên biểu gene liên quan đến điều hòa tổng hợp melanin .9 Đánh giá kết đạt đƣợc kết luận……………………………………………… 11 Tài liệu tham khảo………………………………………………………………………… 12 Tóm tắt kết quả………………………………………………………………………… 14 DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết đầy đủ Chữ viết tắt CV Tinh thể tím (Crystal Violet) ĐC Đối chứng DNA Deoxyribonucleic acid DMSO PBS Môi trường tạo bào tử Difco (Difco Sporulation Medium) PM Polygomun multiflorum (Hà thủ ô đỏ) EtAc Ethyl Acetate EtBr Ethidium bromide FBS Fetal Bovine Serum HTO Hà thủ ô đỏ MeOH Methanol PBS Phosphate Buffer Solution PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) RNA Ribonucleic acid RPMI Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI UV – Vis Quang phổ tử ngoại-khả kiến (Ultraviolet–visible spectrometer) WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Ognization) Đặt vấn đề Tóc tổ chức biệt hóa, phần phụ thượng bì nhiễm chất sừng sắc tố da (Melanin) Melanin sản sinh tế bào hắc tố melanocytes Tế bào melanocytes sinh từ biệt hóa tế bào hành tóc Trên màng tế bào melanocytes có thụ thể melanocortin-1 receptor (MC1R), G-protein Sự gắn α-Melanocyte-stimulating hormone (α-MSH) vào thụ thể MC1R kích thích sản sinh melanin melanocytes [1-4] Màu đen tóc biểu sức khỏe tốt, tinh thần thoải mái, nội tiết cân bằng, thể cung cấp đầy đủ yếu tố vi lượng đồng, kẽm…Bình thường 40 tuổi tóc bắt đầu bạc, sắc tố Tuy nhiên có nhiều người sức khỏe tốt, độ tuổi xuân mà đầu xuất nhiều tóc bạc Những trường hợp y học gọi chứng bạc tóc sớm [5-12] Mặc dù chứng bạc tóc sớm bệnh lành tính, khơng gây rối loạn cảm giác, khơng đau đớn, khơng gây biến chứng, nhiên ảnh hưởng nhiều đến thẩm mỹ, chị em phụ nữ tuổi trẻ [8-10] Hiện chưa có thuốc phương pháp điều trị hữu hiệu cho chứng bạc tóc sớm Q trình lão hóa tóc gắn liền với q trình lão hóa hành tóc Sự lão hóa hành tóc gây giảm chức khả tăng sinh tế bào melanocyte Q trình lão hóa tóc, gây chứng tóc bạc sớm có nguyên nhân nội tác động từ bên Nguyên nhân nội liên quan đến di truyền di truyền ngoại sinh thay đổi tùy theo cá thể Ngun nhân bên ngồi tia tử ngoại từ mặt trời, nhiễm khơng khí, hút thuốc lá, dinh dưỡng lối sống [5-12] Các nghiên cứu trước cho thấy sản xuất melanin giảm liên quan trực tiếp gây giảm chức mật độ tế bào melanocytes hành tóc Điều dẫn tới giảm khả tiếp xúc melanocytes keratinocytes giảm khả chuyển melanin từ melanosome melanocytes sang keratinocytes Bên cạnh đó, nghiên cứu khác cho thấy giảm tổng hợp melanin giảm hoạt tính enzyme tyrosinase, enzyme có vai trị xúc tác cho cho phản ứng oxy hóa dihydroxyphenylalanine (DOPA) thành melanin Q trình với q trình hydroxyl hóa tyrosine hành tóc ln sinh lượng lớn ROS Nếu ROS không loại bỏ cách hiệu hệ thống chống oxy hóa có tích lũy ROS, tạo stress oxi hóa làm tăng nhanh lão hóa tóc Trong nghiên cứu trước cho thấy nhiều yếu tố phát triển đóng vai trị quan trọng q trình phát triển tóc, chẳng hạn melanocyte stimulating hormon anpha (α-MSH), Insuline-like Growth Factor (IGF-1), Stem Cell Growth Factor (SCF) Các yếu tố phát triển cho có tác động trực tiếp gián tiếp tới thụ thể melacortin receptor (MC1R) hay/và thụ thể Endothelial Receptor B màng tế bào dẫn tới đáp ứng yếu tố phiên mã MITF tế bào melanocyte melanoma giúp cho loại tế bào sinh tổng hợp melanin [1, 4, 9, 10] Cho tới nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu chế thuốc điều trị chứng bạc tóc sớm người Tuy nhiên, đơng y dân gian có nhiều thuốc sử dụng riêng rẽ phối hợp dược chất chiết xuất từ nhiều loài thực vật khác nhau, chẳng hạn hà thủ ô đỏ, nhân sâm, linh chi, hồng hoa, hạn liên thảo, ngũ bội tử, kỳ tử, tô mộc để điều trị chứng bệnh tóc rụng tóc, tóc bạc sớm Trong số hà thủ ô đỏ biết đến nhiều thực tế cho thấy có hiệu tích cực lên q trình chống lão hóa tóc Mặc dù với thực tế vậy, nhiên khơng có minh chứng khoa học rõ ràng cho thấy hiệu qủa tác dụng thuốc thiếu nghiên cứu có tính chất chuyên sâu Do đó, nội dung đề tài nghiên cứu độc tính hiệu tác dụng dịch chiết xuất tự nhiên, mà đặc biệt chất chiết xuất từ hà thủ ô đỏ, lên -1- khả tăng sinh tổng hợp melanin tế bào melanocyte in-vitro in-vivo Mục tiêu đề tài Mục tiêu chung: Tạo phức hợp nano liposome thuốc có khả tác dụng hướng đích đến tế bào melanocyte, giúp tăng khả sinh tổng hợp melanin tế bào melanocyte Mục tiêu cụ thể: - Phân lập quần thể tế bào melanocyte từ tóc người - Đánh giá so sánh phân bố melanocyte hành tóc tóc bạc tóc đen - Tách chiết dược chất có hà thủ ô đỏ - Đánh giá tác dụng dịch chiết hà thủ ô đỏ lên khả tăng sinh khả tổng hợp melanin tế bào melanocyte - Tạo đánh giá tác dụng phức hợp nano liposome mang dược chât chiết xuất từ hà thủ ô đỏ tế bào melanocyte Phƣơng pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp tách quần thể tế bào melanocyte từ gốc tóc: Quần thể tế bào gốc tóc người có chứng bạc tóc sớm được phân lập cách xử lí