Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch Streptonkinase tái tổ hợp từ chủng Streptococus pyogenes trong Echerichia coli : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 40

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THƯƠNG NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STREPTOKINASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Streptococcus pyogenes TRONG Escherichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THƯƠNG NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STREPTOKINASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Streptococcus pyogenes TRONG Escherichia coli Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI LUẬN VĂN ĐƢỢC THỰC HIỆN TẠI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2011 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chứng tắc nghẽn mạch máu 1.1.1 Q trình đơng máu .2 1.1.2 Cơ chế tan máu đông 1.1.3 Bệnh tắc nghẽn mạch máu 1.2 Streptokinase 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Cấu trúc không gian 10 1.2.3 Cơ chế hoạt động .11 1.2.4 SK tái tổ hợp .13 1.2.5 Tình hình nghiên cứu điều trị tan huyết khối SK 17 1.3 Streptococcus pyogenes 18 1.3.1 Phân loại khoa học 18 1.3.2 Lịch sử nghiên cứu 19 1.3.3 Đặc điểm sinh học .19 1.3.4 Đặc điểm gây bệnh 21 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .22 2.1 Nguyên liệu thiết bị 22 2.1.1 Tế bào plasmid .22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Dung dịch đệm .23 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 24 2.1.5 Thiết bị thí nghiệm 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu .25 2.2.1 Các phương pháp vi sinh vật .25 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 25 2.2.3 Các phương pháp hóa sinh 29 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35 3.1 Nhân dịng gene mã hóa mSK-nonhis 35 3.2 3.3 Thiết kế plasmid biểu mSK 36 Biểu streptokinase nonhis .39 3.4 3.5 Tinh streptokinase nonhis .41 Hoạt hóa SK 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 52 CÁC TỪ VIẾT TẮT AMI Acute myocardial infarction BLAST Basic local alignment search tool bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease dNTP 2-Deoxynucleoside 5-triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide kb Kilo base kDa Kilo Dalton KP Kali phosphate M Marker MI Myocardial infarction mSK Streptokinase mSK-nonhis Streptokinase không mang đuôi 6x-histidine OD Optical density PCR Polymerase chain reaction Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Pr Protein rSK Recombinant streptokinase SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Taq Thermus aquaticus TBE Tris boric acid EDTA TE Tris EDTA TEMED N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine v/v Volume/volume w/v Weight/volume DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế đơng máu Hình 1.2 Sơ đồ tiêu sợi huyết .6 Hình 1.3 Huyết khối mạch Hình 1.4 Cấu trúc không gian chiều streptokinase 11 Hình 1.5 Cơ chế xúc tác streptokinase 12 Hình 1.6 Streptococcus kính hiển vi điện tử 20 Hình 1.7 Khuẩn lạc S pyogenges môi trường thạch máu 20 Hình 2.1 Đường chuẩn SK 33 Hình 2.2 Đường chuẩn Bradford 34 Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm nhân gene msk-nonhis .35 Hình 3.2 Điện di đồ DNA thiết kế vector biểu pEmSK .36 Hình 3.3 Peak trình tự pEmSK-nonhis .37 Hình 3.4 Cấu trúc biểu pEmSK-nonhis .38 Hình 3.5 Điện di đồ protein tổng số mẫu biểu .39 Hình 3.6 Phân tích suất protein biểu tính phần mềm Dolphin 1D 39 Hình 3.7 Điện di đồ protein dịch cặn 40 Hình 3.8 Điện di đồ protein tinh 41 Hình 3.9 Phân tích độ mSK-nonhis phần mềm Dolphin 1D 42 Hình 3.10 Phản ứng lai Western 43 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các yếu tố đông máu .3 Bảng 2.1 Plasmid nhân dòng biểu .22 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch .23 Bảng 2.3 Các thiết bị thí nghiệm 24 Bảng 2.4 Thành phần PCR 26 Bảng 2.5 Thành phần gel co gel tách .29 Bảng 3.1 Hiệu suất tinh mSK-nonhis tái tổ hợp 42 Bảng 3.2 Độ mSK-nonhis qua lần phá siêu âm 43 Bảng 3.3 Hoạt tính mSK-nonhis sau hoạt hóa .44 Các bảng phụ lục Bảng Hàm lượng protein mẫu tinh 52 Bảng Hoạt tính mSK-nonhis mẫu tinh .52 Bảng Khả hoạt hóa mSK-nonhis xử lý guanidine chất hoạt hóa .53 Bảng Đường chuẩn SK 53 Bảng Hàm lượng băng protein dịch tế bào JMpEmSK 54 Bảng Độ mSK-nonhis sau lần tinh 55 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ MỞ ĐẦU Trong xã hội đại, kinh tế ngày phát triển cộng với áp lực công việc thời gian khiến cho chế độ ăn người trở nên cân đối nguyên nhân lớn dẫn đến bệnh tim mạch Bệnh tim mạch nguyên nhân gây tử vong số giới (www.who.int/2011) Bệnh tim mạch làm chết triệu người năm chiếm 12,2% ca tử vong toàn giới [41] Xu hướng tiếp tục gia tăng hai thập kỷ gây tác động lớn nước có thu nhập thấp trung bình, nơi chiếm tới 3/4 số ca tử vong tim mạch vào năm 2001 [13, 55] Bệnh tim mạch nguyên nhân gây tử vong hàng đầu nước Mỹ Latinh, Caribe, nước Trung Đông Châu Phi Tử vong tim mạch dự kiến tăng gấp lần 20 năm tới [55] Một nguyên nhân dẫn đến bệnh tim mạch chứng tắc nghẽn mạch máu Do để hạn chế thấp tỷ lệ tử vong biến chứng bệnh tim mạch gây ra, nhà khoa học theo hướng phòng ngừa xử lý huyết khối hình thành mạch Trên thị trường có số thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu Durakinase, Streptase, Alteplase, Tenecteplase Tuy nhiên, hầu hết sản phẩm nước với giá thành đắt Nghiên cứu so sánh không thấy khác biệt ưu loại thuốc [21] Sự khác biệt lớn giá cả, thuốc có chất r-tPA có giá gấp gần 10 lần streptokinase Do đó, streptokinase thường sử dụng nước phát triển Ở Việt Nam chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu thuốc tan huyết Đề tài KC10 (2009-2010) coi cơng trình nghiên cứu cấp nhà nước lĩnh vực Trong đề tài nhà nghiên cứu nhân dịng, biểu tinh thành cơng streptokinase Streptokinase biểu dạng có tín hiệu khơng có tín hiệu (mSK), mSK với hoạt tính cao Streptokinase tái tổ hợp bước đầu thử nghiệm đối tượng thỏ thí nghiệm cho kết tốt Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Để hạn chế thấp tỷ lệ tử vong biến chứng chứng tắc nghẽn mạch máu thời gian xử lý huyết khối mạch yếu tố vô quan trọng Thuốc tan huyết khối dạng tiêm sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, thuốc dạng tiêm địi hỏi phải có độ tinh khiết cao, enzyme tái tổ hợp thông thường thường dung hợp đuôi 6xhistidine (6xhis) để thuận tiện cho trình tinh việc dung hợp 6xhis xem gây tác dụng phụ cho người Trên sở đó, khn khổ đề tài KC10 “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase yếu tố hoạt hóa plasminogen mơ (tPA) sử dụng điều trị” thực đề tài luận văn “Nhân dòng, biểu tinh streptokinase tái tổ hợp E coli” với dạng streptokinase tái tổ hợp không dung hợp đuôi 6xhistidine để tiến tới sản xuất dược phẩm sinh học điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu, có ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn cao CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chứng tắc nghẽn mạch máu 1.1.1 Q trình đơng máu Đơng máu q trình máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc Bình thường chế quan trọng giúp thể sửa chữa mạch máu bị tổn thương chống máu bị tổn thương thành mạch Q trình đơng máu phụ thuộc vào yếu tố đông máu (bảng 1.1) gồm ba giai đoạn Giai đoạn tạo thành prothrombinase Quá trình xảy có chấn thương thành mạch, có tiếp xúc với collagen thành mạch, với mơ khác ngồi nội mạc vật lạ Sự tạo thành prothrombinase thực theo hai chế nội sinh ngoại sinh (hình 1.1) Hai chế khác giai đoạn hình thành yếu tố X hoạt hóa (Xa) Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Cơ chế ngoại sinh: Khi