Tinh sạch và nghiên cứu tính chất enzym dehalogenase từ một chủng vi sinh vật phân lập ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐKQGHM BAO CAO TONG KET KẾT QUẢ TH ựC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC QUÓC GIA Tên đề tài: Tinh nghiên cứu tính chất enzym dehalogenase từ chủng vi sinh vật phân ỉập Việt Nam Mã số đề tài: KLEPT 12-01 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Quang Huy ĐAI HỌC QUỐC GIA HA NỘI ĨRUNG TAM th ò n g tin thư viện 0006 0 0 ^ Hà Nội, 2015 PHẢN I THÔNG TIN CHUNG 1.1 Tên đề tài: Tinh nghiên cứu tính chất enzym dehalogenase từ chủng vi sinh vật phân lập Việt Nam 1.2 Mã số: KLEPT 12-01 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Đơn vị công tác Vai trò thực đề tài Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN Chủ trì đề tài Chức danh, hoc vi, ho tên PGS.TS Nguyễn Quang Huy TS Phạm Bảo Yên PTN Trọng điểm CN Enzym Protein Thành viên ThS Ngô Thị Trang Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN Thành viên Viện vsv CNSH, ĐHQGHN Thành viên TS Nguyễn Huỳnh Minh Quyên ThS Nguyễn Đàm Lý Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN Thành viên ThS Nguyễn Ánh Tuyết Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN Thành viên 1.4 Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN 1.5 Thòi gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: 1.5.2 Gia hạn (nếu có): từ tháng năm 2012 đến tháng năm 2014 đến tháng năm 2015 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2012 đến tháng năm 2015 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): (v ề mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ỷ kiến Cơ quan quản lý) 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 500 triệu đồng PHẢN II TỎNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u Viết theo cấu trúc m ột báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo đăng tạp chí khoa học ĐHQGHN sau đề tài nghiệm thu), nội dung gồm phần: Đ ặt vấn đề: Nhóm hợp chất halogen nhóm hợp chất ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học Bên cạnh lợi ích mang lại việc sử dụng tràn lan thải môi trường m khơng có phương pháp xử lý triệt để gây hậu nghiêm trọng đến môi trường, hệ sinh thái sức khỏe người (Greaves cộng sự, 1981) Việc áp dụng phương pháp vật lý, hóa học để giải tình trạng ô nhiễm gây hợp chất halogen cho hiệu cao song chi phí đắt địi hỏi cơng nghệ đại Phương pháp sinh học sử dụng khả phân giải vi sinh vật tự nhiên đánh giá tiềm cao không cho hiệu nhanh chóng m cịn mang tính bền vững, tốn kém, thân thiện với mơi trường Trong tự nhiên tồn nhóm vi sinh vật có khả sử dụng hợp chất halogen để thực trình trao đổi chất, trì hoạt động sống thể, chuyển hóa hợp chất halogen từ dạng độc hại trở nên độc khơng cịn độc với mơi trường sinh thái người (Fetzner Ligens, 1994; W en Fahrul, 2012; W ildeman Verstraete, 2003) Việt Nam nước sản xuất nơng nghiệp với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm thuận lợi cho phát triển trồng song thuận lợi cho phát sinh, phát triến sâu bệnh, cỏ dại gây hại mùa màng, hàng năm Việt Nam sử dụng lượng lớn hóa chất bảo vệ thực vật mà chủ yếu họp chất nguồn gốc clo hữu Việc sử dụng tràn lan họp chất dẫn đến tồn dư loại họp chất gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Nguyễn cộng sự, 2007) Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu việc ứng dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải hợp chất halogen để giải ô nhiễm môi trường Dehalogenases nhóm gồm nhiều enzym xúc tác cho việc loại bỏ nguyên tử halogen từ họp chất hữu có chứa halogen liên kết với cacbon Sự phân tách halogen khỏi liên kết với tham gia enzym xúc tác theo nhiều chế khác nhau: (i) Loại nhóm halogen q trình thay nhóm halogen nguyên tử hydro; (ii) Loại nhóm halogen với có tham gia phân tử oxy Phản ứng nhóm xúc tác monooxygenases (hoặc dioxygenases); (iii) Thủy phân dẫn xuất nhóm halogen, phản ứng thủy phân xúc tác halidohydrolases, nhóm halogen thay tham gia nucleophin nhóm hydroxy có nguồn gốc từ nước; (iv) "Thiolytic" dehalogenation, số nhóm vi khuẩn phân hủy dichloromethane với tham gia glutathione S-transferase xúc tác hình thành liên kết glutathione S-chloromethyl dẫn tới với việc khử clo; (v) Loại bỏ nhóm halogen khỏi phân tử qua việc hình thành m ột liên kết đơi; (vi) Loại bỏ nhóm halogen có tham xúc tác hydratase (Hardman and Slater, 1981) Một số chủng vi khuẩn có khả sản sinh enzym dehalogenase phân lập Methylobacterium sp HJ1 (Jing cộng sự, 2008), Pseudomonas putida (M otosugi cộng sự, 1982), Xanthobacter autotrophicus GJ10 Ợanssen cộng sự, 2005), Pseudomonas B6P (Mesri cộng sự, 2009) Hầu hết, vi khuẩn sản sinh dehalogenase có loại dehalogenase Cho đến phát lồi có khả sản sinh loại đồng phân dehalogenase Rhizobium sp Nó sản sinh đồng phân halogenase Dehalogenase L (DehL), Dehalogenase E (DehE), Dehalogenase D (DehD) để phân hủy dẫn xuất halogen axít propionic có 2,2 DCPS phân hủy dehalogenase E Mục tiêu - Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sử dụng hợp chất có chứa clo - Tinh nghiên cứu tính chất dehalogenase tách từ chủng vi khuẩn phân lập Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Các mẫu bao gồm đất, nước, bùn thu thập từ môi trường khác Việt Nam (Hà Nội, Thái B ình ), tập trung khu vực có ô nhiễm chất thải chứa hợp chất clo sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ sâu Các m ẫu sau thu thập bảo quản nhiệt độ lạnh chuyển phân tích phịng thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ Enzym Protein (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN) Các hóa chất cung cấp từ hãng có uy tín, 1,2-Dichloroethane (1,2-DCE) mua từ hãng Prolabo (M ỹ), Sodium -2,2-Dichloropropionate (2,2-DCP) từ Meck (Đức), 3,4- Dichloroaniline (3,4-DCA) Sigma (Mỹ), kit API 20, API 50NE (hãng Biomerus, Pháp) Các thiết bị sử dụng thực Phịng enzym phân tích hoạt tính sinh học, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ enzym protein Phương pháp phân lập: Các mẫu nuôi cấy làm giàu lần, ngày/lần môi trường chọn lọc (môi trường M GB) bao gồm thành phần mơi trường khống BS, mơi trường ngun tố vi lượng TM SS chất 1,2-DCE, 2,2-DCP, 3,4-DCA với nồng độ 5mM, 20mM, 50mg/l tương ứng atrazin (khơng có báo cáo) Phương pháp cấy gạt: Môi trường thạch MGB bao gồm thành phần dung dịch