với enzyme collagenase Sau quần thể tế bào ni cấy hỗn hợp mơi trường EMEM có bổ sung 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate cholera toxin mơi trường ni cấy khơng có serum trợ giúp keratinocyte Sau loại bỏ tế bào keratinocyte fibroblast, tế bào melanocyte có hình thái đặc trưng giữ lại Xác định tế bào melanocyte cách quan sát hình thái kính hiển vi đồng thời nhuộm kháng khể kháng S-100 [13, 14] 3.2 Phương pháp nuôi cấy khảo sát tăng sinh tế bào: Thử nghiệm tím tinh thể thực nhằm sơ đánh giá khả sống sót tế bào Phương pháp mô tả báo trước Nuôi 3x104 tế bào đĩa giếng 72 Tế bào sống rửa đệm PBS cố định dung dịch formalin 10% trước nhuộm màu tím tinh thể đo OD [14-16] 3.3 Thu mẫu mơ chân tóc làm tiêu mô: Chuột tẩy lông tiến hành lấy mô da Mô da rửa nhiều lần với ethanol để loại bỏ máu lơng bám dính mơ Ngâm mẫu trong dung dịch PFA 4% tuần Cố định mẫu khuôn parafin [17] Tiêu mô da đầu người cố định paraffin cung cấp GS Watanabe, khoa Da liễu, Đại học Y Aichi, Nhật Bản 3.4 Phương pháp tách chiết dược chất có loại dược liệu: Các mẫu thực vật rửa sạch, để nước, sấy khô 40C Sau mẫu tán thành bột mịn máy nghiền bảo quản bột lọ thủy tinh có hút ẩm 37ºC Sau mẫu thực vật ly trích loại dung mơi hữu khác để thu loại cao dịch chiết [18] 3.5 Phương pháp xác định hàm lượng melanin: Nồng độ melanin tế bào xác định theo quy trình sau: tế bào ni cấy rửa với PBS sau giải bám dính trypsin cho tái phân tán vào môi trường nuôi cấy Tiếp theo đem ly tâm tốc độ 2000 rpm phút, sau hịa tan dung dịch NaOH 1M ủ 80oC 30 phút Tiếp theo dung dịch -2- đem di ly tâm tốc độ 2000 rpm phút Lấy dịch ly tâm đem đo quang phổ bước sóng 415 nm [15] 3.6 Phương pháp tạo chế phẩm liposome mang dược chất: Liposome Kit: hỗn hợp lipid dùng để tạo liposome (Catalog Number L4395) Để tạo liposome, thêm ml dung dịch nước cất chứa dược chất tách chiết cần bao bọc vào ống nhiệt độ mong muốn (>4 °C) trộn cách sử dụng máy vortex 30 giây Dung dịch màu đồng hình thành [19, 20] 3.7 Phương pháp thử nghiệm mơ hình phơi cá ngựa vằn : Cá ngựa vằn trưởng thành nuôi điều kiện chu kì sáng tối 14:10 280C Ghép cá: Trước cho cá đẻ ngày, cá đực cá đặt chung vào bể có sẵn lưới ngăn cách để giúp ta kiểm sốt thời gian sinh sản cá Buổi sáng ngày hôm sau, lưới rút tạo điều kiện cho cá đẻ trứng trứng thụ tinh Chọn phôi: Sau 1-2 sau thụ tinh, phôi chọn kính hiển vi quang học, loại bỏ phơi hỏng, phơi khơng thụ tinh phơi có giai đoạn phát triển không [21-24] Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Phân lập tế bào melanocyte từ hành tóc Tế bào sắc tố chịu trách nhiệm việc tạo màu mắt da lồi động vật máu lạnh, chúng hình thành mào thần kinh trình phát triển phôi Các tế bào sắc tố trưởng thành nhóm lại thành phân lớp dựa màu chúng (chính xác sắc) ánh sáng trắng xanthophore (màu vàng), erythrophore (màu đỏ), iridophore (phản xạ / óng ánh), leucophore (trắng), melanophore (đen / nâu), cyanophore (màu xanh) Trong suốt trình phát triển phơi thai động vật có xương sống, tế bào sắc tố số nhiều loại tế bào tạo mào thần kinh, hai dải tế bào gắn liền xuất rìa ống thần kinh Những tế bào có khả di chuyển quãng đường dài, cho phép tế bào sắc tố đến nhiều quan thể, bao gồm da, mắt, tai não Rời khỏi mào thần kinh theo đợt, tế bào sắc tố theo hướng bên lưng thơng qua lớp hạ bì, vào lớp ngoại bì thơng qua lỗ nhỏ màng đáy, theo hướng bụng đốt ống thần kinh Hiện giai đoạn tách phân lập quần thể tế bào từ chân tóc xác định xác có phải tế bào melanocyte hay khơng Vì hạn chế điều kiện ni cấy tế bào gốc nên cần thêm thời gian cho trình Tuy nhiên để phục vụ cho mục đích nghiên cứu mục đích công bố quốc tế sau này, định mua tế bào melanocyte từ ATCC, Mỹ (code: ATCC® PCS-200-013™) để đảm bảo độ tin cậy Vì melanocyte tế thường nên có sinh trưởng phát triển thời gian ngắn với số lần phân chia khơng q 30 chu kì sau mua melanocyte từ ATCC, phải tiến hành nhân nuôi lưu giữ lại nitro lỏng Kết nhân nuôi cho thấy tế bào phát triển sinh trưởng bình thường điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm Như vậy, bước đầu chúng tơi phân lập quần thể tế bào melanocyte từ chân tóc Bên cạnh đó, chúng tơi thành cơng việc hoạt hóa, ni cấy, thu nhận lưu giữ nito lỏng tế bào melanocyte thương mại mua từ ATCC 4.2 Phân tích, đánh giá khác cấu trúc phân bố tế bào melanocyte hành tóc bạc hành tóc đen -3- Các mơ chân tóc đen cắt nhiều lớp làm tiêu để quan sát cấu trúc chân tóc chi kì phát triển tóc Kết mơ học cho thấy giai đoạn phát triển khác bào gồm anagen sớm, anagen, catagen telogen gốc tóc Phân tích cấu trúc cho thấy mơ chân tóc teo dần theo q trình phát triền tóc từ anagen  catagen  telogen Kết cho thấy quan trọng xuất biếm tế bào mầm (tế bào đóng vai trị quan trọng cho phát triển gốc tóc) Phân tích kết cho thấy mơ chân tóc bạc teo so với chân tóc đen, đặc biệt tuyến nhờn (cung cấp hóa chất bảo vệ làm trơn bóng tóc) chân