Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của lumbrokinase ở pichia pastoris

Biểu hiện, tinh đánh giá tính chất lumbrokinase Pichia pastoris Vũ Thị Bích Ngọc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số Người hướng dẫn: TS Quyền Đình Thi; PGS TS Trịnh Hồng Thái Năm bảo vệ: 2014 Keywords Sinh học; Sinh học thực nghiệm; Lumbrokinase; Pichia pastoris Content MỞ ĐẦU Bê ̣nh tim ma ̣ch mô ̣t những nguyên nhân gây t vong cao nhấ t toàn th ế giới Theo tổ chức Y tế giới (WHO), hàng năm có khoảng 17 triệu người chết bệnh tim mạch, dự tính lên tới 23,3 triệu người vào năm 2030 Trên 80% ca tử vong xảy nước có thu nhập thấp trung bình, điển hình nước phát triển vùng Nam Á Đông Nam Á, nơi bệnh tim mạch gia tăng với tốc độ công nghiệp hóa, đô thị hóa thay đổi lối sống [64] Tại Việt Nam, theo thống kê Viện tim mạch, tỷ lệ người dân mắc bệnh tim mạch đột quỵ khoảng 16% dân số Có nhiều nguyên nhân dẫn tới rối loạn tim mạch mạch máu não như: chứng tràn máu não, tăng huyết áp, xơ cứng động mạch,….[34] Trong tổng số bệnh nhân bị tai biến mạch máu não có đến 24% tử vong, 50% sống bị di chứng nặng nhẹ, có 26% số bệnh nhân sống làm việc bình thường Nguyên nhân chủ yếu xuất cục máu đông gây tắc mạch cản trở lưu thông máu Do đó, việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng việc điều trị bệnh Vào khoảng năm 90, nhà nghiên cứu Nhật Bản phát enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, bao gồm izozyme đặt tên chung lumbrokinase (LK) [47,50] Về phương diện lâm sàng, LK xem thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng làm thuốc uống có thể đươ ̣c h ấp thu từ ruột vào máu hoạt hóa hệ thống fibrin nội sinh [66] Mô ̣t ưu điể m lớn của lumbrokinase so với các thuố c ều trị bệnh tắc nghẽn mạch thông du ̣ng khác - thường đươ ̣c sử du ̣ng làm thuố c tiêm (như tPA (tissue type plasminogen activator), urokinase và streptokinase) [40,42] tác dụng phụ, không gây chảy máu hệ thống, giá thành rẻ Hiện nay, hầ u hế t các thu ốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu có mă ̣t Việt nam ph ải nhập từ nước và có giá thành cao Vì vậy, năm gần đây, nghiên cứu sản xuấ t y ếu tố chống tắc nghẽn mạch máu dạng tự nhiên tái tổ hợp bắt đầu quan tâm ở nước Trong số đó , LK nhâ ̣n đươ ̣c rấ t nhiề u quan tâm của các nhà khoa ho ̣c những ưu điể m nổ i bâ ̣t của nó Tuy nhiên, nghiên cứu m ới dừng lại mức độ tinh sạch, đánh giá tính chất lý hóa LK từ giun đất và tách dòng gen mã hóa LK , hiê ̣n chưa có công b ố nghiên cứu sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp để làm thuốc Nhằ m góp phầ n vào viê ̣c ̣ giá thành sản phẩ m và chủ đô ̣ng nguồ n nguyên liê ̣u để sản xuất lumbrokinase , đề tài KC 04.01/11-15 (2012-2014) “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp làm thuốc phòng chống tắc nghẽn mạch máu’’ PGS.TS Quyề n Điǹ h Thi làm chủ nhiê ̣m đã đ ề xuất xây dựng quy trình công nghệ tạo dòng tế bào sản xuất LK tái tổ hơ ̣p Trong khuôn khổ đề tài này , tiến hành nghiên cứu “Biểu hiện, tinh đánh giá tính chất lumbrokinase Pichia pastoris”, nhằm tiến tới xây dựng quy trình công nghệ tạo dòng tế bào sản xuất LK tái tổ hợp dùng làm nguyên liệu thuốc xây dựng quy trình công nghệ ổn định sản xuất LK tái tổ hợp Với đề tài trên, luận văn tập trung giải vấn đề sau: Sử dụng công nghệ gen công nghệ protein để biểu tinh enzyme lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin 2 Nghiên cứu số tính chất enzyme LK tái tổ hợp tinh Reference TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Phạm Thị Minh Đức (2007), Sinh lý học, NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Thế Khánh Phạm Tử Dương (1997), “Xét nghiệm sử dụng lâm sàng”, NXB Y học, Hà Nội Bùi Phương Linh, Đỗ Thị Tuyên Quyền Đình Thi (2013), “Nhân dòng biểu gen mã hóa LK từ giun đất L rubellus E coli ”, Hội nghị khoa học CNSH Toàn quốc Nxb Khoa học Công nghệ, Hà Nội, tr 128-132 Lý Thị Bích Thủy, Đỗ Thị Tuyên Nguyễn Thị Ngọc Dao (2006), “Tinh xác định số tính chất enzym thuỷ phân fibrin tách chiết từ loài trùn quế Perionyx excavatus”, Tạp chí Sinh học, 28 (3), tr 77-82 Lê Văn Triển (1995), Khu hệ giun đất miền Đông Bắc Việt Nam, Luận án Tiến sĩ sinh học, Viện Sinh thái tài nguyên sinh vật, Hà Nội Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn Phạm Thị Ánh Hồng (2008), “Khảo sát đặc điểm serine- protease từ trùng quế Perionyx excavatus”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm, tr 123-127 Tài liệu tiếng Anh Ambrus, C.M., N Back, and J.L Ambrus (1962), “On the mechanism of thrombolysis by plasmin”, Circulation research, 10, pp 161-165 8 Andrianova, I.V., V.G Ionova, et al (2001), “Use of allikor for the normalization of fibrinolysis and hemostasis in patients with chronic cerebrovascular diseases”, Klinicheskaia meditsina, 79 (11), pp 55-58 Astrup, T and S Mullertz (1952), “The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity”, Archives of biochemistry and biophysics, 40 (2), pp 346-351 10 Bassam, B.J., G Caetano-Anolles, and P.M Gresshoff (1991), “Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels”, Analytical biochemistry, 196 (1), pp 8083 11 Bradford, M.M (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Analytical biochemistry, 72, pp 248-254 12 Cho, I.H., E.S Choi, H.G Lim, and H.H Lee (2004), “Purification and characterization of six fibrinolytic serine-proteases from earthworm Lumbricus rubellus”, Journal of biochemistry and molecular biology, 37 (2), pp 199-205 13 Choi, H.S and Y.S Sa (2001), “Fibrinolytic and antithrombotic protease from Spirodela polyrhiza”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 65 (4), pp 781-786 14 Coll-Sangrona, E and C.L Arocha-Pinango (1998), “Fibrinolytic action on fresh human clots of whole body extracts and two semipurified fractions from Lonomia achelous caterpillar”, Brazilian journal of medical and biological research, 31 (6), pp 779-784 15 Craven, L.L (1950), “Acetylsalicylic acid, possible preventive of coronary thrombosis”, Annals of western medicine and surgery, (2), pp 95 16 Cregg, J.M., K.R Madden, K.J Barringer, G.P Thill, and C.A Stillman (1989), “Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris”, Molecular and cellular biology, (3), pp 1316-1323 17 Daly, R and M.T Hearn (2005), “Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production”, Journal of molecular recognition : JMR, 18 (2), pp 119-138 18 Dametto, M., A.P David, et al (2000), “Purification and characterization of a trypsin-like enzyme with fibrinolytic activity present in the abdomen of horn fly, Haematobia irritans irritans (Diptera: Muscidae)”, Journal of protein chemistry, 19 (6), pp 515-521 19 Dong, G.Q., X.L Yuan, Y.J Shan, Z.H Zhao, J.P Chen, and Y.W Cong (2004), “Molecular cloning and characterization of cDNA encoding fibrinolytic enzyme-3 from earthworm Eisenia fetida”, Acta biochimica et biophysica Sinica, 36 (4), pp 303-308 20 Ellis, S.B., P.F Brust, P.J Koutz, A.F Waters, M.M Harpold, and T.R Gingeras (1985), “Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable genes from the yeast Pichia pastoris”, Molecular and cellular biology, (5), pp 1111-1121 21 Fan, Q., C Wu, L Li, R Fan, Q Hou, and R He (2001), “Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic enzyme III-1 from Lumbricus rubellus”, Biochimica et biophysica acta, 1526 (3), pp 286-292 22 Francis, C.W and V.J Marder (1991), “Fibrinolytic therapy for venous thrombosis”, Progress in cardiovascular diseases, 34 (3), pp 193-204 23 Garcia Gomez, L.J and F.J Sanchez-Muniz (2000), “Review: cardiovascular effect of garlic (Allium sativum)”, Archivos latinoamericanos de nutricion, 50 (3), pp 219-229 24 Ge, T., S.H Fu, et al (2007), “High density fermentation and activity of a recombinant lumbrokinase (PI239) from Pichia pastoris”, Protein expression and purification, 52 (1), pp 1-7 25 Ge, T., Z.J Sun, S.H Fu, and G.D Liang (2005), “Cloning of thrombolytic enzyme (lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris”, Protein