BS lOx, (K2H P 4.3H20 42,5g; (NH4)2S 20g, N aH 2P 4-3H20 lOg); dung dịch TMSS lOx (M gS04.7H20 2g, F eS 04.7H20 120mg, M n S 4.4H20 23mg, Z n S 418mg, C oC12-6H20 lOmg, EDTA 0,5M pH=7,5); thạch 20g/l, EDTA 0,5M bổ sung chất khác 1,2- DCE nồng độ 5mM, 2,2DCP nồng độ 20mM chất 3,4-DCA nồng độ 50mg/l atrazi (không có báo cáo) đổ vào đĩa petri thủy tinh Các m ẫu pha loãng với nồng độ từ 1CT2 đến 10' Phương pháp tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sử dụng họp chất clo: Mơi trường chọn lọc có bổ sung thạch bromothymol blue (Fortin cộng sự, 1998) Khả phát triển tạo màu môi trường có bromothymol blue để chọn lọc chủng có khả phân giải tốt chất Bromothymol blue chất thị màu cho khả phân giải hợp chất clo (Wildeman Verstraete, 2003) Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi sinh vật tiến hành sử dụng kit API 20 NE (với vi khuẩn Gram âm) kit API 50 (với vi khuẩn Gram dương) theo hướng dẫn cùa hãng Biomerius (Pháp) Phương pháp phân loại vi sinh vật: Phương pháp tách chiết, khuếch đại xác định trình tự 16S ADNr theo quy trình Sakiyam a cộng , 2009 Trình tự 16S ADNr phân tích phần mềm CLUSTAL X theo Thom pson cộng sự, 1997 Trình tự tham khảo, so sánh lấy từ liệu DDBJ, EM BL ngân hàng gen Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo Kimura, 1980, Saitou Nei, 1987 Các m ẫu giải trình tự gen Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, ĐHQG HN cô n g ty M a c ro g e n (Hàn Quốc) Phản ứng khuếch đại ADN, thành phần phản ứng (|il): 10X buffer: IOịiI; dNTP mM:10|il; mồi xuôi 9F (10 pmol/|xl): 4|il; mồi ngược (10 pmol/ịil): fil; Taq polymerase (5u/ịu1): ịi\: ADN khuôn ( - 0 ^ ) : ỉ-2ịi\; H20 Chu trình nhiệt: 95*c - phút, 35 chu kỳ; 95°c - 30 giây; 55°c 30 giây ; 72°c - phút 30 giây; °c - 00 Mồi cho khuếch đại 16S ADNr gồm mồi xuôi 9F: 5'- GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' m ồi ngược 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 Phương pháp tách dehalogenase: Dịch chiết chuẩn bị từ tế bào vi khuẩn phát triển giai đoạn cuối pha log Vi khuẩn ni mơi trường MGB có chứa 25mM chất 2,2 DCPS Sau 500ml dịch tế bào vi khuẩn ly tâm lO.OOOg /10 phút 4°c Cặn tế bào thu đem rửa lOOml dung dịch đệm Tris-acetate 0,1M, pH 7,6 Tế bào vi khuẩn thu hòa tan 15ml Tris-acetate 0,1M , pH 7,6, để tiến hành siêu âm phá tế bào Siêu âm phá tế bào thực theo bước phá tế bào 15 giây, dừng 30 giây lặp lại lần với cường độ X = 10 um [17] Phương pháp phân tích hoạt tính enzym dehalogen: Hoạt tính enzym xác định bàng tổng lượng ion Cl- đo hỗn hợp phán ứng điều kiện 30°c Hỗn hợp phản ứng gồm 4,700|il Tris-acetate 0,1 N Ị pH 7,6, trộn với 50|il chất 2,2- DCPS ủ 30°c bế ổn nhiệt 10 phút Sau bổ sung 250|il dịch chiết enzvm thô 30°c phút theo phưong pháp Bergmann Sanik, 1957 Mầu đối chứng bổ sung HgSƠ lmM để bất hoạt dehalogenase phương pháp điện di khơng biến tính protein: Điện di khơng biến tính xác định enzym cỏ dịch chiết hay khơng Bán gel điện di khơng biển tính chuấn bị theo phương pháp Hardman Slater, 1981 sử dụng hệ thống điện di Mini-protean Gel có chứa dehalogenase khơng bị biến tính ủ với chất 2,2-DCP 50mM 30°c, pH 7.6 30 phút Sử dụng dung dịch chứa A gN 03 cho việc phát băng ban gel sau điện di (theo Hamiđ cộng 2010) Phương pháp sắc ký trao đối anion thực theo Fahrul Ronald, 2012 Sử dụng Q Sepharose (Flex-Column 0,7x5cm) Các dung dịch đệm gồm hỗn hợp dung dịch có nồng độ muối thấp: 5mM đệm phosphate pH 7.8; lm M EDTA; 10% glycerol; lm M DTT dung dịch có nồng độ muối cao: lOOmM đệm phosphate pH 7,8; lm M EDTA; 10% glycerol; lm M DTT Sử dụng građient nồng độ muối với nồng độ tăng dân từ 5mM đến lOOmM cho sắc ký trao đổi mg protein từ dịch chiết enzym thô bố sung lên cột sắc ký, tốc độ lm l/phút Các phân đoạn thu lại với thề tích lm l để xác định hoạt tính enzym Phương pháp điện di SDS-PAGE: Các phân đoạn thu sau chạy sắc ký điện di biến tính protein để kiểm tra độ tinh enzym Dịch enzym qua cột trộn với đệm mẫu (4x) có thành phần (lOml) gồm lOOmM DTT, 4ml H20 , 40% glycerol, 8% SDS, 2.4% Tris, Coomasie Brilliant Blue 0,04g; Dịch mẫu enzvm trộn với đệm mẫu (tỷ lệ 1:3), ủ 95°c 10 phút Phương pháp sắc ký lọc gel: enzym sau qua cột sắc ký trao đối anion sắc ký lọc gel gel Sephadex G-75 0,5mg protein sử dụng dung dịch đệm gồm 20mM Trisacetate, 0,1M sodium acetate pH 7,5 sử dụng để cân rửa cột sắc ký Tốc độ chảy đạt 0,5ml/phủt, phân đoạn thu với tích lm l (Hardman Slater, 1981) Phương pháp thống kê sinh học: Các thí nghiệm lập lại lần số liệu xử lý phần mềm Excel Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 K ết phân lập, tuyển chọn, phân loại chủng vi sinh vật ỉ phân lập tuyến chọn chủng Từ mẫu đất nước thu khu vực khác nhau, sau lần làm giàu liên tiếp (5 ngày/lần) môi trường M GB lắc °c, 160rpm, dịch làm giàu cấy trải môi trường thạch MGB thạch bổ sung loại chất khác với nồng độ tương ứng 1,2 DCE nồng độ 5mM, 2,2-DCPS nồng độ 20mM 3,4-DCA nồng độ 50mg/l Sau thời gian từ đến ngày ni cấy mơi trường MGB có bổ sung chất chứa clo khác thu kết bảng 1, Kết nghiên cứu cho thấy không phân lập chủng vi nấm mọc môi trường chọn lọc hầu hết vi khuẩn số lượng loài vi khuẩn mọc mơi trường đa dạng, lựa chọn đối tượng chủng vi khuẩn nghiên cứu (Nguyễn Bá Hữu cộng sự, 2007) B ản g Đặc điếm khuẩn lạc mơi trường MGB có bổ sung chất 3,4- DCA Kí hiệu chủng V Mầu nước: chủns STT Hình dạng khuẩn lạc Màu sắc Đường kính (mm) NAI Trịn, bóng, có tâm Trắng ngà 1,0-1,5 mm NA2 Dẹt, khơ, có tâm Vàng nhạt Khơng xác định NA3 To, bóng Vàng nhạt Khơng xác định NA4 Trịn, bóng, dẹt, rìa khuẩn lạc nhăn Trắng ngà 2,0 mm NA5 Tròn dẹt Trắng ngà 1,5 mm NA6 Trịn, bóng, lồi, khuẩn lạc bé Trăng Khơng xác định NA7 Bóng, dẹt, rìa phang Trang ngà Không xác định NA8 Khuẩn lạc bé, lồi Vàng nhạt Không xác định Mầu đất: chủng ] DAI Trịn, to, dẹt, bóng Trăng 3,0 mm DA2 Dẹt, bóng, rìa khuẩn lạc có rãnh Trắng Khơng xác định DA3 Trịn, dẹt, bé Trắng sữa 0,3 mm DA4 To, dẹt, bóng Trắng Không xác định DA5 Bé, dẹt, khô Trang Khơng xác định DA6 Trịn, dẹt, khơ, nhẵn Trắng đục 1,0 mm DA7 Tròn, lồi, bề mặt nhẵn, có tâm Trăng sữa 0,3 mm & DA8 Trịn, lồi, bóng Cam nhạt 0,5 mm DA9 Trịn, dẹt, bóng Trắng sữa 0,8 mm Trên mơi trường MGB có bổ sung chất 3,4-DCA phân lập 17 loại khuẩn lạc khác có chủng từ mẫu đất chủng từ mẫu nước Các khuẩn lạc hầu hết có hình trịn, màu