tóc bạc gần tiêu biến Các kết nghiên cứu trước cho thấy vùng tuyến nhờn vùng có khả chứa tế bào gốc tóc Điều chứng minh cho khả tái sinh lão hóa sớm tóc Vùng tế bào mầm (quan trọng cho tái sinh gốc tóc) mơ chân tóc bạc có khuynh hướng tản mát, không tụ lại mô chân tóc đen Thêm yếu tố quan trọng khác tế bào melanocyte phần tiếp xúc vớ tế bào keratinocyte chân tóc đen có biệt hóa hình thành tua, bước quan trọng để từ tế bào melanocyte chuyển melanosome chứa melanin vào cho tế bào keratinocyte, giúp làm đen sợi tóc Trong tế bào melanocyte chân tóc bạc khơng biệt hóa biệt hóa (khơng hình thành tua) Như vậy, chúng tơi thành công việc xác định so sánh khác biệt chân tóc đen giai đoạn khác chu kì phát triển tóc Chúng tơi cho thấy khác biệt cấu trúc phân bố tế bào mầm khả biệt hóa tế bào melanocyte chân tóc đen chân tóc bạc Từ kết giúp tăng hiểu biết lão hóa chân tóc để từ có định hướng phù hợp cho việc pháp triển thuốc ứng dụng điều trị chứng bạc tóc sớm (hình ảnh kết trình bày cụ thể báo đăng tạp chí KH-CN Việt Nam phân phụ lục kèm theo) 4.3 Chiết xuất thu cao dịch chiết dƣợc chất có dƣợc liệu hà thủ ô đỏ Chúng tiến hành thu thập mẫu sử dụng phương pháp ly trích mẫu hà thủ đỏ dung môi n-Hexan (n-Hex), Ethyl acetat (EtAc) methanol (MeOH) Từ kết tách chiết thu cho thấy dung môi chiết khác hàm lượng chất thu khác nhau, đa phần chất chiết dung môi methanol Hàm lượng hợp chất chiết methanol cao gấp 10 lần so với dung mơi cịn lại Có thể giải thích điều methanol hợp chất hòa tan nhóm hợp chất phân cực (chứa nhóm OH, ether, ester) tốt, mà nhóm lớn có thực vật phenol, nhóm gồm nhiều hợp chất có vịng thơm hay nhiều nhóm OH hay nhóm chức ether, ester glycoside (có nhóm hydroxyl gắn trực tiếp vào vịng thơm) Vì vậy, hàm lượng hợp chất thu dung môi MeOH mẫu thực vật cao Số liệu cao dịch chiết trình bày báo đăng tạp chí JAPTR phần phụ lục 4.4 Khảo sát tác dụng dịch chiết xuất hà thủ ô đỏ lên khả tăng sinh nhƣ khả tổng hợp melanin tế bào melanoma SKMEL-28 Dịch chiết hà thủ ô đỏ methanol sử dụng để khảo át độc tính tế bào SKMEL-28 Nòng độ dịch chiết thử nghiệm từ 0, 312, 625, 1250, 2500, 5000 µg/mL Kết qủa thí nghiệm cho thấy dịch chiết hà thủ có độc tính thấp tế bào, nồng độ cao 2500 5000 µM dịch chiết bắt đầu cho thấy có khả gây chết tế bào Kết hợp lí thực tế dân gian sử dụng nước hà thủ ô để uống ngày Dựa kết khảo sát ảnh hưởng độc tính dịch chiết nồng độ khác lên tế bào, sử dụng dịch chiết nồng độ không gây độc tế bào (312, 625, 1250 µg/mL) để -4- đánh giá ảnh hưởng dịch chiết lên khả tăng sinh tổng hợp melanin tế bào Kết thu cho thấy dịch chiết có khả kích thích tăng sinh tổng hợp melanin Nồng độ cao lượng melanin sinh cành nhiều Dịch chiết hà thủ đỏ methanol có có độc tính thấp tế bào sinh sắc tố SKMEL-28, nồng độ 1250 mg/mL, dịch chiết bắt đầu gây độc nhẹ Ở nồng độ không gây độc tế bào, dịch chiết hà thủ đỏ có khả kích thích tăng sinh tổng hợp melanin tế SKMEL-28 Với kết ban đầu phần chứng minh tác dụng hà thủ ô lên khả làm xanh tóc thơng qua việc kích thích tăng sinh hắc sắc tố melanin Các kết cụ thể trình bày chi tiết báo quốc tế đăng tạp chí JAPTR phần phụ lục 4.5 Khảo sát tác dụng dịch chiết xuất hà thủ ô đỏ lên đƣờng điều hòa tổng hợp melanin tế bào melanocyte Sau ni xử lí tế bào với dịch chiết hà thủ ô đỏ Tế bào thu tiến hành tách, tinh RNA theo protocol kit Tiến hành tổng hợp cDNA Nồng độ cDNA đem xác định thiết bị đo nano-drop Tiếp đến tiến hành khảo sát mức độ biểu gene MC1R, MITF Tyrosinase với cặp mồi đặc hiệu, đồng thời kiểm tra mức độ biểu gene GAPDH làm nội đối chứng kỹ thuật PCR điện di Kết thu cho thấy mức độ biểu gene giữ nhà GAPDH khơng thay đổi đó, dịch chiết hà thủ (HTO) có khả làm tăng cường biểu gene MC1R, MITF Tyrosinase Kết thí nghiệm thu cho thấy dịch chiết hà thủ đỏ methanol có khả làm tăng sinh tổng hợp melanin thông qua đường MC1R/MITF/Tyrosinase trình bày chi tiết báo đăng tạp chí JAPTR tạp chí Biomedical Research and Therapy phần phụ lục 4.6 Chế tạo hạt nanoliposome mang dƣợc chất chiết xuất từ hà thủ ô đỏ Tiến hành tạo dung dịch liposome chứa dược chất chiết xuất từ hà thủ ô đỏ nồng độ khác 2.5mg/mL 5.0 mg/mL Các kết phân tích phân bố kích thước hạt đặc tính khác hạt nanoliposome chứa dược chất trình bày hình Chúng tơi thành công việc chế tạo hạt nanoliposome mang dược chất chiết xuất từ hà thủ ô đỏ với phân bố kích thước hạt đặc tính phù hợp, sử dụng cho thí nghiệm nghiên cứu -5- Hình Các đặc tính nanoliposome mang dƣợc chất chiết xuất nồng độ 2.5 mg/mL -6- Hình Các đặc tính nanoliposome mang dƣợc chất chiết xuất nồng độ mg/mL -7- 4.7 Đánh giá độc tính nanoliposome mang đƣợc chất chiết xuất dòng tế bào Các dòng tế bào HaCaT, SKMEL-28, MCF7 and Melanocyte sử dụng thí nghiệm Sau 48 ni cấy, hình ảnh tế bào giếng đối chứng không ủ với thuốc/chế phẩm cho thấy ba dòng cho thấy tế bào bám dính chắc, mật độ vừa