Bước đầu nghiên cứu tinh sạch enzym dehalogenase từ chủng vi sinh vật phân lập tại Việt Nam

Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Đàm Lý BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM DEHALOGENASE TỪ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Đàm Lý BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM DEHALOGENASE TỪ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội – 2014 Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Quang Huy, người Thầy tận tình hướng dẫn, bảo cho em kĩ nghiên cứu kiến thức cần thiết suốt thời gian học tập thực đề tài Bên cạnh Thầy tạo điều kiện học tập nghiên cứu tốt cho em để em hồn thành tốt luận văn Tiếp đến em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn cung cấp cho em kiến thức bổ ích suốt khóa học Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, anh chị, bạn, em sinh viên Bộ mơn Sinh lý thực vật Hóa Sinh, phịng Enzyme học Phân tích hoạt tính sinh học, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Protein Enzym, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học sống, khoa Sinh học hướng dẫn giúp đỡ em thời gian em nghiên cứu phịng thí nghiệm Đề tài thực với hỗ trợ kinh phí đề tài cấp Đại học Quốc Gia Hà Nội mã số KLEPT 12-01 Đề tài thực Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệEnzym Protein, em xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ q báu Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên, ủng hộ tạo điều kiện tốt cho em suốt thời gian học tập q trình hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 08 năm 2014 Học viên Nguyễn Đàm Lý Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hợp chất halogen 1.1.1 Hợp chất halogen hữu 1.1.2 Ứng dụng hợp chất clo hữu 1.1.3 Tác hại hợp chất clo hữu 1.2 Tình hình sử dụng hợp chất có chứa clo Việt Nam 1.3 Một số phƣơng pháp xử lý hợp chất clo hữu 1.3.1 Phân hủy tia cực tím (UV) ánh sáng mặt trời 1.3.2 Phân hủy vi sóng Plasma 1.3.3 Biện pháp ozon hóa/UV 1.3.4 Biện pháp oxy hóa khơng khí ƣớt 1.3.5 Biện pháp oxy hóa nhiệt độ cao 1.3.6 Phân hủy công nghệ sinh học 10 1.4 Giới thiệu hợp chất 2,2-Dichloropropionate Sodium (2,2 DCPS) 12 1.4.1 Ứng dụng 2,2 DCPS 12 1.4.2 Ảnh hƣởng 2,2 DCPS đến sức khỏe ngƣời 13 1.4.3 Q trình phân hủy mơi trƣờng tự nhiên 2,2 DCPS 13 1.5 Enzym dehalogenase 15 Chƣơng – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên liệu 17 2.2 Hóa chất thiết bị 17 2.2.1 Hóa chất mơi trƣờng nuôi cấy 17 2.2.2 Máy móc, thiết bị 18 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phƣơng pháp thu mẫu 18 2.3.2 Phƣơng pháp phân lập 18 Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 2.3.3 Phƣơng pháp tuyển chọn chủng vi sinh vật 19 2.3.4 Phƣơng pháp phân loại chủng vi sinh vật 19 2.3.5 Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh chủng vi sinh vật 21 2.3.6 Nghiên cứu điều kiện sinh trƣởng khả sử dụng số chất khác 22 2.3.7 Đánh giá khả phân hủy hợp chất 2,2 DCPS 22 2.3.8 Phƣơng pháp nghiên cứu tinh dehalogenase 24 2.3.9 Phƣơng pháp thống kê sinh học 29 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả sử dụng 2,2 DCPS 30 3.3 Xác định đặc điểm sinh lý, hóa sinh chủng H11 33 3.3.1 Nhuộm Gram 33 3.3.2 Kết chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét 33 3.3.3 Giải trình tự gen 16S rRNA 34 3.3 Khả sử dụng hợp chất hữu khác chủng H11 36 3.4 Nghiên cứu khả sinh trƣởng phát triển chủng H11 37 3.4.1.Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng chủng H11 37 3.4.2.Tối ƣu điều kiện cho sinh trƣởng chủng H11 37 3.5.Khả phân hủy 2,2 DCPS 39 3.5.2.Khả phân hủy 2,2 DCPS theo thời gian 39 3.6 Bƣớc đầu nghiên cứu tinh dehalogenase từ chủng H11 39 3.6.2 Xác định hoạt tính enzym dehalogen 39 3.6.3 Sắc ký trao đổi anion 40 3.6.4 Điện di khơng biến tính protein 41 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Cơng thức hóa học số loại thuốc bảo vệ thực vật phổ biến Hình Sự ln chuyển thuốc BVTV mơi trƣờng khơng khí nƣớc Hình Cơng thức cấu tạo 2,2 DCPS 12 Hình Đƣờng chuẩn nồng độ NaCl với ion Cl- có mẫu 24 Hình Đƣờng chuẩn nồng protein 25 Hình Hình thái số chủng vi sinh vật môi trƣờng thạch MGB 31 Hình Chủng vi khuẩn H11 môi trƣờng MGB MGB bổ sung Bromothymol blue 32 Hình Hình thái chủng H11 dƣới kính hiển vi quang học độ phóng đại 100 33 Hình Ảnh vi điện tử quét chủng H11 độ phóng đại 5000 33 Hình 10 Vị trí phân loại chủng H11 với lồi có quan hệ họ hàng gần 35 Hình 11 Khả sinh trƣởng chủng H11 môi trƣờng MGB MGB 0.1% cao nấm 37 Hình 12 Khả sinh trƣởng chủng H11 nhiệt độ khác môi trƣờng MGB 38 Hình 13 Khả sinh trƣởng H11 với nồng độ chất khác môi trƣờng MGB 38 Hình 14 Khả phân hủy theo thời gian H11 mơi trƣờng MGB 39 Hình 15 Kết điện di SDS-PAGEsau qua cột Q sepharose 40 Hình 16 Điện di khơng biến tính protein 41 Hình 17 Kết điện di SDS-PAGE sau qua cột Sephadex G-75 42 Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Sử dụng hợp chất clo châu Âu năm 2012 Bảng Mức dƣ lƣợng tối đa cho phép mộ số thuốc trừ sâu, diệt cỏ gốc clo đất Việt Nam Bảng Thành phần gel điện di khơng biến tính protein 26 Bảng Thành phần gel SDS-PAGE 28 Bảng Đặc điểm khuẩn lạc mơi trƣờng MGB có bổ sung chất 2,2 DCPS 30 Bảng Kết thử kit API 20NE chủng H11 36 Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT BVTV Bảo vệ thực vật 2,2 DCPS 2,2-dichloropropionate sodium DDT Dichloro diphenyl trichlorothane 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic axit MGB Minimal growth bacterium PVC Polyvinyl clorua Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm MỞ ĐẦU Nhóm hợp chất halogen nhóm hợp chất đƣợc ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học… Bên cạnh lợi ích to lớn việc sử dụng cách tràn lan khơng có biện pháp xử lý triệt để gây hậu nghiêm trọng đến môi trƣờng, hệ sinh thái sức khỏe ngƣời Việc sử dụng phƣơng pháp vật lý, hóa học để giải tình trạng ô nhiễm gây hợp chất halogen cho hiệu cao nhiên địi hỏi cơng nghệ đại, chi phí cao vấn đề hậu xử lý sản phẩm tạo thành Phƣơng pháp sinh học sử dụng chủng vi sinh vật có khả phân giải hợp chất halogen đƣợc đánh giá hƣớng nghiên cứu có tiềm cao khơng cho hiệu cao mà cịn thân thiện với mơi trƣờng, tốn mang tính bền vững Trong tự nhiên tồn số nhóm vi sinh vật có khả sử dụng hợp chất halogen làm nguồn cung cấp cacbon trì hoạt động sống, chúng chuyên hóa hợp chất halogen từ dạng độc hại trở thành dạng khơng độc với mơi trƣờng sinh thái ngƣời Việt Nam nƣớc sản xuất nơng nghiệp, với điều kiện khí hậu phù hợp cho phát triển trồng nhƣng hội cho lây lan nhiều loại sâu bệnh, cỏ dại Để hạn chế phát triển lây lan sâu bệnh, cỏ dại hàng năm sử dụng lƣợng lớn thuốc bảo vệ thực vật có nhóm hợp chất halogen Việc sử dụng hợp chất nhƣng lại khơng có biện pháp kiểm sốt gây tình trạng nhiễm mơi trƣờng nghiêm trọng, ảnh hƣởng đến sinh thái môi trƣờng sức khỏe ngƣời Ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu việc ứng dụng vi sinh vật có khả phân giải hợp chất halogen để giải ô nhiễm môi trƣờng, việc ứng dụng vi sinh vật tự nhiên để giải ô nhiễm môi truờng mẻ, tiềm phƣơng pháp sinh học nhiều đồng thời để tiếp tục phát triển đề tài đƣợc thực trƣớc chúng tơi tiến hành thực đề tài: “BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM DEHALOGENASE TỪ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM” với mục tiêu phân lập vi sinh vật có hoạt tính phân giải