máu tiếp xúc với mạch máu bị tổn thương, mơ vị trí tổn thương giải phóng yếu tố III (thromboplastin mô) phospholipid Yếu tố III hoạt hóa yếu tố X thành yếu tố Xa Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có tham gia yếu tố Va, ion Ca2+ phospholipid Yếu tố Va làm tăng hoạt tính yếu tố Xa Phospholipid đóng vai trị chất cịn ion Ca2+ làm cầu nối yếu tố Thrombin trường hợp có tác dụng điều hịa Cơ chế nội sinh: Khi máu tiếp xúc với collagen thành mạch bị tổn thương bề mặt vật lạ làm hoạt hóa yếu tố XII thành yếu tố XIIa giải phóng phospholipid tiểu cầu Yếu tố XIIa chuyển yếu tố XI thành yếu tố XIa (có tham gia yếu tố Fletcher Fitzgerald) Yếu tố XIa chuyển yếu tố IX thành yếu tố IXa (có tham gia yếu tố tiểu cầu) Yếu tố X hoạt hóa có tham gia yếu tố VIIIa (yếu tố VIII hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IXa, ion Ca2+ phospholipid Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xa có tham gia phospholipid, yếu tố Va (yếu tố V hoạt hóa nhờ thrombin) ion Ca 2+ Prothrombinase hình thành từ chế nội sinh ngoại sinh đồng thời hai chế nội sinh ngoại sinh Điều chứng tỏ hoạt tính prothrombinase phụ thuộc vào hoạt hóa yếu tố tham gia vào trình Bảng 1.1 Các yếu tố đông máu Các yếu tố Tên gọi vai trò I Fibrinogen, loại globulin, gan tổng hợp đưa vào máu II Prothrombin, protein huyết tương gan sinh Sự tổng hợp prothrombin liên quan chặt chẽ đến hấp thụ vitamin K Nếu rối loạn hấp thụ vitamin K đường tiêu hóa dẫn đến giảm prothrombin III Thromboplastin, enzyme tạo tiểu cầu bị vỡ, mô bị tổn thương IV Ion Ca2+ có huyết tương, có tác dụng hoạt hóa prothrombin V Proaccelerin, loại globulin, gan sinh ra, làm tăng tốc độ đông máu VI Dạng hoạt hoá yếu tố V VII Proconvectin, yếu tố xúc tiến tạo Thrombin Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ VIII Yếu tố chống chảy máu A, có huyết tương, có vai trị quan trọng tạo thành thromboplastin nội sinh Nếu thiếu yếu tố này, máu đông cục máu mềm, dễ di động IX Yếu tố chống chảy máu B, protein huyết tương, cần cho tạo thành thromboplastin X Yếu tố stuart, có huyết tương, gan sinh tương đối bền vững có tác dụng tạo thành thromboplastin chuyển prothrombin thành thrombin XI Prothromboplastin - có sẵn huyết tương, có vai trị tập trung tiểu cầu XII Yếu tố hageman, có huyết tương, có tác dụng hoạt hố đơng máu XIII Yếu tố ổn định fibrin, có sẵn huyết tương, có tác dụng củng cố sợi fibrin thêm vững Con đƣờng ngoại sinh Mô tổn thương Yếu tố mô Ca2+ Yếu tố VII Ca2+, phospholipid Con đƣờng nội sinh Thành mạch tổn thương Yếu tố XII Yếu tố XIIa Yếu tố XI Yếu tố XIa Yếu tố VIIa Ca2+ Yếu tố IXa Yếu tố IX Ca2+, yếu tố VIII phospholipid Yếu tố X Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ 1.9 Tinh streptokinase nonhis Protein mSK-nonhis chủ yếu biểu dạng thể vùi protein khác phần lớn dạng thể tan nên mSK-nonhis tinh phương pháp siêu âm nhiều lần để loại bỏ protein hòa tan 2,5 g tế bào tươi thu sau biểu 28°C môi trường LB bổ sung mM IPTG tinh theo phương pháp phá siêu âm mô tả phần phương pháp Độ mSK-nonhis kiểm tra SDS-PAGE nhuộm bạc M kDa 67  45  35  25  18  Hình 3.8 Điện di đồ protein tinh Protein tổng số (giếng 1), dịch sau siêu âm phá tế bào lần 1, 2, 3, (giếng 2, 4, 6, 8), cặn sau siêu âm phá tế bào (giếng 3, 5, 7, 9); Marker (M) Kết tinh cho thấy sản phẩm cặn sau phá siêu âm lần thứ có băng có kích thước khoảng 47 kDa, tương đương với kích thước mSK (hình 3.8, 9) Cặn cuối hịa với guanidine để làm tan thể vùi Hàm lượng protein qua lần tinh xác định phương pháp Bradford Đồng thời đo hoạt độ mẫu tương ứng để xác định hiệu suất tinh Hiệu suất thu hồi mSK-nonhis tinh đạt 87% (bảng 3.1), tương đương với suất biểu 0,78 mg mSK-nonhis/g tế bào Hiệu suất thu hồi mSK-nonhis cao so với kết tinh rSK (6,7%) rmSK (52%) biểu SK mSK E coli BL21 [4] Năng suất hồn tồn