phải, chiếm khoảng 60 -70% diện tích giếng ni cấy khơng phát thấy khác biệt hai giếng đối chứng sinh học đối chứng dung mơi Điều cho thấy nồng độ 0,5% DMSO môi trường nuôi cấy không gây ảnh hưởng đáng kể đến hình thái tế bào Qua hình ảnh tế bào giếng đối chứng, kết thu đảm bảo đạt chuẩn sở để so sánh với hình thái tế bào giếng thí nghiệm Các kết định lượng thu thông qua xác định mật độ quang OD Với kết thu định tính so sánh hình thái kết định lượng, cho thấy chế phẩm nanoliposome có độc tính thấp dịng tế bào nghiên cứu, trừ nồng độ cao 250µg/ml 125µg/mL Đáng ý nồng độ 250µg/mL cho OD thấp, giá trị A% 22.33% dòng Hacat, 33.07% với dòng SKMEL-28 39.68% với dịng MCF7 Chúng tơi tiến hành đánh giá đánh giá độc tính nanoliposome mang chất chiết xuất hà thủ ô đỏ tế bào melanocyte với dải nồng độ khảo sát từ 0, 25, 50, 100, 150 250 μg/mL Kết thí nghiệm cho thấy nanoliposome nồng độ 100 μg/mL không gây độc tế bào Tuy nhiên nồng độ 150 250 μg/mL, nanoliposome gây chết tế bào mức độ 24.4 31.7% Như vậy, đánh giá độc tính nanoliposome mang dược chất lên khả sống chết dòng tế bào HaCaT, SKMEL-28, MCF7 melanocyte xác định ngưỡng nồng độ nanoliposome mang dược chất để sử dụng cho nghiên cứu nhằm đánh giá khả kích thích tăng sinh melanin tế bào melanocyte tế bào melanoma 4.8 Tác dụng độc tính nanoliposome lên phơi cá ngựa vằn sinh tổng hợp melanin melanocyte phôi cá ngựa vằn Trong nhiều thập niên trở lại đây, cá ngựa vằn loài cá cảnh phổ biến mơ hình nghiên cứu quan trọng nhiều lĩnh vực sinh học (sinh học phát triển, thử độc tính….) Cá ngựa vằn sử dụng rộng rãi nghiên cứu bởi: cá ngựa vằn có kích thước nhỏ, sống thành đàn, dễ chăm sóc, dễ dàng ni điều kiện phịng thí nghiệm với chi phí thấp Cá để trứng với số lượng lớn (khoảng 50-200 trứng/ tuần/ cặp cá bố mẹ), trình sinh sản điều kiển chu kì sáng tối nên chủ động nguồn phơi cá trình nghiên cứu Mặt khác, trứng cá ngựa vằn có đường kính khoảng 0,7 mm, quan sát kính hiển vi có độ phóng đại < 10 lần Chúng thụ tinh nên việc thu phơi tiến hành dễ dàng mà khơng ảnh hưởng tới cá bố mẹ Đồng thời, phôi cá ngựa vằn có lớp vỏ suốt, với q trình phát triển phôi nhanh: khoảng ngày, ấu trùng nở vào ngày thứ 3, đến ngày thứ hầu hết loại tế bào biệt hóa cá có đủ chức chúng, vơ thuận lợi cho thao tác thí nghiệm quan sát phát triển phôi dị dạng kính hiển vi Để đánh giá cách xác ảnh hưởng nanoliposome mang dịch chiết hà thủ ô đỏ lên phát triển phôi cá ngựa vằn, sử dụng dịch chiết dạng khơng nano hóa, chúng tơi tiến hành thí nghiệm sơ thu hẹp dải nồng độ cuối thử độc tính với dải nồng độ tứ 10, 20, 30, 40, 50, 80 100 (μg/mL) Khi phơi nhiễm phôi cá ngựa vằn dịch chiết hà thủ ô, kết nghiên cứu cho thấy: Mức độ dị dạng phụ thuộc chặt chẽ vào nồng độ thời gian phơi nhiễm Tại nồng độ thấp (40 μg/mL), đến ngày thứ ba sau phơi nhiễm bắt đầu xuất dị dạng; nồng độ 50 μg/mL 80 μg/mL ngày thứ hai bắt đầu xuất dị dạng Song nồng độ cao (100 μg/mL) từ ngày đầu tiên, phôi cá ngựa vằn có -8- dấu hiệu chậm phát triển Từ ngày thứ hai, phôi bắt đầu xuất thêm dị dạng phù nỗn hồng Từ ngày thứ ba trở dị dạng khác xuất Mức độ dị dạng tăng dần theo thời gian phơi nhiễm cịn biểu rõ hình Tại nồng độ 50μg/mL, 80μg/mL,100μg/mL, ngày thứ tư, mức độ dị dạng tăng lên rõ rệt, phôi cá ngựa vằn mang tổ hợp nhiều kiểu dị dạng: chậm phát triển, phù nỗn hồng, tổn thương liên quan đến mạch máu, phù màng bao tim, hoại tử, cong đuôi dị dạng phần đầu Kết thí nghiệm cho thấy 30μg/mL nồng độ an tồn, phơi cá ngựa vằn sinh trưởng hoàn toàn binh thường Từ nồng độ 40μg/mL bắt đầu xuất dị dạng, song từ nồng độ 50μg/mL trở phôi cá ngựa vằn bị chết Giá trị LC50, EC50, EC10 ấu thể cá ngựa vằn bốn ngày tuổi phơi nhiễm dịch chiết hà thủ ô tính tốn kết là: 78,2 μg/mL; 53,8 μg/mL; 42,3 μg/mL Như vậy, dịch chiết hà thủ ô đỏ coi tác nhân gây quái thai phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi (TI = 1,454) Kết thử độc tính nanoliposome mang cao dịch chiết hà thủ ô đỏ lên phôi cá ngựa vằn thu dải nồng độ thử độc tính từ 0, 87.5, 105, 122.5, 140, 157.5 175 (μg/mL) Sau phơi nhiễm phôi cá ngựa với nanoliposome mang dược chất chiết xuất hà thủ ô, quan sát số kiểu dị dạng như: phù nỗn hồng, phù màng bao tim, cong đuôi chậm phát triển Tiếp theo, chúng tơi phân tích số liệu thống kê số lượng cá thể sống sót dị dạng phơi (ấu thể) cá ngựa vằn ngày tuổi Ở ngày ngày thứ hai, tất nồng độ (trừ nồng độ 175 μg/mL), hầu hết phôi không bị chết, đồng thời số lượng mức độ dị dạng thấp (chỉ xuất kiểu dị dạng chậm phát triển phù màng bao tim Song từ ngày thứ ba, phôi nở, lượng lớn phôi cá ngựa vằn bị chết với tỷ lệ tăng dần theo nồng độ Điều giải thích nanoliposome mang dược chất chiết xuất hà thủ chứa phân tử có kích thước lớn, khó xâm nhập qua màng phơi hai ngày đầu, phôi chưa nở, dịch chiết hà thủ ô không ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng phát triển phôi Chúng