hợp chất clo sở chủng tuyển chọn đƣợc bƣớc đầu nghiên cứu tinh enzym có khả phân hủy hợp chất có chứa clo Việt Nam Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hợp chất halogen 1.1.1 Hợp chất halogen hữu Các hợp chất halogen hữu lớp gồm chất hóa học tự nhiên tổng hợp, có chứa nhiều gốc halogen gồm Flo, Clo, Brom, Iot kết hợp với cacbon yếu tố khác Chúng đƣợc ứng dụng rộng rãi công nghiệp, nông nghiệp, y học nhƣ sản xuất nhựa, thiết bị y tế, tổng hợp cao su, đặc biệt sản xuất thuốc trừ sâu bệnh nông nghiệp [19] Các hợp chất hữu dẫn xuất halogen có tính độc cao, chúng nhóm chất gây nhiễm môi trƣờng lớn việc sử dụng tràn lan loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu nông nghiệp nhƣ việc sản xuất loại dung môi, chất dẻo nhiều chất trung gian cho sản phẩm hóa tổng hợp Việc sử dụng tràn lan thiếu kiểm soát hợp chất hữu dẫn xuất halogen dẫn đến tình trạng tồn dƣ với khối lƣợng lớn môi trƣờng vƣợt qua chịu tải tái sinh hệ sinh thái dẫn đến ô nhiễm môi trƣờng hệ sinh thái, ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng [52] 1.1.2 Ứng dụng hợp chất clo hữu Hợp chất clo hữu đƣợc sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác đời sống nhƣ sản phẩm nhựa, dung môi tẩy rửa Các loại hợp chất thƣờng bền vững khó bị phân hủy nên tồn lâu dài tự nhiên Dƣ lƣợng lớn loại hợp chất đƣợc tìm thấy đất, nƣớc khơng khí qua nƣớc mƣa vào hệ thống nƣớc uống nƣớc sinh hoạt ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời loại sinh vật [18] Một số ứng dụng quan trọng: - Chất dẻo: Hiện nay, sống hàng ngày ngƣời sử dụng nhiều sản phẩm từ nhựa tổng hợp nhƣ PVC (polyvinyl chlorua), PE (polyethylene), PP (polypropylene), PS (polystyrene) polyvinylclorua (PVC) loại nhựa nhiệt dẻo đƣợc sản xuất tiêu thụ nhiều thứ ba giới Clo PVC có khả Nguyễn Đàm Lý Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm phân hủy, điều giúp cho trình phân giải 2,2DCPS tự nhiên chủng H11 đƣợc nhanh chóng Chủng H11 có khả sử dụng số hợp chất nhƣ gelatin hay chuyển hóa axit giúp cho trình sinh trƣởng 3.4 Nghiên cứu khả sinh trƣởng phát triển chủng H11 3.4.1.Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng chủng H11 Mẫu vi khuẩn sau khoảng thời gian nuôi lắc 0, 3, 6, 9, 12, 24 đƣợc tiến hành đo mật độ quang học OD600nm Chúng tơi thu đƣợc kết hình Đồ thị biểu khả sinh trƣởng mạnh chủng H11 khoảng thời gian sau 12 nuôi cấy Khả sinh trưởng (OD 600nm) 0.6 0.5 0.4 0.3 MGB-CN 0.2 MGB 0.1 0 12 Thời gian sinh trưởng (giờ) 24 Hình 11 Khả sinh trƣởng chủng H11 môi trƣờng MGB MGB 0.1% cao nấm 3.4.2.Tối ƣu điều kiện cho sinh trƣởng chủng H11 Nhiệt độ Chúng tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ với khoảng nhiệt độ từ 25 đến 45oC Trong môi trƣờng MGB sau ngày nuôi cấy chúng tơi nhận thấy dải nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng chủng H11 25 đến 37oC Đây khoảng nhiệt độ phù hợp với môi trƣờng phân lập nhƣ kết nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật Việt Nam trƣớc điều kiện phân hủy hợp chất độc hại [10,4] Nguyễn Đàm Lý 37 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Hình 12 Khả sinh trƣởng chủng H11 nhiệt độ khác môi trƣờng MGB Nồng độ chất Nồng độ chất có ảnh hƣởng quan trọng tới sinh trƣởng chủng H11, với nồng độ cao gây ức chế chủng, thấp không Khả sinh truỏng OD 600nm tạo đƣợc khả sinh trƣởng tối đa 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 10 15 20 Nồng độ chất (mM) 25 30 40 Hình 13 Khả sinh trƣởng H11 với nồng độ chất khác môi trƣờng MGB Chúng tiến hành nghiên cứu để tìm nồng độ chất thích hợp cho sinh trƣởng, phát triển chủng vi khuẩn H11 Dải nồng độ chất đƣợc sử dụng từ đến 40mM [25] Sau ngày