Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của lumbrokinase ở Pichia pastoris

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ BÍCH NGỌC BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA LUMBROKINASE Ở PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ BÍCH NGỌC BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA LUMBROKINASE Ở PICHIA PASTORIS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI PGS TS TRỊNH HỒNG THÁI Hà Nội - 2014 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Quyền Đình Thi- Trưởng phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme- Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, người thầy quan tâm, tận tình bảo, định hướng nghiên cứu hướng dẫn tơi suốt q trình công tác, học tập, tạo điều kiện để hồn thành tốt luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Trịnh Hồng Thái- Trưởng phòng Proteomic Sinh học cấu trúc- Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học quốc gia Hà Nội, người thầy tạo tảng cho từ ngày làm quen với sinh học thực nghiệm Thầy nhiệt tình hướng dẫn, bảo tơi q trình học tập trường, sửa chữa luận văn động viên thời gian nghiên cứu Để thực tốt luận văn này, xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, đặc biệt thầy cô giáo mơn Sinh lý Thực vật Hóa sinh học tận tình giảng dạy dìu dắt suốt thời gian học tập trường Trong trình học tập, làm việc thực luận văn, tơi nhận bảo nhiệt tình, giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm công việc sống TS Đỗ Thị Tuyên, TS Lý Thị Bích Thủy anh chị bạn học viên, sinh viên làm việc Phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme- Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên bên suốt thời gian qua Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Học viên Vũ Thị Bích Ngọc Vũ Thị Bích Ngọc i Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TẮC NGHẼN MẠCH MÁU 1.1.1 Sơ lƣợc bệnh tắc nghẽn mạch máu 1.1.2 Q trình đơng máu chế tan huyết khối 1.1.3 Một số thuốc điều trị tắc nghẽn mạch máu 1.2 KHÁI QUÁT VỀ ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN 1.2.1 Một số nguồn sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 1.2.2 Phân loại enzyme thủy phân fibrin 11 1.3 KHÁI QUÁT VỀ ENZYME LUMBROKINASE 12 1.3.1 Cấu trúc đặc tính lumbrokinase 12 1.3.2 Tình hình nghiên cứu lumbrokinase Việt Nam .15 1.3.3 Tình hình nghiên cứu lumbrokinase giới 16 1.4 HỆ BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS .19 1.4.1 Khái quát hệ biểu Pichia pastoris 19 1.4.2 Chuyển gen ngoại lai vào genome nấm men 22 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24 2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 24 2.1.1 Vật liệu .24 Vũ Thị Bích Ngọc ii Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Các dung dịch đệm 25 2.1.4 Môi trƣờng 26 2.1.5 Máy móc thiết bị 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Phƣơng pháp nuôi cấy 28 2.2.