trắng sữa, có vài khuẩn lạc màu cam đến vàng nhạt, nhìn chung đường kính khuẩn lạc dao động từ 0,3 đến 3,0mm Một số khuẩn lạc kích thước nhỏ khơng xác định đường kính có hình tia chia thùy Bảng Đặc điểm khuẩn lạc mơi trường MGB có bổ sung chất 2,2-DCPS Hình dạng khuẩo lạc Màu sắc Đường kính (min) STT Kí hiệu chủng HI Tròn, dẹt, nhăn Trắng sữa 3-5 mm H2 Trịn, dẹt, nhăn, có màu sâm Trắng sữa 2-4 mm H3 Trịn, bóng, lơi Trắng lmm H4 Trịn, ừăng, khơng bóng, nhân Trăng Khơng xác định H5 Trịn, bóng Trắng 0,5 mm H6 Trịn, dẹt, viền ngồi có tia Trăng Khơng xác định H7 Hình tia, dẹt, khơng lơi Trăng Khơng xác định H8 Trịn, dẹt, khơng lồi Trăng 2mm H9 Trịn, lơi giữa,khơng bóng Vàng chanh 2mm 10 H10 Trịn, chấm nhỏ giữa, dẹt Trăng 3-5mm 11 HI Trịn, bóng, lơi Vàng chanh l-3mm 12 H12 Trịn, tia viên ngồi, có nhân Trăng đục 2-5mm 13 H13 Trịn, nhăn giữa, nhân trăng Trăng đục Khơng xác định 14 H14 Trịn, nhăn, viên ngồi có tia Trăng đục 4mm 14 H15 Trịn, nhân, bóng, lơi Trăng đục 2mm 16 H16 Trịn,có nhân,bóng, lơi Trăng đục Khơng xác định 17 H17 Giơng hình nâm,dẹt, khơng bóng Vàng nhạt 2mm 18 H18 Trịn, bóng, lơi,viên ngồi nhạt Trăng đục 3-5mm 19 H19 Trịn bóng, nhăn Vàng nhạt 2-3 mm 20 H20 Trịn, bóng, lơi, nhân đậm Trăng đục Không xác định Trên môi trường MGB có bổ sung chất 2,2-DCPS chúng tơi chọn 20 loại khuẩn lạc khác ihau Cả 20 chủng vi khuẩn có hình trịn, đường kính nằm khoảng từ 0,5-5mm, đa số có màu trắng trắng đục, số có màu khác biệt vàng nhạt vàng chanh Bảng Đặc điểm khuẩn lạc môi trường MGB bổ sung chất 1,2-DCE STT Kí hiệu chủng Hình dạng khuẩn lạc Màu sắc Đường kính (mm) Mẩu nước: chủne NE1 Trịn, to, dẹt, bóng, có tâm Trắng sữa 3,0 mm NE2 To, lồi, bóng, rìa cưa Trắng sữa Khơng xác định NE3 To, dẹt, bóng Trắng ngà Khơng xác định NE4 Trịn, lồi, bóng Trắng 1,0 mm NE5 Dẹt, khơ, có tâm Trắng ngà Khơng xác định NE6 Trịn, bé, lồi, bóng Trắng sữa 0,5 mm NE7 Trịn, bé, lồi, khơ Trắng sữa 0,2-0,3 mm NE8 Rất bé, khơ, có tâm Trắng sữa Không xác định NE9 Dẹt, khô Trắng đục Không xác định Mấuđẩt: chủng DE1 Trịn, bóng, nhầy Vàng nhạt 1,5 mm DE2 To, dẹt, rìa cưa Trắng ngà Khơng xác định DE3 Trịn, to, lồi, bóng Trắng ngà 3,0 mm DE4 Rất bé, lồi, khô Trăng Không xác định DE5 Trịnm, bóng, lồi Trắng sữa 2,0 mm Tương tự, phân lập 14 chủng từ môi trường MGB có bổ sung chất 1,2-DCE Hầu hết ciủng có khuẩn lạc bóng, dẹt, số khuẩn lạc kích thước khơng xác định lừ chùng vi khuẩn phân lập tiến hành tuyển chọn đại diện cho khả phân hủ} cao họp chất chứa clo Các chủng tuyển chọn cần đáp ứng hai tiêu chí có chả sinh trường tốt môi trường chọn lọc MGB bổ sung chất đồng thời có khả phân íiiai mạnh hợp chất clo qua mức độ chuyên màu mạnh môi trường thạch MGB có bơ sung Bromothymol blue Trên mơi trường MGB có bố sung chất 3,4-DCA, kết qua cho thấy số chung ký hiệu N A I, NA4, NA7, DAI có khả phát trièn mạnh Tuy vậy, kết hợp với kết chuyến màu mồi tnrờng thạch bổ sung Bromothymol bluc (75mg/l) chủng chọn chùng NA4 với kha chuyên màu môi trường từ màu xanh sang màu va nu rõ rệt (hình 1) Tương tự trình tuvên chọn thí nehiệm chất 3,4-DCA, chất 2,2-DCPS, 1,2-DCE lựa chọn chủng HI DE1 cho nghiên cứu Hình Khuẩn lạc mơi trường MGB có bổ sune Bromothymol blue 1.2- DCK 2,2 -DCPS 3.4DCA (từ trái sang phải) 4.1.2 Đặc ãiêm sinh lý sinh hóa phán loại chủng vi sinh vật tuyên chọn Kel qua nhuộm Gram cho thấy chung NA4 H ll bẳt màu hồng với thuốc nhuộm, cịn chủng DE1 bắt màu tím với thuốc nhuộm Bước đầu phân loại chúng NA4 HI vi khuân Gram (-), chủng DE1 vi khuân Gram (+) Hình thái tế bào chủng NA4 HI có hình dạng que ngắn, chung NA4 có kích thước tế bào lớn, dễ dàng nhìn thấy hỉnh dạng tế bào soi kính hiên vi Chúng DE1 có dạng tê bào hình câu tê bào tập trung thành đám Đê quan sát kỹ đặc điểm hình thái tế bào chúng tơi tiến hành chụp ảnh tế bào kính hiển vi điện tử quét JSM -5421LV chủng nghiên cứu Hình Hình thái chúng NA4 HI DE1 kính hiển vi điện tử quét X 5000 lần (từ trái sáng phải) Kêt từ hình cho thấy hai chủng NA4 HI có hình que ngẩn, tế bào chúng NA4 có kích thước khống 1,8 ịiin ± 0,3 |nm, kích thước tế bào chủng HI khoang (im ± 0,5p.m Hình chụp chủng DE1 cho thấy rõ tế bào dạng hình cầu, có đường kính khoảne từ 0,8± 0,2fim, tế bào có xu h n o liên kết, kết dính lại với (hình 2) 4.1.3 Nghiên cứu đặc điêm sình hỏa chủng nghiên cứu sử dụng kit thư API Kit API cua hăng Biomeriux sử dụng việc nghiên cứu giúp đặc điếm hóa sinh cua chúng vi khuan thơng qua việc đánh giá sử dụng hợp chất hữu từ có sở phân loại chủng nghiên cứu p ổ i với chủng NA4 HI sử dụng kit API 20NE đặc trưng cho nhóm vi khuấn Gram (-)■ Kết nghiên cứu thể bảng Bảng Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng nghiên cứu (kit API 20NE) C hủngH ll Chủng NA4 E colỉ Potassium nitrate + + + L-tryptophane - - D-glucose + + + L-arginine - - - Urea + + - Esculin ferric citrate + + + Gelatin (bovine origin) + - + 4-nitrophenyl- D-galactopyranoside + + + D-glucose + + + L-arabinose + + + D-mannose + + + D-mannitol + + + N-acetyl-glucosamine + + + D-maltose + + + Potassium gluconate + - + Capric acid - - Adipic acid - - _ Malic acid + + _ Trisodium citrate + + _ Phenylacetic acid + + Khả Iiăng sử dụng loại hợp chất + Chú thỉch: (-) Khơng sử dụng; (+) Có sử dụng So với đối chứng E coli, hai chửng NA4 HI có khả chuyển hóa từ nitrate sang nitrìte, khả lên men glucose, thủy phân esculin khả đồng hóa đường glucose, arabinose, mannose, mannitol Bên cạnh đó, E.coli khơng sinh urea khơng có khả sử dụng citrate, NA4 HI lại cho phản ứng dương tính Đây hai đặc điểm sinh hóa đặc trưng vi khuẩn thuộc chi Kỉebsiella Alcaligenes (Sylvain cộng sự, 2006) Kết chủng NA4 thuộc chi Klebsiella chủng H l l thuộc chi Alcaligenes kết dựa phân tích phần mềm hãng Biomeriux Đối với chủng DE1, để xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa chúng tơi sử dụng kit API 50CHB kit sử dụng cho nhóm vi khuẩn Gram (+) thu kết bảng Bảng Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng DE1 sử dụng kit API 50CHB Chủng DE1 B subtilis Salicm + + - Cellobiose + + - - Maltose + + L- arabi nose + + Lactose + - Ribose - - Melibiose + - D- Xylose - - Sucrose + + L- Xylơse - - Trehalose + + Adonitol - - Inulin s - ị3- Methiyl- D- Xylose - - Melezitose - - Galactose + - Raffmose - - Glucose + + Starch (Amidon) - + Fructose - + Glycogen - + Mannose - + Xylitol - - Sorbose - - Gentiobiose - - Rhamnose - - D- Turanose + - Dulcitol - - D- Lyxose - - Inositol - + D- Tagatose - - Mannitol - + D- Fucose - - Sorbitol - + L- Fucose + - a-Methyl-DMannoside - - D- Arabitol - - a-Methyl-DGlucoside - - L- Arabitol - - N-AcetylGlucosiirnine - - Gluconate - - Amygdalin - - 2-Keto- Gluconate - - Arbutin - + 5-Keto- Gluconate - - Esculin + + Chủng DE1 B subtílis Glycero'1 - + Erythritol - D- arabĩinose Khả măng sử dụng loại hợp chất Khả sử dụng loại hợp chất Chú thích: (-) Khơng sử dụng; (+) Có sử dụng Kết qua kit API 50CHB cho thấy chủng DE1 có khả sử dụng đa dạng loại đường Đây đặc điểm sinh hóa, sinh lý quan trọng chủng vi sinh vật nghiên cứu để sử dụng chất chứa clo hữu bổ sung vào mơi trường ni cấy, có khả chuyển hóa từ họp chất có tính độc thành chất khơng cịn độc với mơi trường 4.1.4 Phán loại chủng phương pháp giải trình tự gen 16S ADNr Các chủng vi khuẩn cấy không 24 để đảm bảo chất lượng ADN cho giải trình tự gen Kết giải trình tự 16S ADNr chủng nghiên cứu so sánh với trình tự gen 16S ADNr ngân hàng gen quốc tế dựa vào phần mềm Clustal X Trên sở đó, xây dựng phát sinh chủng loại xác định vị trí phân loại Tóm tắt hoạt động nghiên cứu tác giả thuyết minh đề cưong (Các chương trình, đề tài nghiên cứu khoa học tham gia, cơng trình cơng bơ liên quan tới phương hưởng để tài) T cách tham gia Cấp quản lý / noi cơng tác Chủ trì ĐHQG HN, mã số QT 06-14 2008-2009 Nghiên cứu ảnh hưởng axit asiatic tách từ sắn thuyền Syzygium resỉnosum Gapnep lên vi khuẩn gây sâu Streptococcus mutans Chủ trì ĐHQG HN, mã số QT 08-30 2010-2011 Isolation microorganism degradation biopolymer in Vietnam Chủ trì Tên đề tài/cơng trình Thịi gian Ảnh hưởng dịch chiết số 2005-2006 thuốc lên vi khuẩn gây sâu Streptococcus mutans International Foundation for Science (IFS), Sweden Phân lập tuyển chọn chủng 2011-2013 Bacillus có khả tạo màng sinh Chủ trì ĐHQG HN, mã số QG 11-16 Chủ trì Bộ Công thương học kháng vi sinh vật gây bệnh Nghiên cứu phát triển công nghệ màng 2012-2013 sinh học (bioíilm) xử lý nước thải giàu N, p 2003-2005 Nghiên cứu sản xuất Pfu ADN polymerase công nghệ ADN tái Tham gia tổ hợp Trọng điểm cấp ĐHQGHN mã sô: QG.TO.03.03 Nghiên cứu tách chiết số hợp chất tự nhiên từ thực vật có tác dụng chơng 2008-2010 béo phì rối loạn trao đổi chất lipd- Tham gia Trọng điểm cấp ĐHQGHN ma so: QG.TĐ.08.06 Tham gia Bộ Khoa học Công nghệ, ma số KC.lị.08/06-10 glucid mơ hình động vật thực nghiệm 2007-2010 Nghiên cứu sản xuất số kit đa để phát số vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm đánh giá trạng miễn dịch người bệnh Tóm tắt hoạt động đào tạo sau đại học tác giả thuyết minh đề cương năm trử lại Thịi gian Ho• tên hoc viên cao hoc • • T cách tham gia (HD chính/phụ) Ghi (đã bảo vệ/đang thực hiện) 2008-2010 Trịnh Thị Vân Anh HD Đã bảo vệ 2009-2011 Nguyễn Thị Thúy Anh HD Đã bảo vệ 2009-2011 Trần Thúy Hằng HD Chính Đã bảo vệ 2009-2011 Nguyễn Thị Thanh Lịch HD Chính Đã bảo vệ 2010-2012 Ngơ Thị Kim Tốn HD Chính Đang thực 2010-2012 Nguyễn Thị Giang HD Đang thực - T h ký đề tài (nếu có) Họ tên: Ngày, tháng, năm s in h : Nam/ N ữ : Học hàm, học v ị : Chức danh khoa h ọ c : Chức v ụ : Điện th o i: Tổ chức : Nhà riê n g : Mobile: - Tổ chức chủ trì đề tài Tên tổ chức chủ trì đề tài: Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG HN Điện thoại: 04- 38581419 Fax: 04- 38583061 E-mail: dhkhtnhn@vnn.vn Website: http://www.hus.edu.vn Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Tên tổ chức chủ quản đề tài: Đại học Quốc Gia Hà Nội - Các tổ chức phối họp thực đề tài ('nếu cỏ ì Tên tổ chức : Tên tổ chức chủ quản Điện th o i: F a x : Địa ch ỉ: 9- Các cán thực đề tài (Ghi người có đỏng góp khoa học thực nội dung chỉnh thuộc tơ chức chủ trì tơ chức phôi hợp tham gia thực đê tài, không 10 người kê chủ nhiệm đề tài) T T Họ tên, học hàm học vị TS Nguyễn Quang Huy TS Phạm Bảo Yên Tổ chức công tác Trường ĐH khoa học tự nhiên Trường ĐH Khoa học Tự nhiên T cách tham gia Nội dung công việc tham gia Thời gian làm việc cho đề tài (Số tháng quy đổi2) Chủ trì Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính phân huỷ hợp chất chứa clo Thành viên Nghiên cửu tách chiết, tinh enzym dehalogenase từ 1-2 chủng vi sinh vật có hoạt tính 12 Một (01) tháng quy đổi tháng làm việc gồm 22 ngày, ngày làm việc gồm tiếng 3 ThS Trang Ngơ Thị TS Nguyễn Đình Thắng TS Nguyễn Huỳnh Minh Quyên Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Thành viên Tạo dòng gen vecto biểu biến nạp vào E coli thương mại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Thành viên Phân tích biểu gen dehalogenase vi khuẩn E coli tái tổ hợp Thành viên Tối ưu hóa ảnh hưởng số nhân tổ lên khả sản xuất enzym ngoại bào từ chủng vi khuẩn phân lập Viện Vi sinh vật công nghệ sinh học 12 II M ỤC TIÊU, N Ộ I DUNG VÀ SẢN PH ẨM D ự KIÊN 10 - Mục tiêu ( Bám sát cụ thể hóa định hướng mục tiêu theo đặt hàng - cố) Phân lâp tuyển chọn số chủng vi sinh vật có enzym dehalogenase Việt Nam Tách chiết, tinh nghiên cứu tính chất enzym thuộc nhóm haloacid dehalogenase từ chủng vi sinh vật phân lập, tuyển chọn 1 -Nội dung NCKH (Nêu rõ nội dung khoa học, công nghệ cần giải quyết, hoạt động đế thực hiệri' nội dung tạo sản phâm; ỷ nghĩa, hiệu việc nghiên cứu, phướng án giải quyêt, rõ nội dung mới, tinh kế thừa phát triển, nội dung cỏ tinh rủi ro giải pháp khăc phục, ghi rõ chuyên đề cần thực nội dung) Nội dung 1: Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải nhóm chất halogen từ mơi trường sinh thái khác - Hoạt động 1: Thu thập mẫu nước, bùn, đất từ địa điểm ô nhiễm khác rác thải, nước thải từ khu vực sử dụng thuốc trừ sâu, khu vực có điều kiện sinh thái khác - Hoạt động 2: Từ mẫu thu thập tiến hành phân lập chủng vi khuẩn môi trường chọn lọc khác có bổ sung chât có chứa clo Ap dụng phương pháp làm giàu đê để phân lập, tuyển chọn chủng có hoạt tính mạnh Nội dung 2: Tinh nghiên cứu tính châtts enzym dehalogenase tập trung vào nhóm haloacid dehalogenase từ chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh - Hoạt động 1: Tách chiết tinh enzym dehalogenase từ chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh phương pháp sắc ký lọc gen, sắc ký trao đổi ion hay phương pháp kêt tủa thuận nghịch Kiêm tra mức độ tinh băng phương pháp điện di, khôi phô - Hoạt động 2: Nghiên cứu tính chất ảnh hưởng điều kiện môi trường nhiệt độ, độ pH, ion kim loại, chất kìm hãm đến hoạt tính xúc tác enzym tinh 12 - Sản phẩm dự kiến (Cụ thể hóa, thuyết minh rõ sản phẩm khoa học dự kiến, vẩn để, nội dung khoa học giải đem lại đóng góp cho nhận thức khoa học, phát mới, sản phẩm công nghệ (bao gằm cá phương pháp mới, quy trình cơng nghệ), giải pháp hữu ích, patent, hệ thống thông tin, liệu tạo ra, khả tạo thươngphâm, hợp tác mới, dịch vụ Đe tài thực thành công phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật, tinh enzym thuộc nhóm dehalogenase Sản phẩm đề tài cơng trình cơng bố tạp chí khoa học ngồi nước học viên cao học, sinh viên đào tạo Đề tài thực việc đưa quy trình tinh enzym dehalogenase từ chủng có hoạt tính mạnh Sản phâm dự kiến đề tài gồm báo quốc tế đăng tạp chí xếp hạng ISI, 02 báo đăng tạp chí nước Đào tạo 01 thạc sĩ 02 cử nhân Xây dựng 01 quy trình tinh enzym dehalogenase 13 - Tổng quan tình hình nghiên cứu nước đề xuất nghiên cứu đề tài 13.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu lý luận thực tiễn thuộc lĩnh vực Đề tài Ngồi nước (Phân tích đảnh giá cơng trình nghiên cứu có liên quan kết nghiên cứu lĩnh vực nghiên cứu đề tài; nêu bước tiến trình độ KH&CN kêt nghiên cửu đó; vấn đề KH CN cần phải nghiên cứu giải quyết) Các hợp chât hữu dẫn xuất halogen có tính độc cao; chúng nhóm chất gây nhiễm mơi trường lớn việc sử dụng tràn lan loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu nông nghiệp việc sản xuất loại dung môi, chất dẻo nhiều chất trung gian cho sản phâm hóa tổng họp Các hợp chất nhóm đa dạng, tồn nhiều loại đồng phân khác ví dụ hỗn hợp polychlorinated biphenyls (PCBs) thành phần nhiêu loại thc trừ sâu thương mại có đến 105 loại đồng phân khác Trong việc tăng suât trông việc bảo vệ thực vật chống lại sâu bệnh dẫn đến việc sản xuất nhiều loại thc trừ sâu Việc sừ dụng hố chât dẫn đến nhiễm khơng có đất mà cịn nước ngầm Hơn nữa, việc ô nhiễm từ khu công nghiệp, bãi chôn lấp, bãi rác kết việc xử lý kỹ thuật không Công nghệ sinh học áp dụng cho xử lý chất thải nguy hiểm có hợp chất hữu dan xuât halogen bao gồm phát triển hệ xử lý có sử dụng enzym xúc tác tác sinh học phân hủy sinh học, làm suy thối tích lũy chất gây ô nhiễm môi trường thuận tiện cho việc xử lý Việc xử lý sinh học cho hơp chất hữu dẫn xuất halogen môi trường áp dụng công nghệ sinh học áp dụng theo: (i) sử dụng chủng vi sinh vật mang gen biến đổi di truyền; (ii) sử dụng thích nghi biến đổi gen vi sinh vật thiết kế để xử lý đất bị ô nhiễm nước ngâm, (iii) xử lý ô nhiễm với tham gia vi sinh vật tạo màng sinh học có hoạt tính định chât độc từ môi trường, (iv) phát triển cảm biến sinh học để phát dấu vêt chât độc hữu cơ, (v) thu hôi sản phẩm từ chất thải cách sử dụng vi khuẩn tích lũy Dehalogenases enzym xúc tác cho việc loại bỏ nguyên tử halogen từ hợp chất hữu có chứa halogen liên kêt với cacbon Các enzym thuộc nhóm từ vi sinh vật thu hút rât nhiêu quan tâm nhà khoa học vi chúng ứng dụng cho ngành cồng nghiệp hóa chât cơng nghệ mơi trường Một số enzym thuộc nhóm phát hiện, tách chiết nghiên cứu [6, 8, 13] Sự phân tách halogen khỏi liên kết với tham gia enzym xúc tác theo nhiêu chê khác nhau: (i) Loại nhóm halogen q trình thay thể nhóm halogen nguyên từ hydro (ii) Loại nhóm halogen với có tham gia phân tử oxy Phản ứng nhóm xúc tác monooxygenases (hoặc dioxygenases) (iii) Thủy phân dẫn xuất nhóm halogen, phản ứng thủy phân xúc tác bời halidohydrolases, nhóm halogen thay tham gia nucleophin nhóm hydroxy có nguồn gốc từ nước, (iv) "Thiolytic" iehalogenation, m ột sơ nhóm vi khn phân hủy dichloromethane với tham gia glutathione S-transferase xúc tác hình thành liên kết glutathione S-chloromethyl dẫn tới với việc khử clo (v) Loại bỏ nhóm halogen khỏi phân tử qua việc hình thành liên kêt đơi (vi) Loại bỏ nhóm halogen có tham xúc tác hydratase [3] Nhu thấy việc xử lý chất thải halogen đường sinh học cân có tham gia nhóm sinh vật khác Các nhóm sinh vật đa dạng tơn điêu kiện sinh thái mòi trường khác [12] Chiba cộng phân lập chủng vi sinh vật từ bùn biển [1], Hamid cộng phân lập chủng có sử dụng chất thuộc nhóm halogen từ đất vùng núi lửa [7] Trong tự nhiên nhóm vi sinh vật có chứa enzym xúc tác phân hủy halogen chủng Alcaligenes eutrophus JMP134 Pseudomonas cepacia có khả tông hợp muconate cycloisomerases phân hủy 4-fluoromuconolactone Các chủng Arthrobacter môi trường bổ sung 2,4 D Pseudomonas sp NCIB 9340 có chứa enzym chun đơi chloromaleylacetate thành succinate Trichloro ethylen (TCE) sử dụng nhiều cơng nghiệp hóa chất nhiều nhóm vi sinh vật oxy hóa với tham gia xúc tác nhiều loại enzym khác toluene 2,3-dioxygenase, toluene 2-monooxygenase, toluene 4-monooxygenase, phenol hydroxylase, 2,4-dichlorophenol hydroxylase, propane monooxygenase, ammonia monooxygenase metan monooxygenase Chủng vi khuẩn Methyỉosinus trichosporium OB3b có enzym chuyển hóa halogen thuộc nhóm oxygenase monooxygenase có hoạt tính mạnh Một số vi sinh vật thuộc nhóm xạ khuẩn Actỉnomyces Streptomyces tổng hợp enzym ngoại bào có hoạt tính phân hủy hợp chât halogen laccases, tyrosinases peroxidases [3] Nhiêu chủng vi sinh vật mang cỏ enzym dehalogenase phân lập, tinh thời gian gần [4, 10,12] Các nghiên cứu phân hủy sử dụng hcrp chất halogen từ vi sinh vật tập trung nhiều vào nhóm halogen có vịng thơm Việc phân hủy nhóm hợp chất cần có tham gia tập đồn gơm nhiêu nhóm vi sinh vật khác Khơng có nhiều cơng trình công bố chế tác dụng từ chủng đơn lẻ M ột số kết công bố phân lập đánh giá khả phân hủy như: Chủng Desuựomonile tiedịei DCB-1 có khả sử dụng dechlorinates 3-chlorobenzoate, chlorophenols tetrachlorethylene; chủng Desul/omoniỉe tiedjei DCB-2, thuộc chi Clostridium, ưu tiên dechlorinates nhóm ortho để phenolic nhóm hydroxyl tri dichlorophenols, chủng Clostridium sphenoides m ột số vi khuẩn thuộc chi Bacilỉus họ Enterobacteriaceae tham gia vào khử clo lindane, chủng Aerobacter aerogenes chuyển hoá thuốc trừ sâu DDT chủng Aỉcaligenes denitrificans NTB-1 phát triển môi trường 2,4- dichlorobenzoate điều kiện hiếu khí [3] Janssen cộng [5] Hiện nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật phân hủy nhỏm halogen cịn gặp nhiều khó khăn, việc tinh nghiên cứu đặc điểm từ enzym chủng vi sinh vật cịn khó khăn nhiều đa dạng hợp chất, dẫn xuất