nuôi cấy lắc, chúng tơi nhận thấy 25mM Nguyễn Đàm Lý 38 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 2,2 DCPS nồng độ tối ƣu cho chủng H11 Kết phù hợp cho việc ban đầu lựa chọn nồng độ chất 20mM 3.5.Khả phân hủy 2,2 DCPS 3.5.2.Khả phân hủy 2,2 DCPS theo thời gian Đánh giá khả phân hủy hợp chất 2,2 DCPS theo thời gian 0, 3, 6, 9,12, 24 môi trƣờng MGB chủng H11 thu đƣợc kết nhƣ sau: Hình 14 Khả phân hủy theo thời gian H11 môi trƣờng MGB Sau 24 tiến hành nuôi cấy chủng H11 môi trƣờng MGB chứa 25mM 2,2 DCPS Hàm lƣợng Cl- đƣợc tạo mơi trƣờng ni cấy 70µM sau 24h, tƣơng đƣơng với 0,28% DCP bị phân hủy Việc phân huỷ 2,2 DCPS chủng H11 chƣa cao so với nghiên cứu Hong Jing cộng sự, chủng vi khuẩn nghiên cứu phân lập tác giả đƣợc có khả phân hủy 3% - 10% 2,2 DCPS vịng 30 ni cấy [25] Lý giải cho thấp H11 chủng vi khuẩn mà Hong Jing phân lập đƣợc chủng vi khuẩn khác chúng có khả phân hủy 2,2 DCPS khác nhau, mặt khác chủng H11 chƣa đƣợc tối ƣu điều kiện nghiên cứu nhƣ hàm lƣợng 2,2 DCPS đƣa vào nghiên cứu cao so với nghiên cứu trƣớc 3.6 Bƣớc đầu nghiên cứu tinh dehalogenase từ chủng H11 3.6.2 Xác định hoạt tính enzym dehalogen Hoạt tính enzym dehalogenase đƣợc xác định theo bảng Nguyễn Đàm Lý 39 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 3.6.3 Sắc ký trao đổi anion Để xác định kích thƣớc tinh dehalogenase có chủng H11 chúng tơi tiến hành kỹ thuật sắc ký trao đổi anion sử dụng gel Q sepharose Sau tiến hành chạy sắc ký chúng tơi thu đƣợc 20 phân đoạn có chứa protein có kích thƣớc khác Tiến hành thử hoạt tính phân đoạn thu đƣợc chúng tơi nhận thấy có phân đoạn có hoạt tính dehalogenase cao có phân đoạn thứ 8, 10 Cịn phân đoạn cịn lại hầu nhƣ khơng có hoạt tính yếu Xác định hoạt tính phân đoạn thu đƣợc kết sau: Bảng Hoạt tính enzym dehalogen chủng H11 Tổng lƣợng Hoạt độ enzym Hoạt tính riêng protein (mg/ml) (µmol/min) (Unit/mg) Phân đoạn thứ 0,0057 0,006 1,05 Phân đoạn thứ 10 0,0095 0,0044 0,46 Dịch thô 0,178 0,0063 2,84 Để kiểm tra mức độ tinh phân đoạn thu đƣợc tiến hành điện di phân đoạn gel SDS-PAGE với thành phần 12% gel tách 4% gel cô để kiểm tra độ tinh enzym sau qua cột sắc ký Hình 15 Kết điện di SDS-PAGEsau qua cột Q sepharose Trong đó, M: marker protein Các giếng 1-9: số thứ tự phân đoạn thu đƣợc sau sắc ký qua gel Q sepharose Nguyễn Đàm Lý 40 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Từ kết điện di cho thấy thứ (tƣơng ứng với phân đoạn thứ 10 sau sắc ký qua gel Q sepharose) có xuất băng có kích thƣớc khoảng 31kDa 36kDa đậm so với phân đoạn khác, nhiên độ tinh enzym chƣa cao xuất số băng nhiễu Các phân đoạn khác hàm lƣợng protein vạch tƣơng ứng thấp Mặc dù phân đoạn thứ 10 có tồn hoạt tính enzym dehalogenase có xuất băng protein có kích thƣớc khoảng 31 36kDa nhiên chúng tơi chƣa xác định đƣợc enzym dehalogenaseđƣợc sinh vi khuẩn Alcaligenes faecalis_H11 có kích thƣớc xác kDa Trƣớc enzym dehalogenase có khả phân hủy hợp chất 2,2 DCPS đƣợc tách từ Methylobacterium sp HJ1 có kích thƣớc 36kDa protein dimer, từ Rhizobium sp có kích thƣớc 62.000Da [20,15] Do để xác định kích thƣớc enzym dehalogen đƣợc sinh vi khuẩn Alcaligenes faecalis_H11 tiến hành phƣơng pháp điện di khơng biến tính protein để xác định xác kích thƣớc enzym 3.6.4 Điện di khơng biến tính protein Để xác định enzym dehalogenase có khả phân hủy chất hay không nhƣ xác định kích thƣớc enzym dehalogenase chúng tơi tiến hành điện di khơng biến tính phân đoạn chứa thứ 10 enzym Sau ủ gel với chất tiến hành nhuộm bạc Kết thu đƣợc có tồn enzym dehalogenase phân đoạn thu đƣợc E Hình 16 Điện di khơng biến tính protein M: marker protein; E: enzym dehalogenase thu đƣợc từ phân đoạn thứ 