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu LK tái tổ hợp .29 2.2.3 Tinh protein tái tổ hợp 29 2.2.4 Tách fibrinogen 30 2.2.5 Xác định hoạt tính thủy phân fibrin 31 2.2.6 Xác định hàm lƣợng protein .32 2.2.7 Xác định yếu tố ảnh hƣởng lên hoạt tính độ bền enzyme 33 2.2.8 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 34 2.2.9 Phản ứng nối ghép gen ngoại lai 35 2.2.10 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli .35 2.2.11 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli .36 2.2.12 Điện di DNA gel agarose .36 2.2.13 Xử lí DNA plasmid enzyme cắt giới hạn 37 2.2.14 Tinh DNA gel agarose 37 2.2.15 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào nấm men phƣơng pháp xung điện .38 2.2.16 Tách chiết DNA tổng số nấm men 39 2.2.17 Điện di protein gel polyacrylamide ( SDS- PAGE) 40 2.2.18 Nhận dạng protein ngoại lai kĩ thuật MALDI- TOF (MS/ MS) (Matrix-assisted laser desorption ionization- Time of flight) 41 Vũ Thị Bích Ngọc iii Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học 2.2.19 Giải trình tự nucleotide 41 2.2.20 Xử lý số liệu 42 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 NHÂN DÒNG GEN MÃ HÓA LUMBROKINASE .43 3.1.1 Thiết kế vector tách dòng pJET1.2 blunt/lk (pJLK) .43 3.1.2 Thiết kế vector biểu pPICZαA/LK (pPLK) 46 3.2 BIỂU HIỆN LUMBROKINASE TRONG P PASTORIS X33 49 3.2.1 Tạo chủng P pastoris X33 mang gen lk 49 3.2.2 Sàng lọc dòng P pastoris X33/pPLK tái tổ hợp 51 3.2.3 Biểu P pastoris X33/pPLK tái tổ hợp 52 3.2.4 Tối ƣu môi trƣờng biểu 53 3.2.5 Tối ƣu nồng độ methanol 55 3.2.6 Tối ƣu thời gian biểu 56 3.3 TINH SẠCH rLK 56 3.4 ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA rLK .58 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính độ bền enzyme rLK .58 3.4.2 Ảnh hƣởng pH lên hoạt tính độ bền enzyme rLK .61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 PHỤ LỤC i Vũ Thị Bích Ngọc iv Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính thủy phân fibrin casein số protease 12 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2 Dung dịch sử dụng nghiên cứu .25 Bảng 2.3 Môi trƣờng sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.4 Các máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR với thể tích 25 µl 34 Bảng 2.6 Thành phần gel polyacrylamide 12,5% 40 Bảng 3.1 Hoạt tính rLK mơi trƣờng biểu khác 53 Bảng 3.2 Hiệu suất tinh rLK 58 Vũ Thị Bích Ngọc v Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Q trình hình thành cục máu đông mạch máu Hình 1.2 Vai trị antiplasmin (chất ức chế plasmin) Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa plasminogen Hình 1.4 Cấu trúc bậc lumbrokinase tách chiết từ loài giun đất 14 Hình 1.5 Cơ chế hoạt động lumbrokinase 15 Hình 1.6 Con đƣờng chuyển hóa methanol P pastoris 21 Hình 1.8 Hiện tƣợng tích hợp gen ngoại lai vào vị trí 5’AOX1 aox1::ARG4 genome nấm men P pastoris .23 Hình 2.1 Đƣờng chuẩn plasmin (Sigma) 32 Hình 2.2 Đƣờng chuẩn BSA (Sigma) 32 Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm PCR 43 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm tách plasmid pJLK, sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pJLK với XbaI XhoI 44 Hình 3.3 Trình tự vector tách dịng pJLK 45 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm tinh vector pPICZαA gen lk , sản phẩm tách plasmid pPLK , sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme EcoRI XbaI 47 Hình 3.5 Trình tự vector biểu pPLKvà trình tự amino acid tƣơng ứng 48 Hình 3.6 Điện di đồ tinh sản phẩm cắt plasmid pPLK với enzyme SacI 49 Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm tách DNA nấm men, sản phẩm PCR gen nấm men P pastoris X33 50 Hình 3.8 Đĩa thử hoạt tính thủy phân fibrin dịch thu từ dòng P pastoris X33/ pPLK tái tổ hợp 52 Hình 3.9 Điện di đồ protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp 53 Hình 3.10 Điện di đồ protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch tối ƣu môi trƣờng biểu X33/pPLK 54 Vũ Thị Bích Ngọc vi Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Hình 3.11 Ảnh hƣởng nồng độ MeOH cảm ứng lên mức độ biểu rLK 55 Hình 3.12 Tối ƣu thời gian biểu rLK 56 Hình 3.13 Điện di đồ sản phẩm tinh rLK .57 Hình 3.14 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rLK .60 Hình 3.15 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến độ bền enzyme rLK 61 Hình 3.16 Ảnh hƣởng pH lên hoạt tính enzyme rLK 62 Hình 3.17 Ảnh hƣởng pH lên độ bền enzyme rLK 63 Vũ Thị Bích Ngọc vii Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ 2D- PAGE Two dimention - polyacrylamide gel electrophoresis (Điện di hai chiều gel polyacrylamide) APS Ammonium persulfate ARN Acid ribonucleic BLAST Basic local alignment search tool (Cơng cụ tìm kiếm liên kết định vị bản) BSA Bovine serum albumin (albumin huyết bò) Bp Base pairs (Cặp bazo) cs Cộng cDNA Complement DNA DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2’ Deoxynucleoside 5’ triphosphate ĐC Đối chứng EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide kb Kilo base kDa Kilo dalton M Marker (Thang chuẩn) MALDI- TOF Matrix- assisted laser desorption/ionization- time of flight (ion hóa mẫu hấp thụ dựa chất lƣợng laser- thời gian bay ) Vũ Thị Bích Ngọc K20 viii Cao học Luận văn thạc sĩ 38 Khoa Sinh học Kim, W., K Choi, et al (1996), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang”, Applied and environmental microbiology, 62 (7), pp 2482-2488 39 Kodama, S., M Tsujimoto, N Tsuruoka, T Sugo, T Endo, and A Kobata (1993), “Role of sugar chains in the in-vitro activity of recombinant human interleukin 5”, European journal of biochemistry / FEBS, 211 (3), pp 903-908 40 Kotb, E (2014), “The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombin”, Biotechnology progress 41 Koutz, P., G.R Davis, C Stillman, K Barringer, J Cregg, and G Thill (1989), “Structural comparison of the Pichia pastoris alcohol oxidase genes”, Yeast, (3), pp 167-177 42 Kunamneni, A., T.T Abdelghani, and P Ellaiah (2007), “Streptokinase-the drug of choice for thrombolytic therapy”, Journal of thrombosis and thrombolysis, 23 (1), pp 9-23 43 Laemmli, U.K (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227 (5259), pp 680-685 44 Lee, S.G., H.Y Koh, et al (2010), “Expression of recombinant endochitinase from the Antarctic bacterium, Sanguibacter antarcticus KOPRI 21702 in Pichia pastoris by codon optimization”, Protein expression and purification, 71 (1), pp 108-114 45 Liu, X.H and F Ge (2002), “Factors influencing the activity of fibrinolytic enzymes from earthworm, Eisenia fetida”, Zhongguo Zhong yao za zhi, 27 (6), pp 423-426 46 Mahendra Kumar Verma and K Pulicherla (2011), “Lumbrokinase - A potent and stable fibrin- specific plasminogen activator ”, International Journal of Bioscience