nâng cao điều 41 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ kiện ni cấy bổ sung dưỡng chất kiểm sốt điều kiện nuôi cấy để tăng sinh khối tế bào Bảng 3.1 Hiệu suất tinh mSK-nonhis tái tổ hợp Mẫu Tổng số Tổng hoạt tính protein (mg) mSK-nonhis (U) Hiệu suất thu hồi (%) Hoạt độ riêng (U/mg) Độ (lần) Chưa tinh 21,96 25501 ± 100 1192 ± 1,0 Dịch tinh lần (cặn 1) 3,96 23855 ± 13 94 6020 ± 65 5,1 Dịch tinh lần (cặn 2) 3,75 23277 ± 91 6205 ± 14 5,2 Dịch tinh lần (cặn 3) 3,5 22752 ± 14 89 6480 ± 80 5,4 Dịch tinh lần (cặn 4) 1,96 22161 ± 87 11308 ± 22 9,5 Hình 3.9 Phân tích độ mSK-nonhis phần mềm Dolphin 1D mSK-nonhis tinh tới 97,9% (bảng 3.2) với độ đạt 9,5 lần sau lần phá siêu âm (theo phân tích phần mềm Dolphin 1D (hình 3.9, bảng 3.2) Kết tương đương với độ tinh rSK có histidine cột Ni2+ (95%) [4] mSK-nonhis tinh có hoạt tính riêng đạt 11308 U/mg protein (bảng 3.1), tương đương với kết nghiên cứu trước Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2010) hoạt tính riêng mSK tinh đạt 11558 U/mg protein 42 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Bảng 3.2 Độ mSK-nonhis qua lần phá siêu âm Đô tinh (%) Lần Lần Lần Lần 65,7 76,7 85,7 97,9 Để khẳng định cách chắn hơn, mSK-nonhis tinh lai Western với kháng thể kháng SK huyết thỏ (hình 3.10) Kết phản ứng lai Western băng rõ nét với kích thước khoảng 47 kDa cho thấy protein tinh mSK-nonhis tái tổ hợp SK M 55  43  Hình 3.10 Phản ứng lai Western Phản ứng lai Western mSK-nonhis tinh với kháng thể kháng SK (1); Marker (M) 1.10 Hoạt hóa SK Do guanidine làm biến tính SK, nên số chất hoạt động bề mặt khơng gây ion hóa sử dụng để hoạt hóa SK sau xử lý guanidine Mặt khác, theo Babu et al [7] hoạt hóa SK, bổ sung 10% glycerol làm tăng độ bền enzyme Dịch enzyme tinh pha loãng 200 lần đệm KP 50 mM, pH 7,5, bổ sung 0,5% Triton X-100 1% Tween 20 1,5% Tween 80 ủ 4°C xác định hoạt tính Kết cho thấy có bổ sung glycerol mức độ hoạt hóa mSK-nonhis cao từ 1,6 đến 6,2 lần so với không bổ sung glycerol, cao Triton X-100 (tăng 6,2 lần) Tween 20 có bổ sung glycerol Triton X-100 có bổ sung glycerol hoạt hóa mSK-nonhis cao với hoạt tính 95.463 U/mg 74.279 U/mg cao 43 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ lần 6,3 lần Triton X-100 khơng hoạt hóa mSK-nonhis (0,94 lần) (bảng 3.3) Bảng 3.3 Hoạt tính mSK-nonhis sau hoạt hóa Chất hoạt hóa Hoạt tính mSK-nonhis sau hoạt hóa 4°C, h 0% glycerol (U/mg) % 10% glycerol (U/mg) % Triton X-100 (0,5%) 11208 ± 201 0,9 74279 ± 431 6,3 Tween 20 (1%) 73273 ± 43 6,2 95463 ± 2184 8,0 Tween 80 (1,5%) 35860 ± 1164 3,0 66081 ± 560 5,6 Khơng chất hoạt hóa 11877 ± 309 11877 ± 309 Kết hoạt hóa mSK-nonhis tương tự với kết Vũ Hồng Diệp (2010), Triton X-100 Tween 20 bổ sung glycerol có khả hoạt hóa SK tốt Theo Vũ Hồng Diệp, có mặt glycerol, Triton X-100 hoạt hóa SK cao nhất, tăng 40 lần; khơng có glycerol tăng 12 lần Khi có mặt glycerol, Tween 20 hoạt hóa SK gấp 35 lần 10 lần so với hoạt hóa đệm phosphate khơng có glycerol [4] 44 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Thiết kế thành cơng gene mã hóa streptokinase từ DNA tổng số chủng Streptococcus pyogenes DT7 vector biểu pET21a(+) không đuôi histidine tế bào E coli JM109(DE3) Biểu mSK-nonhis với suất đạt 72% protein tổng số, hoạt tính đạt 1275 U/ml tương đương 10200 U/mg tế bào tươi mSK-nonhis tinh siêu âm có hoạt tính cao 11308 U/mg protein, hoạt hóa 1% Tween 20 bổ sung 10% glycerol có hoạt tính tăng lần đạt 95463 U/mg protein Kiến nghị Tiến hành loại bỏ nội độc tố vi khuẩn (lipopolysaccharide) dịch enzyme tinh Thử nghiệm hoạt tính tan huyết mSK-nonhis động vật thí nghiệm tiến tới thử nghiệm tiền lâm sàng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Văn Nam and Lê Thị Cẩm Dung, Điều trị chống huyết khối tai biến mạch máu não Tạp chí Y học TP HCM, 2003 7(1): p 