Nghiên cứu đa hình gen CYP2C19 trong điều trị chống ngưng tập tiểu cầu bằng thuốc Clopidogrel trên bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da

MẪU 14/KHCN (Ban hành kèm theo Quyết định số 3839 /QĐ-ĐHQGHN ngày 24 tháng10 năm 2014 Giám đốc Đại học Quốc gia Hà Nội) ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI BÁO CÁO TỔNG KẾT KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA Tên đề tài: Nghiên cứu đa hình gen CYP2C19 điều trị chống ngưng tập tiểu cầu thuốc Clopidogrel bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da Mã số đề tài: QG.15.32 Chủ nhiệm đề tài: Trịnh Hồng Hà PHẦN I THƠNG TIN CHUNG 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu đa hình gen CYP2C19 điều trị chống ngưng tập tiểu cầu thuốc Clopidogrel bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da 1.2 Mã số: QG.15.32 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Chức danh, học vị, họ tên Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài PGS.TS Trịnh Hoàng Hà Khoa Y Dược, Bệnh Chủ nhiệmđề tài viện ĐHQGHN PGS.TS Dương Thị Ly Hương Khoa Y Dược, ĐHQGHN Thư ký đề tài TS Vũ Thị Thơm Khoa Y Dược, ĐHQGHN Thành viên, tham gia thực nội dung CN Nguyễn Hoàng Long Khoa Y Dược, ĐHQGHN Thành viên, tham gia thực nhóm nội dung 2,3,4,5 ThS.Vũ Ngọc Trung Bệnh viện ĐHQGHN Thành viên, tham gia thực nhóm nội dung 2,3,4,5 PGS.TS Nguyễn Lân Hiếu Viện tim mạch quốc gia Thành viên, tham gia thực nhóm nội dung 2,3,4,5 ThS Chu Dũng Sỹ Bệnh viện ĐHQGHN Thành viên, tham gia thực nhóm nội dung 2,3,4,5 ThS Phạm Thị Hồng Nhung Khoa Y Dược, ĐHQGHN Thành viên, tham gia thực nội dung Ths Nguyễn Văn Chương Bệnh viện đa khoa Vân Thành viên, tham gia thực Đình nội dung 1.4 Đơn vị chủ trì: Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội 1.5 Thời gian thực 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 02 năm 2015 đến tháng 02 năm 2017 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 02 năm 2018 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 02 năm 2015 đến tháng 11 năm 2017 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): (Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến Cơ quan quản lý) 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 460 triệu đồng PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặt vấn đề: Các bệnh tim mạch, đặc biệt bệnh động mạch vành (ĐMV), đứng hàng đầu tỷ lệ mắc tử vong hầu giới Bệnh ĐMV bao gồm: đau thắt ngực ổn định (ĐTNKÔĐ), đau thắt ngực khơng ổn định(ĐTNKĐ) nhồi máu tim (NMCT) thường gặp, để lại hậu trầm trọng sức khoẻ kinh tế không phát điều trị kịp thời [1] Từ năm 1997, can thiệp ĐMV qua da xem chiến lược tái thông mạch máu hiệu bệnh mạch vành Có khoảng 1,2 triệu ca can thiệp thực năm Mỹ khoảng triệu ca/năm toàn giới Số liệu cho thấy số ca can thiệp tăng gấp lần sau thập kỷ So với điều trị nội khoa, can thiệp ĐMV làm giảm tỉ lệ biến chứng người bệnh NMCT cấp hay ĐTNKoÔĐ nguy cao, làm giảm mức độ đau ngực cải thiện chất lượng sống người bệnh ĐTNÔĐ [1],[2] Stent phủ thuốc ngày dùng nhiều Việt nam giới, ưu điểm giảm tỷ lệ tái hẹp stent, giảm tỷ lệ phải can thiệp tái tưới máu sau can thiệp đặt stent phủ thuốc, người bệnh có tỷ lệ huyết khối cao phải dùng thuốc ức chế ngưng tập tiểu cầu (NTTC) kéo dài người bệnh đặt stent thường [3],[4] Cho đến clopidogrel thuốc đầu tay với aspirin định để dự phòng huyết khối biến cố tim mạch khác cho người bệnh sau can thiệp ĐMV qua da có đặt stent Tuy nhiên cịn tỷ lệ đáng kể người bệnh nguy tử vong, NMCT, đột quỵ, huyết khối stent liên quan đến giảm khả ức chế tiểu cầu clopidogrel [5],[6] Clopidogrel tiền chất khơng hoạt tính, địi hỏi hoạt hóa gan cytochrome P450 chủ yếu CYP2C19 để trở thành chất có hoạt tính, chất