halogen đa dạng enzym tham gia xúc tác cho phân cắt nhóm halogen từ họp cất có vịng thơm, haloalkanes, haloalcohols haloacids [10,13] Kimoto cộng công bố gần áp dụng phương pháp việc tách dòng dehalogenase [9] Việc phân lập chủng vi sinh vật có enzym dehalogenase tinh sạch, nghiên cửu đặc tính enzym khơng làm sáng tỏ q trình chuyển hóa mà cịn góp phần tạo sản phẩm nhằm mục đích phát tồn chất độc hại mơi trường loại bỏ T rong nước (Phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu nước thuộc lĩnh vực nghiên cửu đê tà; đặc biệt phải nêu cụ kết nghiên cứu liên quan đến đề tài mà cán tham gia đê tài thực Neu có đề tài chất thực cấp khác, nơi khác phải giải trình rõ nội dung liên quan đến đề tài này; Nếu phát có đề tài tiên hành mà đê tài có thê phơi hợp nghiên cứu cân ghi rõ Tên đê tài, Tên Chủ nhiệm đề tài quan chủ trì đề tài đó) Tại Việt Nam nước nơng nghiệp hàng năm sử dụng lượng lớn hóa chất bảo vệ thực vật, bảo quản sản phẩm nông nghiệp nuôi trồng thủy sản hay sản xuất cơng nghiêp Trong số họp chất nhóm chất chứa halogen chiếm tỷ lệ không nhỏ Các chất độc phá hủy hệ sinh thái môi trường, gây ô nhiễm nguồn nước ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Tuy nhiên Việt Nam lại chưa có nghiên cứu nhằm đánh giá tác động môi trường đặc biệt chưa quan tâm đầu tư đến việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học nói chung có vi sinh vật có mang enzym dehalogenase số lượng cơng trình cơng bố nước enzym phân hủy hợp chất halogen chưa nhiều Gần có cơng bố số tác giả Viện Công nghệ sinh học việc nghiên cứu tính đa dạng nhóm vi khuẩn kị khí khử clo [2, 14] hay phân lập chủng vi sinh vật tổng hợp lacase ngoại bào [11], nhiên với đa dạng nhóm halogen, mức độ nguy hại nhóm hợp chất mơi trường kết cơng bố khiêm tốn số lượng chất lượng 13.2 Định hướng nội dung cần nghiên cứu Đe tài, luận giải cần thiết, tính cấp bách, ý nghĩa lý luận thực tiên (Trên sở đảnh giá tình hình nghiên cửu ngồi nước, phân tích cơng trình nghiên cứu có liên quan, kêt lĩnh vực nghiên cứu đề tài, cần nêu rõ vẩn đê cịn tơn tại, từ nêu mục tiêu nghiên cứu hướng giải quyêt mới, nội dung cần thực - trả lời câu hỏi đê tài nghiên cứu giải quyêt vân đê gìi, thuận lợi khỏ khăn cần giải quyết), Việt Nam số nước có sử dụng nhiều thuốc bào vệ thực vật thuốc diệt cỏ việc phát tìm kiếm chủng vi sinh vật có hoạt tính manh phân huỷ hợp chất cần thiết góp phần tìm hiểu tính đa dạng nhóm vi sinh vật có hoạt tính Đe tài đặt mục tiêu phân lập chủng vi sinh vật từ vùng sinh thái, mơi trường khác có mang enzym dehalogenase đặc biệt nhóm haloacid dehalogenase Trên sở phân lập, tuyển chọn lựa chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính phân huỷ manh để tiến hành tách chiết enzym thuộc nhóm haloacid dehalogenase nhằm mục đích nghiên cứu sâu chế chuyển hố, đặc tính lý hố học enzym 14 - Liệt kê danh mục cơng trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài trích dẫn đánh giá tơng q u an Chiba K, Yoshida T, Norihiro I, Nishimura H, Imada c, Yashuda H, Sako Y, 2009 Isolation o f bacterium possessing a haloacid dehalogenase from marine sediment core Microbes Environ 24 (3):276-279 Đặng Thị Cẩm Hà, Phạm Quốc Hiệp, Nguyễn Nguyên Quang, Trần Thị Như Hòa, Nghiêm Ngọc M inh (2009) Phân lập đánh giá khả phân hủy hexachlorocyclohexane chủng nấm sợi FNA33 từ đất xử lý khử độc thuốc trừ sâu bàng bioreactor hiếu khí Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2): 257-264 Fetzner s and Ligens F, 1994 Bacterial dehalogenases: Biochemistry, genetics, and biotechnological application Microbiol Rev 58 (4):641-685 Horisaki T, Yoshida E, Kaori s, Takemura T, Yamane T and Nojiri H, 2011 Isolation and characterization o f monochloroacetic acid -degradation bacteria J Gen Appl Microbiol 57: 277-284 Janssen DB, Dinkla IJT, Poelarends GJ, Terpstra p, 2005 Bacterial degradation of xenobiotic compounds: evolution and distribution of novel enzyme activites Environ Microbiol 7(12): 1868-1882 Jing NH, Taha AM, Rolando VP, Wahab RAB, Huyop F, 2008 Dehalogenase from Methylobacterium sp HJ1 induced by the herbicide 2,2 dechloropropionate Aữican J Microbiol Res 2: 32-36 Hamid AAA, Hamdan s, Ariffin AHZ, Huyop F, 2010 Molecular prediction o f dehalogenase producing microorganism using 16S DNA analysis o f 2,2 dichloropropionate degrading bacterium isolated from volcanic soil J Biology Science 10(3): 190-199 Kocabiyik s, Aslan B, Muller R, 1995 Cloning and expression o f a haloacid dehalogenase from Pseudomonas sp strain 19 s Biodegradation 6: 217-222 Kimoto H, Suye s , Makishima H, Arai J, Yamaguchi s, Fujii Y, Yoshioka T, Taketo A, 2010 Clonig of a novel dehalogenase form environmental DNA Biosci Biotechnol Biochem 74(6): 1290-1292 10 Kurihara T, 2011 A Mechanistic analysis o f enzymatic degradation o f Organohalogen Compounds Biosci Bitechnol Biochem 75 (2): 189-198 11 La Thị Thanh Phương, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị cẩm Hà (2005) Một số đặc điểm sinh học khả sử dụng 2,4,5-T chủng vi khuẩn BDN15 phân lập từ vùng đất nhiễm chất độc hóa học Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 3(3): 389-396 12 Marzorati M, Balloi A, Ferra F, Corallo L, Carpani G, Lieven w , Verstraete w Daffonchio D, 2010, Bacterial diversity and reductive dehalogenase redundancy in a 1,2 cichloroethane degrading bacterial consortium enriched from a contaminated aquiíer Microbial Cell Factories 9:12 13 Mowafy AM , Kurihara T, Kurata A, Uemura T, Esaki N, 2010 2-haloacrulate Hydratase, a new class o f flavoenzyme that catalyzes the addition o f water to the substrate for dehalogenation Appl Environ Microbiol 76(18):6032-6037 14 Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị c ẩ m Hà (2007) Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử loại clo Dehalococcoides mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sân bay Đà Nắng bàng kỹ thuật PCR-DGGE Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn 16: 41-45 15 - Cách tiep cận, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng (Luận rõ cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu, thiết kế nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng gằn với nội dung đê tài; so sánh với phương pháp giải quyêt tương tự khác p hân tích đê làm rõ tỉnh mới, tỉnh độc đáo, tính sáng tạo