14-19 Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn Thị Hiền, and Quyền Đình Thi, Biểu gene mã hóa streptokinase từ Streptococcus pyogenes DT17 Bacillus subtilis Hội nghị 35 năm thành lập Viện Công nghệ sinh học, 2010: p 262-267 Trần Minh Tâm, Lê Phải, Châu Khắc Toàn, Cao Văn Diệu, Nguyễn Thị Hồng Ngọc, and Nguyễn Thành Huy, Điều trị tiêu sợi huyết Streptokinase nhồi máu tim cấp Tạp chí Y học thực hành, 2005 8: p 15-18 45 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương Vũ Hồng Diệp, Nghiên cứu biểu Streptokinase Luận án tiến sĩ, Viện công nghệ sinh học, Viện khoa học công nghệ Việt Nam, 2010 Vũ Hồng Diệp, Nguyễn Thị Ngọc Dao, and Quyền Đình Thi, Nhân dịng phân tích trình tự gene mã hóa streptokinase từ chủng Streptococcus pyogenes DT7 Tạp chí CNSH, 2008 6(4A): p 757-763 Tài liệu tiếng Anh Avilan L, A Yarzabal, and C Jurgensen, Cloning, expression and purification of recombinant streptokinase: partial characterization of the protein expressed in Escherichia coli Braz J Med Biol Res, 1997 30(12): p 1427-1430 Babu PVC, VK Srinivas, VK Mohan, and E Krishna, Renaturation, purification and characterization of streptokinase expressed as inclusion body in recombinant E coli J Chromatogr, 2008 861: p 218-226 Bajaj AP and FJ Castellano, Activation of human plasminogen by equimolar levels of streptokinase J Biol Chem, 1977 252: p 492–498 Bradford MM, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem, 1976 72: p 248-254 10 Burket MW, MR Smith, TE Walsh, PS Brewster, and TD Fraker, Relation of effectiveness of intracoronary thrombolysis in acute myocardial infarction to systemic thrombolytic state Am J Cardiol, 1985 55: p 1453-8 11 Caballero AR, R Lottenberg, and K Johnston, Cloning, expression, sequence analysis, and characterization of streptokinase secreted by porcine and equine isolates of Streptococcus equisimilis Infect Immun, 1999 67(12): p 6478-6486 12 Christensen LR, Streptococcal fibrinolysin: a proteolytic reaction due to serum enzyme activated by stretococcal fibrinolysin J Gen Physiol, 1945 28: p 363383 13 Colin DM and L Dejan, Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030 PloS Med, 2006 3(11): p 442 46 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương 14 Craven LL, Acetylsalicylic acid: possible preventive of coronary thrombosis Ann West Med Surg, 1950 4: p 95-99 15 Dao ML and JJ Ferretti, Streptococcus Escherichia coli shuttle vector pSA3 and its use in the cloning of streptococcal genes Appl Environ Microbiol, 1985 49(1): p 115-119 16 Estrada MP, L Hernandez, A Perez, P Rodriguez, R Serrano, R Rubiera, A Pedraza, G Padron, W Antuch, DLJ Fuente, and L Herrera, High level expression of streptokinase in Escherichia coli Bio Technology, 1992 10: p 1138-1142 17 Fletcher AP, N Alkjaersig, A Davies, M Lewis, J Brooks, W Hardin, W Landau, and ME Raichle, Blood coagulation and plasma fibrinolytic enzyme system pathophysiology in stroke Stroke, 1976 7: p 337-348 18 Fletcher AP, N Alkjaersig, and S Sherry, The maintenance of a sustained thrombolytic state in man I Induction and effects Clin Invest J 1959 38: p 1096-1110 19 Fletcher AP, N Alkjaersig, FE Smyrniotis, and S Sherry, Treatment of patients suffering from early myocardial infarction with massive and prolonged streptokinase therapy Trans Assoc Am Physicians, 1958 71: p 287-296 20 Fletcher AP, S Sherry, N Alkjaersig, FE Smyrniotis, and S Jick, The maintenance of a sustained thrombolytic state in man.II Clinical observations on patients with myocardial infarction and other thromboembolic disorders Clin Invest J 1959 38: p 1111-1119 21 Frans VW, B Jeroen, A Betriu, C Blomstrom, F Crea, V Falk, G Filippatos, K Fox, K Huber, A Kastrati, A Rosengren, PG Steg, M Tubaro, F Verheugt, F Weidinger, and M Weis, Management