nhận thấy, nồng độ 105 μg/mL 122,5 μg/mL đến 96h phôi xuất dị dạng mức độ dị dạng tương đối nhẹ Song nồng độ cao hơn, sau 24h quan sát dị dạng Tại nồng độ 87,5 μg/mL, phôi cá ngựa vằn sinh trưởng phát triển hồn tồn bình thường Từ nồng độ 105 μg/mL, phôi cá ngựa vằn xuất dị dạng, từ nồng độ 122,5 μg/mL phôi cá ngựa vằn bị chết Giá trị LC50 EC50 phôi cá ngựa vằn ngày tuổi phơi nhiễm nanoliposome mang dược chất chiết xuất hà thủ tính tốn kết 155,1 μg/mL 203,7 μg/mL với giá trị TI = 0,761 Dựa kết khảo sát độc tính, sử dụng nanoliposome mang dược chất chiết xuất hà thủ ô nồng độ không gây độc phôi cá ngựa vằn 87.5 μg/mL cho việc khảo sát khả kích thích tăng sinh tổng hợp melanin tế bào melanocyte phôi cá ngựa vằn phức hệ nanoliposome-thuốc Kết cho thấy, nồng độ khảo sát, phức hệ nanoliposome-thuốc có khả làm tăng sinh melanin lên gấp 2.4 lần so với đối chứng Như vậy, (1) đánh giá độc tính dịch chiết HTO dạng tự dạng nanoliposome phơi cá ngựa vằn, từ chọn nồng độ thuốc thử nghiệm phù hợp chi việc đánh giá khả ảnh hưởng thuốc lên tăng sinh melanin; (2) cho thấy phức hệ nanoliposome-thuốc có khả làm tăng sinh melanin phơi cá ngựa vằn sau ngày phơi nhiễm 4.9 Khảo sát tác dụng nanoliposome mang dƣợc chất chiết xuất hà thủ ô lên biểu gene liên quan đến điều hịa tổng hợp melanin Phơi cá ngựa vằn phơi nhiễm với nanoliposome-thuốc nồng độ khác 10, 50 -9- 80 μg/mL Sau ngày phơi nhiễm, thu mẫu phôi cá tách ARN tổng số Sau thực tạo cADN, Chúng thực phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mong muốn với cặp mồi đặc hiệu Chúng kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 1,5% để kiểm tra mức độ biểu gen ef1α, mitf tyrosinase Kết hình ảnh băng ef1α mitf điện di gel agarose trình bày hình 3-A Các băng phân tích định lượng phần mềm ImageJ trình bày hình 3B-C 5M1 1.5 2.5 2.0 1.0 1.5 1.0 0.5 0.5 0.0 (A) 0.0 M3 M4 M5 M2 M3' M4' M5' M2' (B) (C) Hình 3: Kết điện di gel agarose gen ef1α mitf (A); Kết phân tích hình ảnh điện di gbằng phần mềm Image với gen đối chứng ef1α (B) gen mitf (C) Chú thích: M – Marker; – Mẫu đối chứng âm; – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa nanoliposome-thuốc 10 μg/mL – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa nanoliposome-thuốc 50 μg/mL – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa nanoliposome-thuốc 80 μg/mL Từ ảnh điện di thu được, ta thấy băng ef1α, mitf lên kích thước (ef1α: 202 bp; mitf: 176 bp), điều chứng tỏ khuếch đại thành công đoạn gen quan tâm Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng ef1α làm gen nội đối chứng để so sánh mức độ biểu gen mitf mẫu cá ngựa vằn phơi nhiễm với nanoliposome-thuốc Gen nội đối chứng gen có biểu tế bào, mô quan thời điểm Do đó, dựa vào mức độ biểu ef1α để đánh giá biểu gen mitf Nhìn vào hình ảnh điện di, ta thấy độ sáng băng ef1α mẫu tương đối Trong đó, với lượng mẫu tương đương, băng mitf giếng có độ sáng khác Kết phù hợp giếng mẫu cá ngựa vằn phơi nhiễm môi trường không bổ sung hà thủ ơ, cịn giếng 3, 4, mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa dịch chiết hà thủ ô với nồng độ tăng dần Đồng thời, định lượng phần mềm phân tích ảnh điện di ImageJ, ta thấy hàm lượng ef1α giếng tương đương Trong đó, hàm lượng mitf giếng cao rõ rệt so với giếng 2, cụ thể hàm lượng mitf giếng số gấp 1,43 lần so với giếng số 2; giếng số gấp 2,06 lần giếng số Điều chứng tỏ mitf tăng cường biểu Từ đó, chúng tơi đưa kết luận rằng: nanoliposome mang dược chất chiết xuất hà thủ ô có khả làm tăng biểu mitf mức độ phiên mã Tương tự đánh giá tác dụng nanoliposome mang dược chất chiết xuất hà thủ ô lên biểu gene tyrosinase Kết hình ảnh băng điện di biểu hình 4-A Các băng phân tích định lượng phần mềm ImageJ (hình 4B-C - 10 - Tyrosinase ef1α (A) (B) (C) Hình 4: Kết điện di gel agarose gen ef1α tyrosinase (A); Kết phân tích hình ảnh phần mềm Image với gen đối chứng ef1α (B) gen tyrosinase (C) Chú thích: M – Marker; – Mẫu đối chứng âm; – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa nanoliposome-thuốc 10 μg/mL – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa nanoliposome-thuốc 50 μg/mL – Mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa nanoliposome-thuốc 80 μg/mL Từ ảnh điện di thu được, ta thấy băng ef1α, tyrosinase lên kích thước (ef1α: 202 bp; tyrosinase: 192 bp), điều chứng tỏ khuếch đại thành cơng đoạn gen quan tâm Trong thí nghiệm này, sử dụng ef1α làm gen nội đối chứng để so sánh mức độ biểu gen tyrosinase mẫu cá ngựa vằn phơi nhiễm với nanoliposome-thuốc Nhìn vào hình ảnh điện di, ta thấy độ sáng băng ef1α mẫu tương đối Trong đó, với lượng mẫu tương đương, băng tyrosinase giếng có độ sáng khác Kết phù hợp giếng mẫu cá ngựa vằn phơi nhiễm môi trường không bổ sung hà thủ ơ, cịn giếng 3, 4, mẫu cá phơi nhiễm môi trường chứa dịch chiết hà thủ ô với nồng độ tăng dần Đồng thời, định lượng phần mềm phân tích ảnh điện