and Biotechnology, (2), pp 57-70 47 Mihara, H., H Sumi, et al (1991), “A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rubellus”, The Japanese journal of physiology, 41 (3), pp 461-472 Vũ Thị Bích Ngọc 69 Cao học K20 Luận văn thạc sĩ 48 Khoa Sinh học Mousa, S.A (2010), “Antithrombotic effects of naturally derived products on coagulation and platelet function”, Methods Mol Biol, 663, pp 229-240 49 Nakajima, N., K Ishihara, M Sugimoto, H Sumi, K Mikuni, and H Hamada (1996), “Chemical modification of earthworm fibrinolytic enzyme with human serum albumin fragment and characterization of the protease as a therapeutic enzyme”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 60 (2), pp 293-300 50 Nakajima, N., H Mihara, and H Sumi (1993), “Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 57 (10), pp 1726-1730 51 Park, Y., E Ryu, et al (1999), “Characterization of antithrombotic activity of lumbrokinase-immobilized polyurethane valves in the total artificial heart”, Artificial organs, 23 (2), pp 210-214 52 Resch, K.L and E Ernst (1995), “Garlic (Allium sativum)-a potent medicinal plant”, Fortschritte der Medizin, 113 (20-21), pp 311-315 53 Sanger, F., G.M Air, et al (1977), “Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA”, Nature, 265 (5596), pp 687-695 54 Scorer, C.A., R.G Buckholz, J.J Clare, and M.A Romanos (1993), “The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, Gene, 136 (1-2), pp 111-119 55 Sikri, N and A Bardia (2007), “A history of streptokinase use in acute myocardial infarction”, Texas Heart Institute journal, 34 (3), pp 318-327 56 Sumi, H., H Hamada, H Tsushima, H Mihara, and H Muraki (1987), “A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet”, Experientia, 43 (10), pp 1110-1111 57 Sumi, H., N Nakajima, and H Mihara (1993), “A very stable and potent fibrinolytic enzyme found in earthworm Lumbricus rubellus autolysate”, Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 106 (3), pp 763-766 Vũ Thị Bích Ngọc 70 Cao học K20 Luận văn thạc sĩ 58 Khoa Sinh học Sun, H.L., J.D Jiao, Z.W Pan, D.L Dong, and B.F Yang (2006), “The cardioprotective effect and mechanism of lumbrokinase”, Yao xue xue bao, 41 (3), pp 247-251 59 Tai, M.W and B.V Sweet (2006), “Nattokinase for prevention of thrombosis”, American journal of health-system pharmacy, 63 (12), pp 1121-1123 60 Tang, Y., T Jiang, et al (2003), “Multi-isomorphous replacement phasing of the earthworm fibrinolytic enzyme component A from Eisenia fetida”, Science in China Series C, Life sciences / Chinese Academy of Sciences, 46 (3), pp 263-272 61 Terashima, M., A Kubo, M Suzawa, Y Itoh, and S Katoh (1994), “The roles of the N-linked carbohydrate chain of rice alpha-amylase in thermostability and enzyme kinetics”, European journal of biochemistry / FEBS, 226 (1), pp 249254 62 Tschopp, J.F., P.F Brust, J.M Cregg, C.A Stillman, and T.R Gingeras (1987), “Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris”, Nucleic acids research, 15 (9), pp 3859-3876 63 Wang, Q.Q., J.S Chen, X.X Liang, P.X Qiu, Y.W Wang, and G.M Yan (2004), “Hemorrhagic activity and mechanism of FIIa, a fibrinolytic enzyme from Agkistrodon acutus venom”, Acta pharmacologica Sinica, 