đê tài) Cách tiếp cận \ Từ nghiên cứu giới năm gần việc phân lập vi sinh vật tự nhiên có khả phân huỷ nhóm chât chứa halogen; Các công bô vê chê phân huỷ tác dụng enzym dehalogense đặc biệt nhóm haloacid dehalogenase ứ n g dụng enzym dehalogense việc phát chất độc ứng dụng xử lý môi trường băng đường sinh học có sử dụng chủng vi sinh vật có hoạt tính Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng- Các phương pháp nghiên cứu việc phân lập vi sinh vật môi trường chọn lọc, môi trường khống có bổ sung chất phương pháp sàng lọc dựa phân tử 16S rADN [1,4,7] Phương pháp phân loại sinh học hình thái kính hiển vi thường kính hiển vi quang học, phản ứng hoá sinh, thử khả sừ dụng loại đường, xác định hoạt độ số enzym chuyển hoá, oxi hoá khử sử dụng kit thử - Phương pháp giải trình tự gen mã hóa ARNr 16S Nghiến cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường đến phát triển, tổng hợp enzym chủng phân lập - Tinh enzym phương pháp sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực sắc ký lọc gel 13] - Định lượng enzym theo phương pháp đo độ hấp phụ A280 phương pháp Bradíord - Đánh giá độ tinh enzym thu phương pháp điện di gel polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) Laemmli [8, có Tính mói, tính độc đảo, tính sáng tạo: Việc nghiên cứu enzym dehalogenase có nhóm haloacid dehalogenase có nhiều hội tiềm việc phát enzym Đặc biệt Việt nam có mức độ đa dạng cao nên khả phát chủng có hoạt tính mạnh enzym nhóm dehalogenase khả thi có nhiều hội cơng bố kết tạp chí quốc tế 16 - Khả sử dụng sở vật chất, trang thiết bị (tên phịng thí nghiệm sử dụng đề tài) - Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym-Protein,Trường ĐH khoa học Tự nhiên - Phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh lý thực vật Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên - Phịng thí nghiệm Viện vi sinh vật công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội 17 - Phương án phối họp vói tổ chức nghiên cứu sở sản xuất nước (nếu cỏ) (Tìrình bày rõ phương án phối hợp: tên tổ chức phối hợp chỉnh tham gia thực đề tài nội dung công việc tham gia đề tài, kể sở sản xuất người sử dụng kết nghiên cứu; khả đóng góp nhân lực, tài chính, sở hạ tầng-nếu có) Viện Vi sinh vật Cơng nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội giúp đỡ cung cấp chủng vi sinh vật từ bảo tàng giống để tuyển chọn 18 - Phương án h ọ p tác quốc tế (nếu có) (Trình bày rõ phương án phổi hợp: tên đối tác nước ngoài; nội dung họp tác- đối tác có hợp tác từ trước; nội dung cần hợp tác khuôn khổ đề tài; hình thức thực Phân tích rõ lý cần hợp tác dự kiến kết hợp tác, tác động hợp tác đổi với kết Đề tài Đe tài dự kiến có hợp tác với 9 - Tóm tắt kế hoạch lộ trình thực (LOGFRAME ) ỈTT M ục tiêu 1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải nhóm chất halogen Sản phẩm 1.1 Một chủng vi sinh vật có hoạt tính manh phàn hủy hợp chất halogen 1.2 Kết phân loại chủng vi sinh vật có hoạt tính Các nội dung, hoạt động chủ yếu Điều kiên • thưc • hiên • (Tr đ) Cá nhân, tổ chức thưc • hiên* • Thịi ẹian (băt đâu, kết thúc) 1.1.1 Thu thập mẫu từ địa 60 N.Q.Huy 06/2012 12/2012 - Thu thập mẫu từ vùng ô nhiễm khác nước 30 - Mầu thu thập từ vùng điều kiện sinh thái khác 30 1.1.2 Phân lập chủng vi khuẩn môi trường chọn lọc khác có bổ sung chất có chứa clo 70 - Phân lập môi trường chọn lọc, môi trường khống 20 - Phân lập mơi trường làm giàu nguồn clo 20 Xây dựng phương pháp xác định hoạt độ enzym chất lựa chọn 30 1.2.1 Xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 30 Dự kiến kỉnh phí N.T.Trang P.B.Yên N.Q.Huy N.T.Trang 06/2012 12/2012 P.B.Yên N.Q.Huy N.T.Trang 06/2012 12/2012 P.B.Yên N.Q.Huy N.T.Trang 06/2012 12/2012 P.B.Yên N.Đ.Thắng N.Q.Huy N.T.Trang 06/2012 12/2012 P.B.Yên N.Q.Huy N.T.Trang 06/2012 12/2012 P.B.Yên N.T.Trang 12/2012 P.B.Yên 3/2013 N.Đ.Thắng N.Q.Huy N.T.Trang 03/2013 06/2013 P.B.Yên 10 2 Tách chiết, tinh nghiên cứu tính chất dehalogenase 1.2.2 Xác định trình tự gen 16S rDNA, xây dựng phân loại 30 2.2.1 Tinh dehalogenase 120 N Q H uy N.T.'Trang 03/2013 06/2013 P.B.Yên P.B.Yên 06/2013 N.Đ Thắng 12/2013 N.Q H uy N T Trang 2.1 Enzym dehalogenase tinh 2.2 N ghiên cứu thông số môi trường ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzym - Tinh sơ enzym băng ly tâm, kết tủa muối trung tính 30 - Tinh qua cột sắc ký trao đổi ion, lọc gen 45 Kiểm tra độ enzym điện di, khối phổ 45 2.2.2 N ghiên cứu thông số môi trường 120 - N ghiên cứu khảo sát phân tích ảnh hưởng nhiệt độ môi trường 30 - N ghiên cứu khảo sát phân tích ảnh hưởng pH mơi trường 30 - N ghiên cứu khảo sát phân tích ảnh hưởng ion kim loại 30 - Ảnh hưởng chất kìm hãm, chất khác 30 P.B.Yên 06/2013 N H M Q uyên 12/2013 N.Đ Thắng N T Trang P.B.Yên 06/2013 N Đ Thắng 12/2013 N T Trang P.B.Yên 06/2013 N Đ Thắng 12/2013 N T Trang N Đ Thắng 12/2013 N Q H uy 06/2014 N T.Trang N.Đ Thắng 12/2013 N.Q H uy 06/2014 N T.Trang N Đ Thắng 12/2013 N Q H uy 06/2014 N T.Trang N.Đ Thắng 12/2013 N Q H uy 06/2014 N.T.Trang N.Đ Thắng 12/2013 N Q H uy 06/2014 N T.Trang 11 III HÌNH TH Ứ C SẢ N PH Ầ M KHOA H Ọ C CỦA Đ Ê TÀI 20- Cấu trúc dự kiến báo táo kết đề tài Báo cáo dự kiến phần tóm tắt phần tình hình sử dụng kinh phí đề tài có phần với nội dung chnh sau Phần M đầu Nêu bật cấp thiết đề tài nghiên cứu nhấn mạnh đến tình hình sử dụng hợp chất có chứa halogen thuốc bảo vệ thực vật Phần Tổng quan vấn đề liên quan đến đề tài nghiên cứu Trình bày tính đa dạng nhóm enzym dehalogense từ vi sinh vật Tình hình nghiên cứu nhóm vi sinh vật có hoạt tính dehalogenase nghiên cứu dehalogenase Trình bày khả ứng dụng dehalogenase định hướng nghiên cứu xử lý ô nhiễm môi trường hay nhận biết chất độc từ mơi trường thuộc nhóm halogen Phần Nguyên liệu phương pháp 3.1 Nguyên liệu: Các mẫu đất, nước, bùn từ địa điểm ô nhiễm khác 3.2 Các phương phap nghiên cứu: Các kỹ thuật dùng để thực đề tài, bao gồm phương pháp lựa chọn môi trường chọn lọc việc phân lập chủng vi sinh vật phân huỷ số nhóm chất chứa clo Phương pháp nhận biết, phân loại vi sinh vật dựa đặc điểm hình thái (phương pháp quan sát chụp ảnh kính hiển vi điện tử kính hiển vi quang học), đặc điểm sinh lý, sinh hoá sinh học phân tử qua việc tách chiết ADN tổng số, PCR nhân đoạn gen mã hóa ARNr 16S, phương pháp xác định trình tự nucleotid Các phương pháp xác định