di ImageJ, ta thấy hàm lượng ef1α giếng tương đương Trong đó, hàm lượng tyrosinase giếng số cao rõ rệt so với giếng 2, cụ thể hàm lượng tyrosinase giếng số gấp 1,83 lần so với giếng số 2; giếng số gấp 1,76 lần giếng số Điều chứng tỏ tyrosinase tăng cường biểu Từ đó, chúng tơi đưa kết luận rằng: nanoliposome mang dược chất chiết xuất hà thủ có khả làm tăng biểu tyrosinase mức độ phiên mã Đánh giá kết kết luận Kết thí nghiệm thu cho thấy dịch chiết hà thủ ô chứa dược chất có khả làm tăng sinh tổng hợp melanin khơng thí nghiệm in-vitro mơ hình tế bào mà - 11 - thí nghiệm in-vivo mơ hình phơi cá ngựa vằn thơng qua khả kích hoạt đường tín hiệu tế bào MC1R/MITF/Tyrosinase Chúng tiến hành tạo hạt nanolipolsome chứa chất chiết xuất từ hà thủ ô đỏ đánh giá khả độc tính tác dụng tế bào phơi cá ngựa vằn Kết nghiên cứu cho thấy rằng, hạt nanoliposome có khả tăng sinh tổng hợp melanin mơ hình tế bào phơi cá ngựa vằn thơng qua kích hoạt đường MITF/Tyrosinase Tuy nhiên có vấn đề độ bền hạt nanoliposome khơng cao, tồn ổn định điều kiện 4oC khoảng thời gian ngắn (3-5 ngày) Chúng cho cần phải nghiên cứu sâu rộng để tối ưu điều kiện nhằm làm tăng độ ổn định độ bền phức hợp nanaliposome Một vấn đề khác cần quan tâm nồng độ cao, dược chất chiết xuất từ hà thủ ô đỏ tác nhân gây phát triển loại dị dạng phôi cá ngựa vằn Điều cho thấy liều lượng sử dụng quan trọng Tài liệu tham khảo Rees JL The melanocortin receptor (MC1R): More than just red hair Pigment Cell Res 13:135-140, 2000 Tobin DJ, Paus R Graying: Gerontobiology of the hair follicle pigmentary unit Exp Gerontol 36:29-54, 2001 Tobin DJ, Bystryn JC Different populations of melanocytes are present in hair follicles and epidermis Pigment Cell Res 9:304-310, 1996 Horikawa T, Norris DA, Johnson TW, Zekman T, Dunscomb N, Bennion SD, et al DOPA-negative melanocytes in the outer root sheath of human hair follicles express premelanosomal antigens but not a melanosomal antigen or the melanosome-associated glycoproteins tyrosinase, TRP-1, and TRP-2 J Invest Dermatol 106:28-35, 1996 Shaffrali FC, McDonagh AJ, et al., Hair darkening in porphyria cutanea tarda Br J Dermatol.146:325-329, 2002 Stenn KS and Paus R Controls of hair follicle cycling Physiol Rev 81:449-494, 2001 Tobin DJ Aging of the hair follicle pigmentation system Int J Trichology 1:83-93, 2009 Sunderland E Hair-colour variation in the United Kingdom Ann Hum Genet 20:312-333, 1956 Nishimura EK, Granter SR, Fisher DE Mechanisms of hair graying: Incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche Science 307:720-724, 2005 10 Peters EM, Imfeld D, Gräub R Graying of the human hair follicle J Cosmet Sci 62:121-125, 2011 11 Arck PC, Overall R, Spatz K, et al Towards a “free radical theory of graying": Melanocyte apoptosis in the aging human hair follicle is an indicator of oxidative stress induced tissue damage FASEB J 20:1567-1569, 2006 12 Trüeb RM Oxidative stress in ageing of hair Int J Trichol 1:6-14, 2009 13 Dieckmann C, Milkova L, Hunziker T, Emmendörffer A, Simon JC Human melanocytes can be isolated, propagated and expanded from plucked anagen hair follicles Exp Dermatol 19(6):543-545, 2010 14 Na GY, Paek SH, Park BC, Kim DW, Lee WJ, Lee SJ, Kim MK, Kim JC Isolation and characterization of outer root sheath melanocytes of human hair follicles Br J Dermatol 155(5):902-909, 2006 15 Hu DN Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro Photochem Photobiol 84(3):645-649, 2008 - 12 - 16 Thang ND, Yajima I, Kato M Bidirectional functions of arsenic as a carcinogen and an anticancer agent in human squamous cell carcinoma PloS ONE DOI: 10.1371/journal.pone.0096945, 2014 17 Thang ND, Yajima I, Kato M, et al Deltex-3-like (DTX3L) stimulates metastasis of melanoma through FAK/PI3K/AKT but not MEK/ERK pathway Oncotarget 6(16):14290-14299, 2015 18 Lien LT, Tho NT, Thang ND., et al Influence of Piper betle Linn leaf extract on wound healing Burns & Trauma 20153:23 DOI: 10.1186/s41038-015-0023-7, 2015 19 Lichtenberg, D., and Barenholz, Y., Liposomes: Preparation, Characterization, and Preservation: Methods in Biochemical Analysis Wiley, New York, 33, 337-462, 1988 20 Torchilin VP (2005) Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers Nat Rev Drug Discov 4: 145-160 21 Kelsh, RN; Schmid, B; Eisen, JS (2000) "Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos" Dev Biol 225 (2): 277–93 22 Kimmel C B., W W Ballard, S R Kimmel, B Ullmann and T F Schilling “Stages of embryonic development of the zebrafish”, Developmental dynamics, 203(3), pp 253-310, 1995 23 Kwon B S., A K Haq, et al., Isolation and sequence of a cDNA clone for human tyrosinase that maps at the mouse c-albino locus Proceedings of the National Academy of Sciences, 84(21), pp 7473-7477, 1997 24 Milos N., Dingle, A D Dynamics of pigment pattern formation in the zebrafish, Brachydanio