10 sau sắc ký qua gel Q sepharose Nguyễn Đàm Lý 41 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Từ kết điện di khơng biến tính protein cho thấy enzym dehalogenase đƣợc sinh vi khuẩn Alcaligenes faecalis_H11 có kích thƣớc khoảng 72kDa, nhiên kích thƣớc enzym điện di SDS-PAGE lại 36kDa, điều chứng tỏ protein dimer Giống với enzym dehalogen đƣợc sản sinh từ Methylobacterium sp HJ1 3.6.5 Sắc ký lọc gel Để loại bỏ băng nhiễu quanh băng có kích thƣơc 36kDa sử dụng kỹ thuật sắc ký lọc gel với phân đoạn qua cột sắc ký trao đổi ion 2ml dịch qua cột mono Q đƣợc tra vào cột gel Sephadex G75 Các phân đoạn đƣợc thu với thể tích 1ml Vì lƣợng protein mẫu thấp lại bị pha loãng nhiều lần nên sau thu phân đoạn lọc gel không tiến hành xác định đƣợc hàm lƣợng protein có mẫu nhƣ khơng xác định đƣợc hoạt tính enzym phân đoạn Tiến hành chạy điện di phân đoạn sau lọc gel thu đƣợc kết sau: M dịch thô Hình 17 Kết điện di SDS-PAGE sau qua cột Sephadex G-75 M: marker protein; dịch thô: hai phân đoạn 10 sau qua cột sắc ký qua gel Q sepharose; giếng 1-5: phân đoạn thu đƣợc sau lọc gel Sau qua cột sắc ký lọc gel enzym dehalogen đƣợc tinh thứ (tƣơng ứng với phân đoạn thứ sau qua sắc ký lọc gel) Các băng chứa protein không quan tâm giảm nhiều, điều chứng tỏ enzym dehalogen có kích thƣớc 36kDa gần nhƣ đƣợc tinh phân đoạn thứ sau lọc gel Nguyễn Đàm Lý 42 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Các phân đoạn có chứa protein đƣợc thu thập khoảng 20 phân đoạn sau chạy qua cột sắc ký trao đổi anion Q sepharose Các phân đoạn đƣợc kiểm tra hoạt tính để xác định xem có tồn enzym dehalogen hay khơng Trong có phân đoạn thứ 10 có hoạt tính enzym mạnh Sau tiến hành phân tích SDS-PAGE để kiểm tra độ tinh enzym thu đƣợc Đồng thời phân tích gel khơng biến tính phân đoạn chứa enzym để xác định xác kích thƣớc enzym Sau chúng tơi phải tiến hành chạy thơng qua cột thứ hai gel Sephadex G-75 để tinh protein có kích thƣớc 36kDa Ngồi protein kích thƣớc 36kDa mà chúng tơi quan tâm cịn có xuất protein có kích thƣớc khoảng 31kDa có khả hình thành enzym dehalogenase đƣợc Fahrul huyop Ronald cooper phân lập [22] Enzym có khả phân hủy 2,2 DCPS từ chủng H11 có kích thƣớc khoảng 36kDa đƣợc tinh bƣớc đầu Các nghiên cứu cần tiếp tục để tinh nghiên cứu cụ thể enzym cần thiết, nhƣ tìm hiểu tính chất enzym phân lập Nguyễn Đàm Lý 43 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm KẾT LUẬN Phân lập đƣợc 20 chủng vi sinh vật mơi trƣờng có bổ sung 2,2 DCPS nguồn cacbon, khuẩn lạc chủ yếu có hình trịn, kích thƣớc khoảng từ 0,5-5mm Đa số có màu trắng trắng đục, số có màu vàng nhạt vàng chanh Trong chủng vi khuẩn H11 có hoạt tính mạnh vi khuẩn gram âm Quan sát ảnh chụp hiển vi điện tử quét, chủng H11 có dạng que ngắn, bề mặt xù xì đƣờng kính sợi tế bào khoảng 1,5µm, chiều dài tế bào khoảng 3µm Dựa vào hình thái khuẩn lạc, tế bào kết phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng H11 tƣơng đồng 99,23 % (1419/1430 bp) với trình tự gen rARN 16S Alcaligenes faecalis_D88008 Điều kiện sinh trƣởng tối ƣu chủng H11 khoảng nhiệt độ 25-37oC, nồng độ chất 25mM Alcaligenes faecalis_H11 có khả sử dụng nhiều loại chất khác loại đƣờng đơn nhƣ Glucose, Arabinose, Sau 24 tiến hành nuôi cấy chủng Alcaligenes faecalis_H11 môi trƣờng MGB chứa 25mM 2,2 DCPS Hàm lƣợng Cl- đƣợc tạo môi trƣờng nuôi cấy 70µM sau 24h, tƣơng đƣơng với 0,28% DCP bị phân hủy Bƣớc đầu tinh enzym dehalogenase từ chủng H11 có kích thƣớc 36kDa, dimer protein Nguyễn Đàm Lý 44 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm KIẾN NGHỊ Mục đích nghiên cứu tinh nghiên cứu tính chất enzym dehalogenase từ chủng vi sinh vật phân lập Việt Nam