hoạt tính ức chế khơng hồi phục thụ thể P2Y12 ADP tiểu cầu [7],[8] Enzym CYP2C19 có tính đa hình cao, tùy theo xuất allen đột biến kiểu gen quy định biểu hoạt tính enzym bình thường (*1), giảm (*2 ,*3,*4,*5,*6,*7,*8) tăng (*17) [9] Ở người có hoạt tính enzym CYP2C19 bình thường tăng, liều clopidogrel 75 mg/ngày, dùng hàng ngày với thời gian tối ưu năm làm giảm đáng kể biến cố tim mạch Tuy nhiên, người có kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 liều clopidogrel phải 225 mg/ngày có hiệu tương đương, cịn với kiểu gen đồng hợp tử CYP2C19*2 liều có lên tới 300 mg/ngày khơng có tác dụng phải chuyển sang thuốc khác [10] Một số nghiên cứu quốc gia châu Á cho thấy tần số xuất CYP2C19 loại *2 *3 cao: 29% 8,9% (tương ứng) người Đông Á, 35% 2,4% (tương ứng) người Trung Nam Á [3],[11] Với tần suất xuất trên, chắn tỷ lệ tai biến clopidogrel người châu Á cao dùng với liều khuyến cáo thông thường 75 mg/ngày Hiện nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu tính đa hình di truyền enzym CYP2C19, mối liên quan đa hình di truyền enzym CYP2C19 với hiệu điều trị clopidogrel người bệnh can thiệp mạch vành qua da Xuất phát từ vấn đề cấp bách trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đa hình gen CYP2C19 điều trị chống ngưng tập tiểu cầu thuốc Clopidogrel bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da” Mục tiêu: Chúng nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu: Xây dựng quy trình xác định kiểu gen CYP2C19 Xác định tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 người bệnh có can thiệp động mạch vành số bệnh viện Hà Nội Đánh giá hiệu việc phân tích đa hình gen CYP2C19 ứng dụng điều trị chống ngưng tập tiểu cầu theo cá thể người bệnh sau can thiệp động mạch vành qua da Trên sở đó, đề xuất phác đồ điều trị chống ngưng tập tiểu cầu người bệnh đặt stent động mạch vành qua da Phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân Tất người bệnh sau đặt stent động mạch vành, tình trạng ổn định chuẩn bị dùng clopidogrel với liều trì 75mg/ngày phối hợp với Aspirin 100 mg/ngày Loại trừ người bệnh tiêu chuẩn loại trừ 3.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ - Người bệnh phải dùng thêm loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu khác aspirin clopidogrel - Đang chảy máu ngồi có chảy máu tạng - Huyết động không ổn định - Tai biến mạch não tháng - Mới phẫu thuật tuần - Chống định dùng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu - Nguy cao chảy máu - Suy thận, suy gan giai đoạn cuối - Không đồng ý tham gia nghiên cứu 3.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2016-6/2017 - Địa điểm lấy mẫu: Viện Tim mạch Việt Nam Trung tâm Tim mạch Bệnh viện Đại học Y Hà nội - Địa điểm nghiên cứu:  Bộ môn Y Dược học sở, khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội;  Viện Tim mạch Việt Nam;  Trung tâm Tim mạch Bệnh viện Đại học Y Hà Nội;  Viện nghiên cứu hệ gen 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu ngang, có so sánh (comparative cross-sectional study) 3.2.2 Cỡ mẫu - Cỡ mẫu: áp dụng cơng thức tính cỡ mẫu cho so sánh hai trị số trung bình: μ1 = 71: mức độ % độ NTTC trung bình nhóm có CYP2C19*2 với clopidogrel 75mg (theo nghiên cứu trước đó) μ2 = 57,5: mức độ % độ NTTC trung bình nhóm khơng có CYP2C19*2 với clopidogrel 75mg (theo nghiên cứu trước đó) [12] σ = 18,3: độ lệch chuẩn chung nhóm α = 0,05: mức ý nghĩa thống kê => Z(1-α/2) = 1,96 1-β = 0,80: lực mẫu => Z(1-β) = 0,84 Thay vào cơng thức, ta có cỡ mẫu cho nhóm 29 người bệnh, cỡ mẫu với hệ số thiết kế = (tương ứng với hai cụm hai bệnh viện nghiên cứu), ta có cỡ mẫu cho nhóm 58 Ước tính thêm 20% mẫu dự phòng bỏ => cỡ mẫu nhóm 80 Tổng cộng cỡ mẫu cần 160 (người bệnh) 