rerio I Establishment and regulation of the lateral line melanophore stripe during the first eight days of development Journal of Experimental Zoology, 205:205- 216, 1978 - 13 - Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) Tóm tắt tiếng Việt: Đặt vắn đề: Mặc dù Hà thủ ô đỏ, Polygonum multiflorum (PM), dân gian sử dụng làm thuốc điều trị loại bệnh liên quan đến sắc tố, đặc biệt tóc bạc sớm, từ lâu trước Tuy nhiên có nghiên cứu khoa học ảnh hưởng sinh học hà thủ đỏ mơ hình phịng thí nghiệm (in-vitro) mơ hình động vật (in-vivo) Phƣơng pháp: Trong nghiên cứu tiến hành tách chiết dược chất có rễ hà thủ đỏ loại dung môi hữu khác tiến hành đánh giá độc tính khả kích thích tăng sinh tổng hợp melanin dược chất dạng trực tiếp hay dạng bọc nanoliposome tế bào melanocyte, melanoma phôi cá ngựa vằn dịng chuẩn AB Tiếp chúng tơi tiến hành phân tích phân tử để tìm chế tác dụng chúng việc kính thích tổng hợp melanin Kết quả: Các kết thí nghiệm cho thấy dịch chiết xuất từ rễ hà thủ ô đỏ làm tăng khả sinh tổng hợp melanin tế bào melanocyte, melanoma phôi cá ngựa vằn (ở bốn ngày tuổi) cách rõ rệt Kết phân tích chế phân tử cho thấy dược chất dịch chiết tác động kích hoạt đường tín hiệu tế bào MC1R/MITF/Tyrosinase để từ làm tăng cường sinh tổng hợp melanin tế bào phôi cá ngựa vằn Chúng khảo sát cho thấy khác biệt hình thái học thay đổi biệu số gen MC1R/MITF/Tyrosinase hành tóc đen hành tóc bạc (liên quan đến tượng bạc tóc sớm) Tuy nhiên, bên cạnh kết nghiên nồng độ dịch chiết cao, chúng có khả tác nhân gây phát triển loại dị dạng phôi cá ngựa vằn Kết luận: Từ kết nghiên cứu thu đưa kết luận rằng, dịch chiết hà thủ ô nồng độ phù hợp có khả làm tăng cường sinh sắc tố melanin tế bào melanocyte phơi cá ngựa vằn, dược liệu quý dùng làm thuốc để điều trị bệnh luên quan đến sắc tố, đặc biệt chứng tóc bạc sớm Tuy nhiên cần phải có nghiên cứu sâu để đánh giá độc tính nhằm tìm nồng độ phù hợp sử dụng, đặc biệt sử dụng cho bà mẹ mang thai Tóm tắt tiếng Anh: Background: Despite Polygonum multiflorum (PM) has been experiencely used as a drug to treat early graying hair phenomenon in Asian countries for a long time, there is limited study examined the real biological effects of Polygonum multiflorum on hair graying in vitro and in vivo Methods: In this study, we extracted phytochamicals in PM root into various organic solvents and investigated the effects of PM root extracts as crude forms or in nanoliposome-coated forms on melanin synthesis in human melanocyte, melanoma cells and embryos/larvae of wild type strain AB zebrafish We also preliminary revealed the molecular mechanism of early hair graying phenomenon in both in vitro and in vivo models Results: Our results showed that PM root extract significantly induced melanin synthesis in melanin-producing melanocytes and SKMEL-28 melanoma cells and also in zebrafish embryos/larvae at four-day post fertilization (4-dpf) via activation of MC1R/MITF/Tyrosinase signalling pathway We also investigated the differences in genotype between graying hair follicle and black hair follicle and found that early hair graying phenomenon may be related to down-regulation of MC1R/MITF/Tyrosinase pathway In addition, in this research it was found that PM root extract at high concentrations also expressed its toxicity toward zebrafish embryos/larvae Conclusions: Taken together, we suggested that PM root extract at safe doses could be used as a potential agent for treatment of early hair graying and other loss pigmentation related diseases Howver it should be studied more extensively to verify, especially using doses, for treatment of pigment-loss-related diseases - 14 - PHẦN III SẢN PHẨM, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI 3.1 Kết nghiên cứu TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu kinh tế - kỹ thuật Đăng ký Đạt đƣợc Hội nghị quốc tế, nước Khơng đăng kí Bài báo đăng tạp chí nước Khơng đăng kí Bài báo đăng tạp chí quốc tế 02 + 01 Bài đăng tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Bộ KH-CN 03, bao gồm : + 01 Bài báo chấp nhận đăng tạp chí Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research (Pubmed, ISI/Scopus, Q2-Scimago) + 01 Bài đăng tạo chí Biomedical Research Therapy (Spinger, ISI) + 01 Bài đăng tạp chí Burns & Trauma (Pubmed, ISI) 3.2 Hình thức, cấp độ cơng bố kết TT 1.1 1.2 Sản phẩm Ghi địa Đánh giá cảm ơn tài trợ chung (Đạt, Tình trạng (Đã in/ chấp nhận in) ĐHQGHN khơng đạt) quy định Cơng trình cơng bố tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI/Scopus Nguyen Dinh Thang, Pham Ngoc Diep, Pham T Huong Lien, Le Thi Lien “Polygonum multiflorum root extract as a potential candidate for treatment of early graying hair” Dang Thi Hoai Thanh, Nguyen Lai Thanh, Nguyen Dinh Thang “Toxicological and melanin synthesis effects of Polygonum multiflorum root