Ngoài kết đạt đƣợc nghiên cứu sâu đề tài cần thiết nhƣ: Tối ƣu điều kiện sinh trƣởng H11 chất 2,2 DCPS thời gian dài Đánh giá ảnh hƣởng số yếu tố kim loại nặng lên sinh trƣởng H11 Tối ƣu điều kiện hoạt động tốt enzym dehalogen H11 Nguyễn Đàm Lý 45 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Đào Hùng Cƣờng, Nguyễn Minh Thiên, Nguyễn Trần Nguyên (2008), ―Nghiên cứu xác định số hợp chất clo nƣớc mặt, đất thuộc địa bàn thành phố Đà Nẵng‖, Tạp chị Khoa học Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 6(29), tr 57-58 A9 Kiều Hữu Ảnh (2006), Giáo trình vi sinh vật học phần 1, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 81-82 (36) Lê Bảo Hƣng (2012), ―Nghiên cứu điều kiện phân tích hợp chất hữu clo PCB mẫu môi trƣờng phƣơng pháp GC-MS‖, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 39 Ngơ Thị Kim Tốn (2012), Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật ứng dụng xử lý nước thải giàu nitơ, photpho, luận văn thạc sỹ sinh học thực nghiệm, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 46-47 (56) Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007), ―Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử loại clo Dehalococcoides mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sân bay Đà Nẵng kỹ thuật PCR-DGGE‖, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 16, tr 41-45 Nguyễn Thị Kim Cúc; Phạm Việt Cƣờng; Nguyễn Thị Tuyết Mai (2000), ―Một số tính chất vi khuẩn phân huỷ methyl parathion phân lập từ mẫu đất Hà Nội‖, Hội nghị sinh học quốc gia: Những vấn đề nghiên cứu sinh học, Hà Nội, 29-34 Nguyễn Tuấn Khanh (2010), Đánh giá ảnh hưởng sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật đến sức khỏe người chuyên canh chè Thái Nguyên hiệu biện pháp can thiệp, luận án tiến sỹ Y học, trƣờng Đại học Thái Nguyên (G) Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, Nxb Giáo Dục Việt Nam Tr 38-40 (40) Trần Thị Vân Thi (2007), ―Đánh giá tồn dƣ tích lũy hợp chất nhiễm chứa clo khó phân hủy vùng cửa sông đầm phá Thừa Thiên Nguyễn Đàm Lý 46 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Huế, miền Trung Việt Nam‖, Báo cáo Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á, ĐHQGHN A8 10 Trần Thúy Hằng (2011), Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng vi sinh vật có khả tạo màng sinh vật (biofilm) Việ tNam, luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (55) 11 Hà Minh Trung (2000), Nghiên cứu ảnh hưởng hoá chất độc hại dùng nông nghiệp tới sức khoẻ người, biện pháp khắc phục, Viện Bảo Vệ Thực Vật, 1-3 Tiếng Anh 12 (1987), ―Dalapon health advisory office of drinking water‖, U.S Environmental protection agency, 1-12 13 (2008), ―Pesticides‖, Children's Health and the Environment 14 Bergmann JG , John S (1957), ―Determination of trace amounts of chlorine in naphtha‖, Analytical Chemistry, 29 (2), pp 241–243 15 Dwivedi AH and Pande UC (2011), ―Photochemical degradation of halogenated compounds: A review‖, Scientific reviewsand Chemical Communications: 2(1), 41-65 16 Eleanor KM, Berry AN and Skinner AJ (1978), ―Degradation of the selective herbicide 2,2-Dichloropropionate (Dalapon) by a soil bacterium‖, JournalofGeneralMicrobiology110, 39-45 17 Fahrul ZH and Ronald C (2012), ―Degradation of millimolar concentration of the herbicide dalapon (2,2-Dichloropropionic acid) by rhizobium sp isolated from soil‖, Biotechnol & Biotechnol, 26(4), pp 3106-3107 18 Fetzner S and Ligens F, 1994.