of acute myocardial infarction in patients presenting with persistent ST-segment elevation Eur Heart J, 2008 29(23): p 2909-2945 47 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương 22 Goyal D, G Sahni, and DK Sahoo, Enhanced production of recombinant streptokinase in Escherichia coli using fed-batch culture Bioresour Technol, 2009 100(19): p 4468-4474 23 Hagenson MJ, KA Holden, KA Parker, PJ Wood, JA Cruze, M Fuke, TR Hopkins, and DW Stroman, Expression of streptokinase in Pichia pastoris yeast Enzyme Microb Technol, 1989 11: p 650-656 24 Hager K Prevent Heart Attack and Stroke with Potent Enzyme that Dissolves Deadly Blood Clots in Hours, http://www.dnavitamins.co.uk 2002 25 Hermentin P, T Cuesta-Linker, J Weisse, K Schmidt, M Knorst, M Scheld, and e al., Comparative analysis of the activity and content of different streptokinase preparations Eur Heart J 2005 26(9): p 933-40 26 Hernandez L, P Rodriguez, A Castro, R Serrano, MP Rodriguez, R Rubiera, MP Estrada, A Perez, J de la Fuente, and L Herrera, Determination of streptokinase activity by quantitative assay Biotecnol Apl, 1990 7(2): p 153-160 27 Hoffman R, EJ Benz, SJ Shattil, B Furie, and HJ Cohen, Hematology: Basic Principles and Practice 1991: Churchill Livingstone New York 28 Hubbard WN, The systemic toxic responses of patients to treatment with streptokinase streptodornase J Clin Invest, 1951 30: p 1171-4 29 Ichinose A, K Takio, and K Fujikawa, Localization of the binding site of tissuetype plasminogen activator to fibrin J Clin Invest 1986 78(1): p 163-169 30 Johnsen LB, K Poulsen, M Kilian, and TE Petersen, Purification and cloning of a streptokinase from Streptococcus uberis Infect Immun, 1999 67: p 10721078 31 Johnson AJ, The lysis in rabbits of intravascular blood clots by the streptococcal fibrinolytic system (streptokinase) Exp Med J, 1952 95: p 449-494 32 Ju J, I Kheterpal, JR Scherer, C Ruan, CW Fuller, AN Glazer, and RA Mathies, Design and synthesis of fluorescence energy transfer dye-labeled primers and 48 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương their application for DNA sequencing and analysis Anal Biochem, 1995 231(1): p 131-40 33 Klessen C and H Malke, Expression of the streptokinase gene from Streptococcus equisimilis in Bacillus subtilis J Basic Microbiol, 1986 26(2): p 75-81 34 Ko JH, DK Park, IIC Kim, SH Lee, and SM Byun, High level expression and secretion of streptokinase in Escherichia coli Biotechnol Lett 1995 17: p 10191024 35 Kubo M and A Nishi, Improved method for prourokinase refolding with inclusion body from recombinant Escherichia coli J Ferment Bioeng, 1995 80(6): p 622-624 36 Kumar R and J Singh, Expression and secretion of a prokaryotic protein streptokinase without glycosylation and degradation in Schizosaccharomyces pombe Yeast, 2004 21(16): p 1343-1358 37 Kunamneni A, TT Abdelghani, and P Ellaiah, Streptokinase the drug of choice for thrombolytic therapy J Thromb Thrombolysis, 2007 23: p 9-23 38 Kuppusamy M, VK Srinivas, S Lahiri, K Ella, and GS Khatri, Recombinant streptokinase, 2006, Bharat Biotech International, Ltd.: USA p 1-14 39 Lizano S and KH Johnston, Structural diversity of streptokinase and activation of human plasminogen Infect Immun, 2005 73(7): p 4451-4453 40 Malke H and JJ Ferretti, Streptokinase: cloning, expression and excretion by Escherichia coli Proc Natl Acad Sci USA, 1984 81: p 3557-3561 41 Mathers CD, T Boerma, and DM Fat, Global and regional causes of death Br Med Bull., 2009 92: p 7-32 42 Nikhil S and B Amit, A history of streptokinase use in acute myocardial infarction Tex Heart Inst J, 2007 34(3): p 318-27 43 Pratap J, G Rajamohan, and KL Dikshit, Characteristics of glycosylated streptokinase secreted from Pichia pastoris: enhanced resistance of SK