extracts on zebrafish embryos and human melanocytes” Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research (Pubmed, ISI, Q2-Scimago) Có ghi cảm ơn đề tài KLEPT.14.02 Đạt (Đã chấp nhận đăng) Biomedical Research and Therapy, 3(9), 808-818 (Đã in) Có ghi cảm ơn đề tài KLEPT.14.02 Le Thi Lien, Nguyen Thi Burns & Trauma Có ghi cảm ơn đề Tho, Do Minh Ha, Pham 20153:23 DOI: tài KLEPT.14.02 Luong Hang, Phan Tuan 10.1186/s41038-015Nghia, Nguyen Dinh Thang 0023-7, 2015 “Influence of Piper betle Linn leaf extract on wound (Đã in) healing” Sách chuyên khảo xuất ký hợp đồng xuất Đăng ký sở hữu trí tuệ Bài báo quốc tế không thuộc hệ thống ISI/Scopus 5.1 Bài báo tạp chí khoa học ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia báo cáo khoa học đăng kỷ yếu hội nghị quốc tế Morphological and molecular Vietnam Science and Có ghi cảm ơn đề Đạt differences between black Technology, Vol 6, tài KLEPT14.02 hair follicles and gray hair No (2016) follicles Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn sách theo đặt hàng đơn vị sử dụng Kết dự kiến ứng dụng quan hoạch định sách sở ứng dụng KH&CN 1.3 Ghi chú: Cột sản phẩm khoa học công nghệ: Liệt kê thông tin sản phẩm KHCN theo thứ tự Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo…) chấp nhận có ghi nhận địa cảm ơn tài trợ ĐHQGHN theo quy định Bản phô tơ tồn văn ấn phẩm phải đưa vào phụ lục minh chứng báo cáo Riêng sách chun khảo cần có phơ tơ bìa, trang đầu trang cuối có ghi thơng tin mã số xuất 3.3 Kết đào tạo TT Họ tên Nghiên cứu sinh Học viên cao học Lê Thị Liên Thời gian kinh Cơng trình cơng bố liên quan phí tham gia đề tài (Sản phẩm KHCN, luận án, (số tháng/số tiền) luận văn) 12 tháng Đã bảo vệ + 02 báo chấp nhận Bảo vệ ngày đăng tạo chí quốc tế 22/11/2016 + 01 luận văn Cử nhân hướng dẫn nghiên cứu khoa học Phạm Ngọc Diệp 12 tháng + 01 báo chấp nhận Năm 2015 đăng tạo chí quốc tế + 01 khóa luận hệ Cử nhân ngành Công nghệ Sinh học Lê Minh Hiền 12 tháng Phạm Thị Hương Liên 12 tháng Đặng Thị Hoài Thanh 12 tháng + 01 báo in tạp chí Năm 2015 Khoa học Cơng nghệ VN, Bộ KH&CN + 01 khóa luận hệ Cử nhân ngành Công nghệ Sinh học + 01 báo chấp nhận Năm 2015 đăng tạo chí quốc tế + 01 khóa luận hệ Cử nhân ngành Công nghệ Sinh học + 01 báo chấp nhận Năm 2016 đăng tạo chí quốc tế + 01 khóa luận hệ Cử nhân ngành Cơng nghệ Sinh học Ghi chú: Gửi kèm photo trang bìa luận án/ luận văn/ khóa luận giấy chứng nhận nghiên cứu sinh/thạc sỹ học viên bảo vệ thành công luận án/ luận văn; Cột cơng trình cơng bố ghi mục III.1 PHẦN IV TỔNG HỢP KẾT QUẢ CÁC SẢN PHẨM KH&CN VÀ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI TT Sản phẩm 10 Bài báo công bố tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI/Scopus Sách chuyên khảo xuất ký hợp đồng xuất Đăng ký sở hữu trí tuệ tên chủng Bài báo quốc tế không thuộc hệ thống ISI/Scopus Số lượng báo tạp chí khoa học ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia báo cáo khoa học đăng kỷ yếu hội nghị quốc tế Số lƣợng Số lƣợng đăng ký hoàn thành 02 03 0 0 0 01 Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn sách theo đặt hàng đơn vị sử dụng 0 Kết dự kiến ứng dụng quan hoạch định sách sở ứng dụng KH&CN 0 Đào tạo/hỗ trợ đào tạo NCS Đào tạo thạc sĩ Đào tạo cử nhân 01 02 01 04 PHẦN V TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ TT Đơn vị tính: Triệu đồng Kinh phí Năm thứ Năm thứ (9/2015 (8/2014-8/2015) -10/2016 Nội dung Xây dựng đề cƣơng chi tiết (đã toán) Thu thập viết tổng quan tài liệu (đã toán) Thu thập tư liệu (mua, thuê) Dịch tài liệu tham khảo Viết tổng quan tư liệu Điều tra, khảo sát, thí nghiệm, thu thập số liệu, nghiên cứu 118 (đã tốn) 110 (đã tốn) Chi phí hoạt động chun mơn 118 110 Chi phí cho đào tạo 50 50 Thuê, mua sắm trang thiết bị, nguyên vật liệu 94 (đã toán) 86 (đã toán) 94 86 Chi phí tàu xe, cơng tác phí Chi phí thuê mướn Thuê trang thiết bị Mua trang thiết bị Mua nguyên vật liệu, cây, Hội thảo khoa học, viết báo cáo tổng kết, (chƣa toán) nghiệm thu 23 (chƣa toán) Hội thảo Viết báo cáo tổng kết 12 Nghiệm thu (giữa kì, sở thức) Chi khác 27 (đã toán) 31 (đã tốn) Mua văn phịng phẩm 2 In ấn, photocopy 2 Trách nhiệm chủ trì 7 Quản lý phí + CSVC điện nước 16 20 Tổng kinh phí 250 250 PHẦN VI KIẾN NGHỊ (về phát triển kết nghiên cứu đề tài; quản lý, tổ chức thực cấp) Cần đầu tư để nghiên cứu tách chiết xác định chất có hoạt tính sinh học (làm tăng sinh melanin melanocyte) từ cao dịch chiết hà thủ ô đỏ từ đánh giá tác động chúng mồ hình chuột thí nghiệm Cần đầu tư để nghiên cứu chế tạo hạt nanoliposome mang chất thuốc có hoạt tính sinh học có độ định độ bền tốt để ứng dụng thực tế PHẦN VI PHỤ LỤC (minh chứng sản phẩm nêu Phần III) Được kèm theo sau báo cáo tổng kết đề tài Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2017 Đơn vị chủ trì đề tài (Thủ trưởng đơn vị ký tên, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký)