Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở Quảng Trị (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở Quảng Trị (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở Quảng Trị (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở Quảng Trị (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở Quảng Trị (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở Quảng Trị (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở Quảng Trị (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở Quảng Trị (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở Quảng Trị (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh thực vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng tiêu ở Quảng Trị (Luận văn thạc sĩ)

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - TRẦN THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG TIÊU Ở QUẢNG TRỊ Ngành : Sinh học Chuyên ngành : Động vật học Mã số : 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS PHẠM VIỆT CƯỜNG Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài luận văn thạc sĩ, bên cạnh nỗ lực cố gắng than có hướng dẫn nhiệt tình quý Thầy Cô, ủng hộ động viên gia đình bạn bè suốt thời gian học tập nghiên cứu thực luận văn thạc sĩ Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Việt Cường-Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, người hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận văn Đồng thời, tơi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS.Nguyễn Thị Kim Cúc anh chị em Phòng Cơng nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa Đô –Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến tồn thể q Thầy Cơ mơn Vi sinh vật học hết lòng truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập nghiên cứu tơi hồn thiện đề tài Cuối xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, người không ngừng động viên, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập thực luận văn Hà nội, ngày 30 tháng 09 năm 2014 Học viên Trần Thị Hồng MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU………………………………………………………………………….… Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………….…….3 1.1 Đặc điểm số vi nấm gây bệnh thực vật…………………………….… 1.1.1 Khái quát nấm gây bệnh…………… …………………………………… .3 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, chế gây bệnh biểu Fusarium oxysporum……………………………………………………………… .4 1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, chế gây bệnh biểu Fusarium solani .6 1.1.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, chế gây bệnh biểu Phytophthora spp……………………………………………………………………….6 1.2 Tổng quan tiêu………………………………………………………………8 1.3 Tình hình nghiên cứu loại vi sinh vật gây hại cho tiêu biện pháp phòng trừ ngồi nước ……………………………………………….9 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước……………………………………………… 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước………………………………………………14 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP……………………… 21 2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ…………………………21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………… 21 2.1.2 Vật liệu .21 2.1.3 Hóa chất thiết bị .21 2.2 PHƯƠNG PHÁP………………………………………………………………….24 2.2.1 Phương pháp phân lập làm vi sinh vật 24 2.2.1.1 Phương pháp phân lập làm nấm 24 2.2.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn xạ khuẩn đối kháng 24 2.2.2 Nuôi lưu giữ chủng vi sinh vật 24 2.2.3 Phương pháp nhuộm Gram 25 2.2.4 Phương pháp xác định khả ức chế nấm gây bệnh chủng nấm phân lập .26 2.2.5 Phương pháp đục lỗ xác định hoạt tính kháng sinh dịch nuôi 27 2.2.6 Phương pháp sinh học phân tử 27 2.2.6.1 Quy trình tách chiết ADN genom .27 2.2.6.2 Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phổ tử ngoại 28 2.2.6.3 Trình tự thông số cặp mồi sử dụng để tiến hành PCR .29 2.2.6.4 Kỹ thuật PCR 29 2.2.6.5 Điện di ADN gel agaroza .31 2.2.6.6 Xác định trình tự nucleotit gen .31 2.2.6.7 Xử lý trình tự ADN phân tích số liệu phần mềm máy tính 32 2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nguồn bệnh nấm thực vật số chủng tuyển chọn cà chua 32 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………….34 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM CĨ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG……………………………………………………………………………….34 3.1.1 Phân lập tuyển chọn nấm .34 3.1.2 Định danh chủng vi nấm phân lập 35 3.1.3 Đánh giá khả ức chế sinh trưởng nguồn bệnh nấm vi nấm phân lập…………………………………………………………………………… 39 3.2 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG………………………………………………………………… 42 3.2.