to 49 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương proteolysis by glycosylation Appl Microbiol Biotechnol, 2000 53(4): p 469475 44 Pupo E, BA Baghbaderani, V Lugo, J Fernandez, R Paez, and I Torrens, Two streptokinase genes are expressed with different solubility in Escherichia coli W3110 Biotechnol Lett, 1999 21: p 1119-1123 45 Reddy KN, Streptokinase-biochemistry and clinical application Enzyme, 1988 40: p 79-89 46 Reza NM, MM Hossein, B Mohammad, and C Mahmood, Cloning and overexpression of active recombinant fusion streptokinase: A new approach to facilitate purification Pakistan J of Bio Sci, 2007 10(13): p 2146-2151 47 Sanger F, S Nicklen, and AR Coulson, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A, 1977 74(12): p 5463-7 48 Schmutzler R, F Heckner, P Kortge, J van der Loo, A Pezold, and H Poliwoda, Thrombolytic therapy of recent myocardial infarction I Introduction, plan of trial, general clinical results Ger Med Mon, 1966 11: p 308-14 49 Sherry S, A Titchener, L Gottesman, P Wasserman, and W Troll, The enzymatic dissolution of experimental arterial thrombi in the dog by trypsin, chymotrypsin and plasminogen activators J Clin Invest, 1954 33: p 1303-1313 50 Shi GY, BI Chang, SM Chen, DH Wu, and HL Wu, Function of streptokinase fragments in plasminogen activation Biochem J, 1994 304(1): p 235-241 51 Sikri N and A Bardia, A history of streptokinase use in acute myocardial infarction Tex Heart Inst J, 2007 34(3): p 318-327 52 Smith RAG, RJ Dupe, and J Green, Fibrinolysis with acyl-enzymes: a new approach to thrombolytic therapy Nature, 1981 290: p 505-508 53 Sriraman K and G Jayaraman, Enhancement of recombinant streptokinase production in Lactococcus lactis by suppression of acid tolerance response Appl Microbiol Biotechnol, 2006 72: p 1202-1209 50 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thương 54 Sumi H, H Hamada, and H Mihara, A novel strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese "natto" International J Thromb Thrombolysis, Amsterdam, 1988 2: p 67 55 Thomas A, Gaziano, A Bitton, S Anand, SA Gessel, and A Murphy, Growing epidemic of coronary heart disease in low- and middle- income countries Curr Probl Cardiol., 2010 35(2): p 72-115 56 Tillett W and S Sherry, The effect in patients of streptococcal fibrinolysin (streptokinase) and streptococcal desoxyribonuclease on fibrinous, purulent, and sanguinous pleural exudations Clin Invest J 1949 28: p 173-190 57 Tillett WS and RL Garner, The fibrinolytic activity of hemolytic streptococci J Exp Med, 1933 58: p 485–502 58 Tillett WS, AJ Johnson, and WR McCarty, The intravenous infusion of the streptococcal f ibrinolytic principle (streptokinase) into patients J Clin Invest, 1955 34: p 169-185 59 Tollefsen D, Blood coagulation http://tollefsen.wustl.edu/projects/ coagulation, 2009 60 Vellanki RN, R Potumarthi, and LN Mangamoori, Constitutive expression and optimization of nutrients for streptokinase production by Pichia pastoris using statistical methods Appl Biochem Biotechnol, 2009 158(1): p 25-40 61 Vermeer F, ML Simoons, FW Bar, JGv Tijssen, RT Domburg, PW Serruys, and e al., Which patients benef it most from early thrombolytic therapy with intracoronary streptokinase Circulation, 1986 74: p 1379-1389 62 Wakeham N, S Terzyan, P Zhai, LA Loy, J Tang, and XC Zhang, Effects of deletion of streptokinase residues 48-59 on plasminogen activation Protein Eng, 2002 15: p 753-761 63 Walley T, Y Dundar, R Hill, and R Dickson, Superiority and equivalence in thrombolytic drugs: an interpretation QJM, 2003 96(2): p 155-160 51 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ 64 Walter F, M Siegel, and H Malke, Nucleotide sequence of the streptokinase gene from a group-G Streptococcus Nucleic Acids Res, 1989 