―Bacterial dehalogenases: Biochemistry, genetics, and biotechnological application‖,Microbiol.Rev 58 (4):641-685 19 Gordon WG (1994), "Natural Organohalogens—Many More Than You Think!" Journal of Chemical Education 71(11): 907–911 Nguyễn Đàm Lý 47 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 20 Greaves MP, Davies HA, Marsh JA, Wingfield GI (1981), ―Effects of pesticides on soil microflora using dalapon as an example‖ Arch Environ Contam Toxicol, 10(4):437-49 21 Hamid A, Hamdan S, Ariffin SHS, and Huyop F (2010), ―Molecular prediction of dehalogenase producing microorganism using 16S DNA analysis of 2,2-dichloropropionate degrading bacterium isolated from volcanic soil‖, Journal of Biological Sciences, Vol 10, pp 190-199 22 Hardman DJ and JH Slater (1981), ―Dehalogenases in soil bacteria‖, J Gen Microbiol., pp 117-128 23 Hareland WA, Crawford RL, Chapman, PJ and Dagley S (1975) ―Metabolic function and properties of a 4-hydroxyphenyl acetic acid 1-hydroxylase from Pseudomonasacidovorans‖ JournalofBacteriology121, 272-285 24 Hirsch P, Alexander M (1960), ―Microbial decomposition of halogenated propionic and acetic acids‖, Can J Microbial, 6, pp 241-249 25 Iwaji I, Satori U, Takejiro O (1952), ―New colorimetric determination of chloride using mercuric thiocyanate and ferric ion‖, Bulletin of The Chemical Society of Japan, 25(3): pp 226-226 26 Janssen DB, Dinkla IJ, Poelarends GJ, and Terpstra P (2005), ―Bacterial degradation of xenobiotic compounds: evolution and distribution of novel enzyme activities‖, Environ Microbiol 7:1868–1882 27 Jensen HL, Gemmell CG (1964) ―Some studies on trichloroacetatedecomposing soil bacteria‖ ArchivfürMikrobiologie, 48:386-392 28 Jing NH, Sulaiman FH, Wahab RA, Pakingking JR & Huyop F (2008) ―Purification and properties of a non-stereospecific dehalogenase enzyme E (DehE) from Methylobacterium sp HJ1‖ African Journal of Microbiology Research, 2(7), 187-191 29 John H Montgomery(1997), Agrochemicals Desk Reference, 2nd , CRC Press, USA, pp: 126 30 Kimura M (1980), ―A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences‖, J Mol Evol 16: 111-120 Nguyễn Đàm Lý 48 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm 31 Magee LA and Colmer AR (1959), ―Decomposition of 2,2-dichloropropionic acid by soil bacteria‖ CanadianJournalofMicrobiology, 5, pp 255-260 32 Marzorati M, Balloi A, Ferra F, Corallo L, Carpani G, Lieven W, Verstraete W Daffonchio D ( 2010), ―Bacterial diversity and reductive dehalogenase redundancy in a 1,2 dichloroethane degrading bacterial consortium enriched from a contaminated aquifer‖, Microbial Cell Factories 9:12 33 McKernan LT, Ruder AM, Petersen MR, Hein MJ, Forrester CL, Sanderson WT, Ashley DL, Butler MA (2008), ―Biological exposure assessment to tetrachloroethylene for workers in the dry cleaning industry‖, Environmental Health, pp 1186-1476 34 Mesri S, Wahab RA, Huyop F (2009) ― Degradation of 3-Chloropropionic Acid (3CP) by Pseudomonas sp B6P Isolated from a Rice Paddy Field‖,Ann.Microb, 59(3): 447-451 35 Mona KM, Parisa KM(2013 ), ―Review of Isolation of Potential Dehalogenase Marine Bacteria that can Degrade 2,2 -chloropropionate (2,2DCP)‖, Journal of Academic and Applied Studies, Vol 3(11), pp 45-64 36 Motosugi K, Esaki N, Soda K (1982) ―Purification and properties of 2haloacid dehalogenase from P Putida‖,Agric Biol Chem, 46:837 – 838 37 Mowafy AM, Kurihara T, Kurata A, Uemura T, Esaki N (2010), ―2haloacrulate Hydratase, a new class of flavoenzyme that catalyzes the addition of water to the substrate for dehalogenation‖,Appl Environ Microbiol, 76(18), pp 6032-6037 38 Niki Gupta (2009), Chlorine in Medicine, India 39 Parin DS, Shailesh RD (2012), ―Enzymatic degradation of textile dye Reactive Orange 13 by newly isolated bacterial strain Alcaligenes faecalis PMS-1‖, International Biodeterioration & Biodegradation vol 69, 41-50 40 Poland A, Greenlee WF, Kende AS (1979), ―Studies on the mechanism of action of the chlorinated dibenzo-p-dioxins and related compounds‖, Ann N Y Acad Sci., 31, pp 214–230 41 Roslan DD, Gicana RG, Lamis RJ, Rolando VP, and Huyop F (2011), ―Isolation of bacteria from volcanic area gunung Sibayak and molecular Nguyễn Đàm Lý 49 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm analysis of 2,2-Dichloropropionic acid degrading bacteria using 16S rDNA‖, Empowering Science, Technology and Innovation TowardsaBetter Tomorrow, pp 740-749 42 Saitou N & Nei M (1987), The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees, Mol Biol Evol 4: 406-425 43 Sakiyama Y, Nguyen, KNT, Nguyen MG, Miyadoh S, Duong VH & Ando K (2009), ―Kineosporiababensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam‖, Int J Syst Evol Microbiol 59, 550-554 44 Schwarze R, Brokamp A, Schmidt FRJ (1997), ―Isolation and characterization of dehalogenases from 2,2-Dichloropropionate degrading soil bacteria‖, Currentmicrobiology 34, 103-109 45 Stringfellow JM, Cairns SS, Cooper RA (1997), ―Haloalkanoate dehalogenase I1 (DehE) of a Rhizobium sp Molecular analysis of the gene and formation of carbon monoxide from trihaloacetate by the enzyme‖, Eur J Biochem, (250), 789-793 46 Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F & Higgins DG (1997), The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tool, Nucleic Acids Res 25: 4876-4882 47 Vinyl Environmental Council (2007), PVC Leads Climate Change Mitigation and Risk Reduction for Sustainable Development, Japan 48 Wen YW and Fahrul H (2012), ―Molecular identification and characterization of Dalapon-2,2-dichloropropionate (2,2-DCP) degrading bacteria from a rubber estate agricultural area‖, AfricanJournalofMicrobiologyResearch 6(7), 1520-1526 49 Widehem P, Aït-Aïssa S, Tixier C, Sancelme M, Veschambre H, Truffaut N (2002), ―Isolation, characterization and diuron transformation capacities of a bacterial strain Arthrobacter sp N2‖, Chemosphere, 46(4):527-34 50 Wong WY and Huyop F (2011) “Characterization of a Labrys sp strain Wy1 able to utilize 2,2-dichloropropionate (2,2-DCP) as sole source of carbon‖, African Journal of Microbiology Research5, pp 3282-3288 Nguyễn Đàm Lý 50 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ 51 Yadav JS Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm and Reddy CA (1993), ―Mineralization of 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and mixtures of 2,4-D and 2,4,5trichlorophenoxyacetic acid by Phanerochaetechrysosporium”, Applied and Environmental Microbiology, 59: 2904-2908 Website 52 http://baohoabinh.com.vn/28/73885/ 53 http://vietbao.vn/Khoa-hoc/ 54 http://vea.gov.vn/ 55 http://vi.swewe.net/word_show.htm/?130999_1&Alcaligenes_faecalis 56 http://www.who.int/ceh/capacity/Pesticides.pdf 57 http://www.eurochlor.org/media/70861/2013-annualreview-final.pdf 58 http://tailieuhoctap.vn/chi-tiet-sach/212-nganh-khoa-hoc-ky-thuat/khoa-hocmoi-truong/773047-mot-so-anh-huong-cua-san-xuat-nong-nghiep-toi-moitruong-va-sinh-vat 59 http://eia.vn/VBPL/QCVN/QCVN15.doc 60 http://mtvinaxanh.vn/Giai-phap/XL-nuoc-thai/Cac-bien-phap-xu-ly-dat-bi-onhiem-thuoc-bao-ve-thuc-vat/5-31c31.html 61 http://water.epa.gov/drink/contaminants/basicinformation/dalapon.cfm 62 http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=80 63.http://www.btk.fi/fileadmin/Page_files/proteomics/PDFfiles/Protocols/Coomassi e_Blue_staining_version_W.01.pdf 64 http//suckhoedoisong.vn/2010060404122443p0c14/thuoc-bao-ve-thuc-vat-danghoa-chat-loi-it-hai-nhieu.htm Nguyễn Đàm Lý 51 Khóa 2011-2013