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn .42 3.2.2 Tách dòng giải trình tự gen mã hố 16s rARN bốn chủng vi khuẩn nghiên cứu 47 3.2.2.1 Tách ADN genome từ vi khuẩn 48 3.2.2.2 Nhân gen 16S ADN riboxom .48 3.2.2.3 Giải trình tự gen chủng vi khuẩn nghiên cứu .49 3.3 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG 54 3.3.1 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn .54 3.3.2 Tách dòng giải trình tự 16S ARN chủng xạ khuẩn .55 3.3.2.1 Kết tách chiết ADN tổng số chủng xạ khuẩn XK3 XK28 .56 3.3.2.2 Kết nhân gen 16S-rARN PCR 57 3.3.2.3 Giải trình tự gen chủng xạ khuẩn nghiên cứu 57 3.4 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG NGUỒN BỆNH F.OXYSPORUM CỦA CÁC CHỦNG TUYỂN CHỌN TRÊN MƠ HÌNH CÂY CÀ CHUA .59 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………….64 4.1 KẾT LUẬN……………………………………………………………………….64 4.2 KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO……………………… 65 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN……………………… 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………….67 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT NCBI : National Center for Biotechnology Information BLAST : BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate EtBr : Ethidium bromide EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid SDS : Sodium dodecyl sulphate Bp, Kb : Base pair, Kilo base CFU : Colony forming units mRNA : Messenger RNA PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic acid RNase TAE Taq polymerase TE : Ribonuclease : Tris-Acetate-EDTA : Polymerase Thermus aquarius : Tris- EDTA PIMG : Percentage of inhibition of growth ĐC : Đối chứng cs : Cộng đtg : Đồng tác giả CSK : Chất kháng sinh CLĐ : Mẫu đất lấy từ huyện Cam Lộ- Quảng Trị CLR : Mẫu rễ lấy từ huyện Cam Lộ- Quảng Trị VLĐ : Mẫu đất lấy từ huyện Vĩnh Linh- Quảng Trị VLR : Mẫu rễ lấy từ huyện Vĩnh Linh- Quảng Trị PDA : Potato dextrose agar PSA : Potato sucrose agar DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Địa điểm thời gian lấy mẫu………………………………………… 21 Bảng 2.2: Trình tự thơng số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho Vi khuẩn…………………………………………………………………………… 29 Bảng 2.3: Trình tự thơng số cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA cho xạ khuẩn………………………………………………………………………… …29 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR cho vi khuẩn……………………………… 29 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR cho xạ khuẩn……………………………… 30 Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm………………………………………………………… 33 Bảng 3.1: Đặc điểm bào tử chủng nấm phân lập……………………………35 Bảng 3.2: Tỷ lệ ức chế nguồn bệnh vi nấm phân lập sau ngày nuôi 39 Bảng 3.3: Tỷ lệ ức chế nguồn bệnh vi nấm phân lập sau ngày nuôi 40 Bảng 3.4: Hình thái tế bào chủng đối kháng……………………………… 43 Bảng 3.5: Khả đối kháng số nguồn bệnh nấm chủng vi khuẩn… 44 Bảng 3.6: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nghiên cứu……………… 47 Bảng 3.7: Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN (µg/ml) chủng nghiên cứu…………………………………………………………………………….48 Bảng 3.8: Kết nhận dạng chủng vi sinh vật nghiên cứu sau so sánh BLAST……………………………………………………………………………….50 Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nghiên cứu môi trường ISP4………………………………………………………………………………… 54 Bảng 3.10: Khả kháng nấm kiểm định chủng xạ khuẩn 55 Bảng 3.11: Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN (µg/ml) chủng nghiên cứu 56 Bảng 3.12: Kết nhận dạng chủng xạ khuẩn nghiên cứu sau so sánh BLAST 57 Bảng 3.13: Ảnh hưởng chủng vi