17(3): p 1261-1262 65 Wang X, J Tang, B Hunter, and XC Zhang, Crystal structure of streptokinase beta-domain FEBS Lett, 1999 459: p 85-89 66 Wong SL, R Ye, and S Nathoo, Engineering and production of streptokinase in a Bacillus subtilis expression-secretion system Appl Environ Microbiol, 1994 60(2): p 517-523 PHỤ LỤC Bảng Hàm lượng protein mẫu tinh Mẫu Độ pha loãng (lần) OD1 OD2 Chưa ts 0,516 0,52 1,070 ± 0,006 Dịch ts lần (cặn 1) 0,486 0,471 0,198 ± 0,004 Dịch ts lần (cặn 2) 0,453 0,451 0,188 ± 0,001 Dịch ts lần (cặn 3) 0,422 0,422 0,176 ± Dịch ts (cặn 4) 0,431 0,426 0,178 ± 0,001 OD (595 nm) HLPr tổng số mg/ml HLPr: Hàm lượng protein; ts: tinh Bảng Hoạt tính mSK-nonhis mẫu tinh Mẫu OD (405 nm) Độ pha lỗng (lần) OD1 OD2 Hoạt tính mSK-nonhis U/ml U/mg Chưa ts 100 0,384 0,381 1275 ± 1192 ± Dịch ts lần (cặn1) 100 0,342 0,332 1193 ± 14 6019 ± 65 Dịch ts lần (cặn2) 100 0,322 0,32 1164 ± 13 6205 ± 14 Dịch ts lần (cặn 3) 100 0,301 0,312 1138 ± 6480 ± 80 Dịch ts (cặn 4) 100 0,79 0,793 2015 ± 11308 ± 22 52 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Bảng Khả hoạt hóa mSK-nonhis xử lý guanidine chất hoạt hóa Độ pha lỗng (lần) OD (405 nm) Hoạt tính mSK-nonhis OD1 OD2 U/ml U/mg 200 0,222 0,236 1995 ± 36 11208 ± 201 Triton X-100 (0,5%) + 600 10% glycerol 0,891 0,901 13222 ± 77 74279 ± 431 Tween 20 (1%) 600 0,879 0,88 13043 ± 73273 ± 43 Tween 20 (1%) + 10% glycerol 800 0,833 0,871 16992 ± 389 95463 ± 2184 Tween 80 (1,5%) 300 0,827 0,881 6383 ± 207 35860 ± 1164 Tween 80 (1,5%) + 10% glycerol 600 0,755 0,768 11762 ± 100 66081 ± 560 Khơng chất hoạt hóa 100 0,825 0,868 2114 ± 55 11877 ± 309 Mẫu Triton X-100 (0,5%) Bảng Đường chuẩn SK Dịch SK (U/µl) Nồng độ phản ứng (U/ml) OD405nm 0,0075 7,5 0,103 0,01 10 0,22 0,0125 12,5 0,36 0,015 15 0,514 0,0175 17,5 0,651 0,02 20 0,782 53 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Bảng Hàm lượng băng protein dịch tế bào JMpEmSK Thứ tự giếng điện di Thứ tự băng protein Rf O,D, AmplOD IntOD Hàm lượng protein % Protein 1 0,066 0,262 0,084 0,677 0,06 0,12 0,091 0,196 0,008 0,09 0,00 0,00 0,121 0,311 0,11 1,863 0,20 0,42 0,142 0,291 0,076 0,831 0,06 0,13 0,154 0,284 0,064 0,799 0,05 0,10 0,176 0,325 0,09 1,784 0,16 0,33 0,22 0,262 0,015 42,017 0,63 1,29 0,25 0,318 0.083 42,017 3,49 7,14 0,323 1,047 0,834 42,017 35,04 71,79 10 0,4 0,489 0,304 7,728 2,35 4,81 11 0,425 0,484 0,306 8,282 2,53 5,19 12 0,466 0,288 0,122 4,045 0,49 1,01 13 0,492 0,238 0,08 4,045 0,32 0,66 14 0,543 0,244 0,096 2,398 0,23 0,47 15 0,565 0,191 0,045 2,398 0,11 0,22 16 0,618 0,387 0,246 7,024 1,73 3,54 17 0,661 0,21 0,073 1,454 0,11 0,22 18 0,702 0,278 0,144 8,605 1,24 2,54 Rf: khoảng cách từ điểm xuất phát đến vị trí băng protein O.D.: độ đậm AmplOD: độ rộng băng protein IntOD: độ đậm băng protein 54 Nguyễn Thị Thương Luận văn thạc sỹ Bảng Độ mSK-nonhis sau lần tinh Lần tinh Lần Lần Lần Lần Thứ tự giếng điện di Thứ tự băng protein Hàm lượng protein % Protein 0,059 0,308 0,169 2,254 0,381 1,51 2 0,068 0,315 0,176 3,761 0,662 2,62 0,128 0,204 0,072 0,606 0,044 0,17 0,149 0,155 0,026 0,266 0,007 0,03 0,166 0,155 0,028 0,223 0,006 0,02 0,19 0,17 0,045 0,627 0,028 0,11 0,304 0,344 0,23 27,126 6,239 24,72 0,336 0,727 0,611 27,126 16,574 65,67 0,471 0,21 0,085 1,513 0,129 0,51 10 0,502 0,207 0,08 1,238 0,099 0,39 11 0,521 0,224 0,096 1,504 0,144 0,57 12 0,547 0,196 0,067 1,211 0,081 0,32 13 0,741 0,241 0,1 1,817 0,182 0,72 14 0,987 0,877 0,261 2,545 0,664 2,63 0,297 0,253 0,144 14,714 2,119 22,26 0,331 0,623 0,496 14,714 7,298 76,67 3 0,728 0,193 0,052 1,956 0,102 1,07 0,289 0,183 0,051 1,878 0,606 8,65 0,317 0,668 0,505 11,878 5,998 85,68 0,443 0,241 0,073 3,612 0,397 5,67 0,302 0,785 0,61 21,861 13,335 97,88 0,459 0,256 0,068 1,302 0,089 0,65 0,471 0,262 0,074 2,714 0,201 1,47 Rf O,D, AmplOD IntOD 55