expression and purification, 42 (1), pp 20-28 26 Grinna, L.S and J.F Tschopp (1989), “Size distribution and general structural features of N-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast, Pichia pastoris”, Yeast, (2), pp 107-115 27 Heyman, S.N., Z Hanna, et al (2004), “The fibrinolytic system attenuates vascular tone: effects of tissue plasminogen activator (tPA) and aminocaproic acid on renal microcirculation”, British journal of pharmacology, 141 (6), pp 971-978 28 Hu, R., S Zhang, H Liang, N Li, and C Tu (2004), “Codon optimization, expression, and characterization of recombinant lumbrokinase in goat milk”, Protein expression and purification, 37 (1), pp 83-88 29 Hu, Y., X.L Meng, J.P Xu, W Lu, and J Wang (2005), “Cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme PM(246) in Pichia pastoris”, Protein expression and purification, 43 (1), pp 18-25 30 Hwang, C.M., D.I Kim, et al (2002), “In vivo evaluation of lumbrokinase, a fibrinolytic enzyme extracted from Lumbricus rubellus, in a prosthetic vascular graft”, The Journal of cardiovascular surgery, 43 (6), pp 891-894 31 Ichinose, A., K Takio, and K Fujikawa (1986), “Localization of the binding site of tissue-type plasminogen activator to fibrin”, The Journal of clinical investigation, 78 (1), pp 163-169 32 Invitrogen, Pichia expression kit: A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia pastoris 33 Invitrogen, pPICZα A, B and C Pichia expression vectors for selection on Zeocin and purification of secreted, recombinant proteins 34 Irving Innerfield (1960), Enzyme in clinical medicine, McGraw- Hill, New York 35 Jin, L., H Jin, G Zhang, and G Xu (2000), “Changes in coagulation and tissue plasminogen activator after the treatment of cerebral infarction with lumbrokinase”, Clinical hemorheology and microcirculation, 23 (2-4), pp 213-218 36 Kanai, T., N Ueki, et al (1997), “Recombinant thermostable cycloinulo- oligosaccharide fructanotransferase produced by Saccharomyces cerevisiae”, Applied and environmental microbiology, 63 (12), pp 4956-4960 37 Kim, C.H., H.I Choi, and D.S Lee (1993), “Purification and biochemical properties of an alkaline pullulanase from alkalophilic Bacillus sp S-1”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 57 (10), pp 1632-1637 38 Kim, W., K Choi, et al (1996), “Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang”, Applied and environmental microbiology, 62 (7), pp 2482-2488 39 Kodama, S., M Tsujimoto, N Tsuruoka, T Sugo, T Endo, and A Kobata (1993), “Role of sugar chains in the in-vitro activity of recombinant human interleukin 5”, European journal of biochemistry / FEBS, 211 (3), pp 903-908 40 Kotb, E (2014), “The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombin”, Biotechnology progress 41 Koutz, P., G.R Davis, C Stillman, K Barringer, J Cregg, and G Thill (1989), “Structural comparison of the Pichia pastoris alcohol oxidase genes”, Yeast, (3), pp 167177 42 Kunamneni, A., T.T Abdelghani, and P Ellaiah (2007), “Streptokinase-the drug of choice for thrombolytic therapy”, Journal of thrombosis and thrombolysis, 23 (1), pp 923 43 Laemmli, U.K (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227 (5259), pp 680-685 44 Lee, S.G., H.Y Koh, et al (2010), “Expression of recombinant endochitinase from the Antarctic bacterium, Sanguibacter antarcticus KOPRI 21702 in Pichia pastoris by codon optimization”, Protein expression and purification, 71 (1), pp 108-114 45 Liu, X.H and F Ge (2002), “Factors influencing the activity of fibrinolytic enzymes from earthworm, Eisenia fetida”, Zhongguo Zhong yao za zhi, 27 (6), pp 423426 46 Mahendra Kumar Verma and K Pulicherla (2011), “Lumbrokinase - A potent and stable fibrin- specific plasminogen activator ”, International Journal of Bioscience and Biotechnology, (2), pp 57-70 47 Mihara, H., H Sumi, et al (1991), “A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rubellus”, The Japanese journal