sinh vật tuyển chọn lên sinh trưởng cà chua……………………………………………………………………………… 60 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Triệu chứng tiêu bị nhiễm Phytopthora spp………………………… 16 Hình 1.2: Triệu chứng tiêu bị nhiễm Fusarium oxysporum…………………… 16 Hình 2.1: Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp…………………………………… 26 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc đặc trưng nấm sợi phân lập từ mẫu vật…… 34 Hình 3.2: Hình thái bào tử đặc trưng số chủng nấm sợi phân lập………….39 Hình 3.3: Khả đối kháng nấm P.oxalicum T.harzianum với nấm bệnh………………………………………………………………………………… 41 Hình 3.4: Khả đối kháng số vi khuẩn phân lập với nấm F.oxyporum… 45 Hình 3.5: Khả tồn môi trường MPA số chủng vi khuẩn đối kháng…………………………………………………………………………… 46 Hình 3.6: Điện di đồ DNA genom chủng nghiên cứu………………………48 Hình 3.7: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16 S-rRNA chủng nghiên cứu… 49 Hình 3.8: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐvk 30.1……………………………50 Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐvk 31.3……………………………51 Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐvk 31.6………………………… 51 Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại chủng CLRvk 31.8………………………… 52 Hình 3.12: Khả đối kháng hai chủng xạ khuẩn CLĐ XK3, VLĐ XK 28 với nấm F.solani F.oxysporum………………………………………………… 55 Hình 3.13: Ảnh điện di AND tổng số chủng xạ khuẩn……………………… 56 Hình 3.14: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S-rARN chủng xạ khuẩn…… 57 Hình 3.15: Cây phát sinh chủng loại chủng CLĐxk3……………………………… 58 Hình 3.16: Cây phát sinh chủng loại chủng VLĐ xk28…………………………… 58 Hình 3.17: Khả đối kháng F.oxysporum chủng CLĐ VK30.1, CLĐ XK3, VLĐ XK28………………………………………………….…61 10 MỞ ĐẦU Hàng năm, bệnh gây tổn thất to lớn cho nông nghiệp, chúng phá hủy loại nông sản chủ yếu, chiếm 12% tổng sản lượng nơng nghiệp Thế giới Đã có 11000 loại bệnh phát hiện, nguyên nhân khoảng 120 chi nấm, 30 loại virut chi vi khuẩn Thiệt hại nấm hại chiếm khoảng 80% tổng thiệt hại mùa màng, bệnh Fusarium, Phytophthora gây chiếm tỷ lệ tương đối lớn Đây tác nhân chủ yếu gây nên bệnh chết héo, tắc mạch dẫn thối rễ thối thân nhiều loại trồng : lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu, bông…[6] Nền nông nghiệp nước ta có vai trò quan trọng, khơng cung cấp lương thực, thực phẩm, mà tạo hàng hóa có giá trị xuất cao, đặc biệt công nghiệp như: tiêu, bông, cà phê…Tuy nhiên suất chất lượng trồng phải đối mặt với nhiều vấn đề khó khăn, đặc biệt bệnh trồng nấm gây Hiện nay, biện pháp hóa học sử dụng phổ biến xem hữu hiệu phòng trừ bệnh cho trồng Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học nơng nghiệp có thuốc trừ nấm ngày nhiều gây ảnh hưởng xấu đến môi trường làm giảm chất lượng sản phẩm dư lượng thuốc cao, chi phí phòng trị bệnh cao Ngoài ra, đất đai bạc màu, làm chết sinh vật có ích, làm tăng khả kháng thuốc sinh vật gây hại, kết việc sản xuất nơng nghiệp rơi vào tình trạng khó khăn Đặc biệt khu vực Miền Trung tiêu cà phê thường bị thối cổ rễ Fusarium oxysporum, F solani , Phytophthora số tác nhân khác [4], [5] Để góp phần khắc phục tồn này, nhà khoa học ý đến nguồn tài nguyên lớn thứ ba giới tự nhiên – Tài ngun vi sinh vật có ích để bảo vệ mơi trường sinh thái Phương pháp sử dụng vi sinh vật bảo vệ môi trường mang lại hiệu cao, an tồn, sản phẩm thu hoạch khơng ảnh hưởng tới người sử dụng, có lợi cho cân sinh thái, mà giảm phần lớn lượng thuốc hố học sử dụng ... chế sinh trưởng nguồn bệnh nấm vi nấm phân lập ………………………………………………………………………… 39 3.2 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG………………………………………………………………… 42 3.2.1 Phân lập. .. trưng số chủng nấm sợi phân lập ……….39 Hình 3.3: Khả đối kháng nấm P.oxalicum T.harzianum với nấm bệnh ……………………………………………………………………………… 41 Hình 3.4: Khả đối kháng số vi khuẩn phân lập với nấm F.oxyporum…... nguồn bệnh vi nấm phân lập sau ngày nuôi 39 Bảng 3.3: Tỷ lệ ức chế nguồn bệnh vi nấm phân lập sau ngày ni 40 Bảng 3.4: Hình thái tế bào chủng đối kháng …………………………… 43 Bảng 3.5: Khả đối kháng số