hoạt độ enzym halogenase Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố môi trường lên hoạt độ enzym Các phương pháp tinh enzym dehalogense dựa phương pháp sắc ký, điện di để tinh enzym; phương pháp đánh giá độ tinh chế phẩm điện di gel polyacrylamid theo Laemli Phương pháp xử lý thống kê sinh học Phần Kết nghiên cứu thảo luận Kết phân lập tuyển chọn 1-2 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải nhóm chất halogen điều kiện m ôi trường khác Tách chiết, tinh enzym dehalogenase từ chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh Xác định tính chất enzym tinh sạch: độ bền nhiệt nhiệt, pH, chất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác Phần Các kết luận kiến nghị Phần Tài liệu tham khảo 12 21 Bài báo, báo cáo, sách chuyên khảo: Số báo đăng tạp chí quốc gia: Số báo đăng tạp chí quốc tế: STT 02 01 ( dự k iế n ) Nội dung, yêu cầu khoa hoc cần đat • • (Tiạp chí, N hà xuất bản) Chi 01 Bài báo đăng tạp chí quốc tế Đạt u cầu đăng tạp chí Tạp chí có danh mục ISI 02 Bài báo đăng nước Đạt yêu cầu đăng tạp chí Các tạp chí chuyên ngành nước tạp chí Sinh học, Khoa học Đ H Q G HN Tên sản phẩm D ự kiến noi công bố 22 Phương pháp; Tiêu chuẩn; Quy phạm; Phần mềm máy tính; Bản vẽ thiết kế; Quy trình cơng nghệ; Sơ đo, đồ; s ố liệu, Cơ sở liệu; Báo cáo phân tích; Tài liệu dự báo (phương pháp, quy trình, mơ hình, ): Đe án, qui hoạch; Luận chứng kinh tế-kỹ thuật sản phẩm khác STT T ên săn phẩm Yêu cầu k h o a học G hi ( dự kiến) 1I ị [r Danh mục chủng vi sinh vật phân lập Danh sách chủng phân lập (đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa, trình tự gen ) Quy trình tinh enzym dehalogenase Sản phẩm enzym dehalogenase tinh có hoạt tính 23 Sản phẩm công nghệ Mau (model, maket); Sản phẩm (là hàng hố, tiêu thụ thị trường); Vật liệu; Thiết bị, máy móc; Dây chuyền cơng nghệ; Giống trồng; Giống vật nuôi loại khác; STT Tên sản phẩm cụ Đ on vi• đo thể tiêu chất lượng chủ yếu sản phẩm Mẩu tương tự (theo tiêu c h u ẩ n m ới n h ất) M ức chất lượng cần đạt Trong nước Thế giới Dự kiến số lượng/quy mô sản phẩm tạo 24 Sản phẩm dự kiến đăng ký bảo hộ quyền sở hữu cơng nghiệp, giải pháp hữu ích 25 Sản phẩm đào tạo STT Cấp đào tạo Số lượng Nhiệm vụ giao liên quan đến đề tài Tiến sỹ D ự kiến k inh p h í (Tr đồng) 13 Thạc sỳ - Tinh enzym dehalogenase (tập trung nhóm haloacid dehalogenase) từ chủng vi sinh vật phân lập 45,0 - Nghiên cứu tính chất hóa học, vật lý enzym tinh Ảnh hưởng yếu tố môi trường lên hoạt độ enzym tinh Ị3 Cử nhân - Phân lập chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy hợp chất halogen - 40,0 Xác định hoạt độ enzym 26 C ác sản phẩm k h ác (Ghi rõ : Hợp đồng, sách ) IV KHẢ N ẢNG ỬNG DỤNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA K É T Q U Ả N G H IÊ N cửu 27 - Khả ứng dụng kết nghiên cứu 27.1 Khả ứng dụng lĩnh vực đào tạo, nghiên cứu khoa học & cơng nghệ, sách, quản lý Đề tài góp phần hỗ trợ kinh phí cho việc đào tạo sinh viên, học viên cao học nghiên cứu sinh theo chương trình nhiệm vụ chiến lược ĐHQG H N ội m K hoa Sinh học tham gia triển khai; tăng cường hiệu sử dụng trang thiết bị Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein 27.2 Khả ứng dụng thực tiễn (phát triển kinh tế -XH, sản xuất hàng hóa ) Phân lập chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy sổ chất có chứa halogen mạnh áp dụng thử nghiệm quy mơ p ilot với giá thành rẻ phù hợp với điều kiện V iệt Nam 27.3 Khả liên doanh liên kết với doanh nghiệp trình nghiên cứu 28 - Phạm vi địa (dự kiến) ứng dụng kết Đ ề tài 29 - Tác động lọi ích mang lại kết nghiên cứu 29.1 Đổi với lĩnh vực KH&CN có liên quan (Nêu dự kiến đóng góp vào lĩnh vực khoa học công nghệ nước quốc tế) - Cung cấp danh sách số chủng vi sinh vật có khả phân hủy hợp chất chứa nhóm halogen (chủ yếu clo) phân lập tuyển chọn Việt Nam 29.2 Đối với kinh tế - xã hội bảo vệ môi trường (Nêu tác động dự kiến kết nghiên cứu x ã hội:đóng góp cho việc xây dựng chủ trương, sách, pháp luật có tác động làm chuyển biến nhận thức xã hội, phát triển kinh tế xã hội bảo vệ môi trường) - Phát triển nhân lực có trình độ cao lĩnh vực công nghệ sinh học 29.3 Đối với tổ chức chủ trì sở ứng dụng kết nghiên cứu - Nâng cao khả nghiên cứu cho cán giảng dạy, nghiên cứu, sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh tham gia thực đề tài Đặc biệt hỗ trợ cho việc đào tạo sinh viên tham gia 14 'nhiệm vụ chiên lược ĐHQG Hà Nội Phát huy hiệu sử dụng trang thiết bị phịng thí nghiệm đặc biệt phịng thí nghiệm K hoa Sinh học, Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ Enzym Protein, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội Ị 29.4 Kinh p h í nguồn lực khác mà để tài đem lại - Đề tài thực thành cơng góp phần phát triển nguồn nhân lực công nghệ sinh học, đẩy mạnh phát triển phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ enzym protein Tham gia hỗ trợ đào tạo sinh viên nhiệm vụ chiến lược ĐHQG Hà Nội V KINH PHÍ T H ựC HIỆN ĐÈ TÀI Tổng kinh phí thực đề t i : 500.000.000 triệu đồng (năm trăm triệu đồng) Phân bổ kinh phí: Đơn vị tính: Triệu đồng STT Nội dung Kinh phí Năm thử 1 Xây dựng đề cương chi tiết 2,0 Thu thập viêt tông quan tài liệu 3,0 Năm thứ — - Thu thập tư liệu (mua, thuê) Ị Dịch tài liệu tham khảo (số trang X đơn giá) Viết tống quan tư liệu L- —■ Điều tra, khảo sát, thí nghiệm, thu thập số liệu, nghiên cứu 37,0 89,0 Chi phí tàu xe, cơng tác phí 10,0 10,0 Chi phí thuê mướn 10,0 30,0 Chi phí hoạt động chuyên môn 17,0 49,0 - Chi phí cho đào tạo (Phù hợp với m ục 25) 25,0 60,0 M ua săm tra n g thiêt bị, nguyên vật liệu 93,0 94,0 Thuê trang thiêt bị Mua trang thiêt bị Mua nguyên vật liệu, cây, Viết báo cáo k hoa học, nghiệm thu 93,0 10,0 94,0 30,0 Viết báo cáo gửi đăng quốc tế 2,0 10,0 Hội thảo 4,0 12,0 Nghiệm thu câp 4,0 8,0 Chi khác phụ trách chủ nhiệm đề tài 20,0 37,0 4,0 4,0 15 4,0 Mua văn phòng phấm, sách tài liệu In ấn, photocopy 0,8 4,2 Quản lý phí 4% 7,6 12,4 Điện nước 4% 7,6 12,4 Tổng kinh phí hàng năm Tỗng kinh phí năm đề tài 310,0 190,0 500,00 ( năm trăm triệu đồng) Hà Nội, Ngày 17 tháng 07 năm 2012 Thủ trưởng đơn v ị' Chủ nhiệm đề tài u T RI rỘNr TS Nguyễn Quang Huy \p v PHÊ DUYỆT CỦA GIÁM ĐỐC ĐHQGHN K T C U M ĐÓC / „ ỢỊTr 6fí' C £ ? G S T S Ô Ỉ to J % ^ GIÁM Đ Ó C / ịP ^ 11 V ,*;v Ệầ&ịtèìểỵ X , 'tĩSrlTSKH Vũ Minh Giang 16