of physiology, 41 (3), pp 461-472 48 Mousa, S.A (2010), “Antithrombotic effects of naturally derived products on coagulation and platelet function”, Methods Mol Biol, 663, pp 229-240 49 Nakajima, N., K Ishihara, M Sugimoto, H Sumi, K Mikuni, and H Hamada (1996), “Chemical modification of earthworm fibrinolytic enzyme with human serum albumin fragment and characterization of the protease as a therapeutic enzyme”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 60 (2), pp 293-300 50 Nakajima, N., H Mihara, and H Sumi (1993), “Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 57 (10), pp 1726-1730 51 Park, Y., E Ryu, et al (1999), “Characterization of antithrombotic activity of lumbrokinase-immobilized polyurethane valves in the total artificial heart”, Artificial organs, 23 (2), pp 210-214 52 Resch, K.L and E Ernst (1995), “Garlic (Allium sativum)-a potent medicinal plant”, Fortschritte der Medizin, 113 (20-21), pp 311-315 53 Sanger, F., G.M Air, et al (1977), “Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA”, Nature, 265 (5596), pp 687-695 54 Scorer, C.A., R.G Buckholz, J.J Clare, and M.A Romanos (1993), “The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, Gene, 136 (1-2), pp 111-119 55 Sikri, N and A Bardia (2007), “A history of streptokinase use in acute myocardial infarction”, Texas Heart Institute journal, 34 (3), pp 318-327 56 Sumi, H., H Hamada, H Tsushima, H Mihara, and H Muraki (1987), “A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet”, Experientia, 43 (10), pp 1110-1111 57 Sumi, H., N Nakajima, and H Mihara (1993), “A very stable and potent fibrinolytic enzyme found in earthworm Lumbricus rubellus autolysate”, Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 106 (3), pp 763-766 58 Sun, H.L., J.D Jiao, Z.W Pan, D.L Dong, and B.F Yang (2006), “The cardioprotective effect and mechanism of lumbrokinase”, Yao xue xue bao, 41 (3), pp 247251 59 Tai, M.W and B.V Sweet (2006), “Nattokinase for prevention of thrombosis”, American journal of health-system pharmacy, 63 (12), pp 1121-1123 60 Tang, Y., T Jiang, et al (2003), “Multi-isomorphous replacement phasing of the earthworm fibrinolytic enzyme component A from Eisenia fetida”, Science in China Series C, Life sciences / Chinese Academy of Sciences, 46 (3), pp 263-272 61 Terashima, M., A Kubo, M Suzawa, Y Itoh, and S Katoh (1994), “The roles of the N-linked carbohydrate chain of rice alpha-amylase in thermostability and enzyme kinetics”, European journal of biochemistry / FEBS, 226 (1), pp 249-254 62 Tschopp, J.F., P.F Brust, J.M Cregg, C.A Stillman, and T.R Gingeras (1987), “Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris”, Nucleic acids research, 15 (9), pp 3859-3876 63 Wang, Q.Q., J.S Chen, X.X Liang, P.X Qiu, Y.W Wang, and G.M Yan (2004), “Hemorrhagic activity and mechanism of FIIa, a fibrinolytic enzyme from Agkistrodon acutus venom”, Acta pharmacologica Sinica, 25 (4), pp 514-521 64 Wolf, M and K Ransberger (1972), Enzyme therapy, Vantage Press., New York 65 Xu, Z.R., Y.M Yang, Q.F Gui, L.N Zhang, and L Hu (2010), “Expression, purification, and characterization of recombinant lumbrokinase PI239 in Escherichia coli”, Protein expression and purification, 69 (2), pp 198-203 66 Yan, X.M., C.H Kim, C.K Lee, J.S Shin, I.H Cho, and U.D Sohn (2010), “Intestinal absorption of fibrinolytic and proteolytic lumbrokinase extracted from earthworm, Eisenia andrei”, The Korean journal of physiology & pharmacology : official journal of the Korean Physiological Society and the Korean Society of Pharmacology, 14 (2), pp 71-75 67 Yuan, X., C Cao, Y Shan, Z Zhao, J Chen, and Y Cong (2006), “Expression and characterization of earthworm Eisenia fetida lumbrokinase-3 in Pichia pastoris”, Preparative biochemistry & biotechnology, 36 (3), pp 273-279 68 Zhao, M.M., M Li, Z.L Han, M Wang, and L.X Du (2006), “Cloning and expression of lumbrokinase gene in Pichia pastoris”, Wei Sheng Wu Xue Bao, 46 (4), pp 581-