25 (4), pp 514-521 64 Wolf, M and K Ransberger (1972), Enzyme therapy, Vantage Press., New York 65 Xu, Z.R., Y.M Yang, Q.F Gui, L.N Zhang, and L Hu (2010), “Expression, purification, and characterization of recombinant lumbrokinase PI239 in Escherichia coli”, Protein expression and purification, 69 (2), pp 198-203 66 Yan, X.M., C.H Kim, C.K Lee, J.S Shin, I.H Cho, and U.D Sohn (2010), “Intestinal absorption of fibrinolytic and proteolytic lumbrokinase extracted from earthworm, Eisenia andrei”, The Korean journal of physiology & pharmacology : official journal of the Korean Physiological Society and the Korean Society of Pharmacology, 14 (2), pp 71-75 Vũ Thị Bích Ngọc 71 Cao học K20 Luận văn thạc sĩ 67 Khoa Sinh học Yuan, X., C Cao, Y Shan, Z Zhao, J Chen, and Y Cong (2006), “Expression and characterization of earthworm Eisenia fetida lumbrokinase-3 in Pichia pastoris”, Preparative biochemistry & biotechnology, 36 (3), pp 273-279 68 Zhao, M.M., M Li, Z.L Han, M Wang, and L.X Du (2006), “Cloning and expression of lumbrokinase gene in Pichia pastoris”, Wei Sheng Wu Xue Bao, 46 (4), pp 581- Vũ Thị Bích Ngọc 72 Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học PHỤ LỤC Bảng P1 Tối ƣu nồng độ chất cảm ứng methanol Nồng độ Methanol (%) OD (600 nm) Hoạt tính riêng rLK (UI/mg) Hoạt tính tƣơng đối (%) 0,525 ± 0,034 0 0,5 9,742 ± 0,073 2,548 ± 0,018 100 13,35 ± 0,015 2,962 ± 0,003 116 1,5 9,420 ± 0,014 2,847 ± 0,027 111 7,460 ± 0,054 2,066 ± 0,024 81 Bảng P2 Tối ƣu thời gian biểu Thời gian biểu (giờ) OD (600 nm) Hoạt tính riêng rLK (UI/mg) Hoạt tính tƣơng đối (%) 0,56 ± 0,013 0 24 4,42 ± 0,023 0,372 ± 0,013 13 48 6,46 ± 0,006 0,747 ± 0,007 25 72 12,38 ± 0,027 1,605 ± 0,025 55 96 13,59 ± 0,017 2,940 ± 0,017 100 120 11,67 ± 0,035 2,460 ± 0,009 84 144 10,28 ± 0,043 1,033 ± 0,005 35 Bảng P3 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu rLK Nhiệt độ (0C) Hoạt tính LK (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg) Hoạt tính tƣơng đối (%) 20 0,234 2,040 57 25 0,247 2,148 60 30 0,354 3,078 86 37 0,412 3,580 100 40 0,412 3,580 100 Vũ Thị Bích Ngọc i Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học 45 0,370 3,222 90 50 0,337 2,936 82 55 0,337 2,936 82 60 0,296 2,577 72 Bảng P4 pH phản ứng tối ƣu rLK pH Hoạt tính LK (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg) Hoạt tính tƣơng đối (%) 0,163 1,511 40 3,5 0,163 1,511 40 0,183 1,701 45 4,5 0,212 1,964 52 0,244 2,266 60 5,5 0,253 2,341 62 0,285 2,644 70 6,5 0,343 3,172 84 0,408 3,777 100 7,5 0,408 3,777 100 0,408 3,777 100 8,5 0,367 3,4 90 0,244 2,266 60 9,5 0,212 1,964 52 10 0,179 1,662 44 10,5 0,061 0,566 15 11 0,024 0,226 Vũ Thị Bích Ngọc ii Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Bảng P5 Đặc điểm câu trúc chức pPICZαA STT Thành phần cấu trúc Đặc điểm Vai trò 01 Promoter 5’ AOX1 Kích thƣớc 942 bp, promoter đƣợc cảm ứng MeOH cho phép biểu mức cao gen ngoại lai 02 Trình tự tín hiệu tiết yếu tố α Cho phép tiết hiệu protein ngoại lai 03 Vị trí đa điểm ( MCS) Cho phép chèn gen lạ vào vector biểu 04 c-myc epitope ( Glu- Gln- Lys- Cho phép phát protein họp tái tổ hợp Leu- Ile- Ser- Glu- Glu- Asp- với kháng thể kháng myc hay kháng thể kháng 05 Leu) myc- HRP Đuôi polyhistidine ( 6X) đầu C Cho phép tinh protein hợp tái tổ hợp sắc kí lực với ion kim loại có lực cao với histidine Cho phép phát protein hợp tái tổ hợp với kháng thể kháng his đầu C hay kháng thể kháng his đầu C- HRP 06 Vùng kết thúc phiên mã AOX1 Kết thúc phiên mã tín hiệu polyadeninyl hóa ( AOX1 TT) từ gen AOX1, cho phép chế biến 3’ mRNA hiệu bao gồm polyadenyl hóa tăng ổn định mRNA 07 Promoter TEF1 Promoter cho phép biểu gen kháng Zeocin Pichia 08 Promoter EM7 Promoter điều khiển biểu gen kháng Zeocin E.coli 09 Gen kháng Zeocin Cho phép chọn lọc chủng biến nạp mang vector E coli P pastoris 10 Vùng kết thúc phiên mã CYC1 Vũ Thị Bích Ngọc Cho phép chế biến hiệu đầu 3’ mRNA iii Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học gen kháng Zeocin để tăng tính ổn đinh mRNA 11 Tâm tái pUC Cho phép nhân lên bảo tồn plasmid E coli Vũ Thị Bích Ngọc iv Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học Hình P1 Cấu tạo vị trí đa điểm ( MCS) vector pPICZαA Vũ Thị Bích Ngọc v Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Bích Ngọc Khoa Sinh học vi Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Bích Ngọc Khoa Sinh học vii Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học SEQ ID No: 714 bp ADN Eisenia fetida (AF304199) ATTGTCGGAGGAATTGAAGCCAGACCATACGAGTTCCCATGGCAGGTGTCCGT CCGAAGGAAGTCTTCCGATTCCCATTTCTGCGGAGGTAGCATCATCAACGATC GTTGGGTTGTCTGCGCTGCTCACTGCATGCAGGGAGAGAGCCCTGCCCTGGTTT CATTGGTCGTCGGTGAGCACGATAGCAGCGCTGCGAGTACAGTACGTCAGACT CATGACGTTGACAGCATCTTCGTCCACGAGGACTACAACGGAAATACCTTTGA GAACGACGTTTCTGTCATCAAGACAGTTAACGCCATCGCCATCGACATCAACG ATGGGCCAATCTGCGCTCCAGATCCAGCCAACGATTACGTCTACCGTAAGAGC CAGTGCTCCGGATGGGGAACTATCAACTCAGGTGGAGTCTGCTGCCCCAACGT TCTGCGATATGTGACACTGAACGTCACAACCAACGCCTTCTGCGATGATATCTA CAGCCCATTATATACAATTACCAGCGACATGATCTGCGCCACGGACAACACCG GACAGAACGAGAGAGACTCTTGCCAGGGTGACTCTGGCGGCCCTCTGAGCGTC AAGGATGGCAACGGAATCTTCAGCCTCATTGGTATTGTGTCTTGGGGAATCGG TTGCGCATCTGGCTATCCAGGAGTCTACGCCCGCGTCGGATCCCAAACTGGAT GGATCACAGACATTATTACCAACAAC SEQ ID No: 849 bp ADN P pastoris X33 ATGCTTCTTTTGGCACTTGCTTCTTTGGTCGCAGTCGGTTTCGCCCAGCCTCCAG TTTGGTATCCAGGTGGTCAATGTTCTGTCTCCCAATACAGTGATGCAGGTGACA TGGAATTGCCACCTGGAACTAAGATCGTTGGTGGAATTGAAGCTAGACCATAC GAATTTCCTTGGCAGGTTTCAGTCAGAAGAAAATCTTCCGATAGTCATTTCTGT GGTGGATCTATTATCAACGACAGATGGGTTGTCTGTGCTGCCCACTGTATGCAA GGAGAATCACCAGCTTTGGTCAGTCTTGTTGTCGGAGAGCATGATTCAAGTGC AGCTTCCACTGTTAGACAGACACATGATGTTGATTCAATCTTCGTTCACGAAGA TTACAACGGTAATACCTTCGAGAACGACGTTTCCGTCATCAAGACTGTTAACG CCATTGCAATCGATATTAATGACGGTCCTATTTGTGCTCCAGATCCTGCCAATG ACTACGTTTATAGAAAATCTCAATGCTCCGGTTGGGGAACAATTAACTCTGGT GGAGTTTGTTGCCCAAATGTTTTGAGATATGTCACTCTTAACGTTACTACAAAT Vũ Thị Bích Ngọc K20 viii Cao học Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học GCCTTTTGTGATGACATCTACAGTCCTTTGTATACCATCACTTCTGATATGATTT GTGCTACAGACAACACCGGTCAAAATGAGAGAGATTCTTGCCAGGGAGACTCC GGTGGACCATTGTCAGTCAAGGATGGTAATGGAATCTTCTCCCTTATCGGTATT GTTTCATGGGGTATTGGATGTGCTTCTGGATACCCTGGAGTTTACGCAAGAGTC GGAAGTCAGACAGGTTGGATTACAGACATTATTACTAACAAT Vũ Thị Bích Ngọc ix Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Bích Ngọc Khoa Sinh học x Cao học K20 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Bích Ngọc Khoa Sinh học xi Cao học K20