3.2.3 Chọn mẫu nghiên cứu - Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu thuận tiện, chọn tất người bệnh có định đặt stent ĐMV qua da điều trị dự phòng chống ngưng tập tiểu cầu clopidogrel 75mg/ngày phối hợp với Aspirin 100 mg/ngày địa điểm nghiên cứu đủ cỡ mẫu Người bệnh lựa chọn hàng ngày dựa theo danh sách người bệnh dự kiến can thiệp ngày trung tâm tim mạch bệnh viện Đại học Y Hà nội phòng can thiệp tim mạch Viện Tim mạch Việt Nam  Sơ đồ chọn mẫu : Người bệnh mắc bệnh mạch vành có định chụp mạch vành xét can thiệp Viện tim mạch ViệtNam Bệnh viện Đại học Y Hà nội Người bệnh đặt stent động mạch vành qua da Và điều trị clopdogrel Xét nghiệm gen CYP2C19 Người bệnh mang gen kiểu CYP2C19*1 or *17 Người bệnh mang gen kiểu CYP2C19*2,*3 Tiếp tục điều trị clopidogrel Chuyển điều trị Ticagrelor 3.3 Nguyên liệu phương tiện nghiên cứu 3.3.1 Hóa chất - Cặp mồi đặt tổng hợp từ hãng IDT- Mỹ Đây mồi tự thiết kế - Lambda DNA/HindIII Marker, code: SM0103, hãng: Fermentas - GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, code: SM0321, hãng Thermo Scientific - Q5 High – Fidelity DNA polymerase, hãng: Neb (New England Biolabs) - E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code : D3392, hãng Omega-Biotek - GeneJET PCR Kit, hãng: Thermo Fisher Scientific - Chất kích tập ADP µM hãng Nippon Corporation (Nhật bản) 3.3.2 Thiết bị - Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh) - Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức) - Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ - Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chrono – LOG Mỹ 3.4 Các bước nghiên cứu 3.4.1 Kỹ thuật xét nghiệm gen CYP2C19 - Thu thập, xử lý bảo quản mẫu Cách lấy mẫu: 4ml máu lấy từ tĩnh mạch chứa vào ống chuyên dụng chứa sẵn chất chống đông EDTA, đảm bảo không bị nhiễm bẩn không bị lẫn mẫu với cách ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân mã code Mỗi ống máu đủ cho nhiều lần tách DNA tổng số, ln đảm bảo cịn mẫu lưu lặp lại việc tách DNA tổng số đến xác định kiểu gen bệnh nhân Cách bảo quản: Tại địa điểm thu nhận, mẫu bảo quản điều kiện ngăn đá tủ lạnh dân dụng không ngày, sau vận chuyển đảm bảo nguyên tắc an tồn sinh học đến phịng thí nghiệm môn Y Dược học sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Mẫu máu giữ lạnh -300C sử dụng Kí hiệu mẫu: Ống chứa máu phải có đầy đủ thơng tin: mã người bệnh, tên, tuổi, ngày lấy mẫu Thông tin mẫu máu người bệnh phải lưu sổ với thông tin: tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu bàn giao sử dụng để tách DNA - Tách chiết kiểm tra chất lượng DNA tổng số + Tách chiết DNA tổng số: Nguyên lý: Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số Nguyên lý kit dựa hấp thụ chọn lọc acid nucleic vào màng silica-gel điều kiện định với giai đoạn chính: Phá vỡ tế bào để giải phóng DNA; DNA liên kết với màng silica-gel; Loại bỏ tạp chất màng silica-gel với Wash Buffer; Thu nhận DNA + Kiểm tra chất lượng DNA tổng số: Sản phẩm DNA sau quy trình tách chiết kiểm tra theo hai phương pháp: (1) Kiểm tra chất lượng DNA phương pháp đo quang Quy trình thao tác chung gồm bước sau:  Đo Blank: đo với mơi trường dùng để bảo quản/ pha lỗng mẫu DNA  Đo mẫu DNA Các mẫu đo bước sóng 260nm 280nm, mẫu DNA đo lần lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA mẫu Thực nghiệm tiến hành Bộ môn Y Dược học sở, Khoa Y dược, ĐHQGHN sử dụng máy Eppendorf Bio Photometer Plus (2) Kiểm tra chất lượng DNA thông qua điện di  Điều kiện điện di: Điện di gel agarose 1,5% pha đệm TAE 1X, hiệu điện 70 V 60 phút  Thể tích mẫu điện di: µl mẫu + 1µl DNA 6X loading dye, µl Ruler 100 - Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C19*2, *3, *17 PCR kiểm tra chất lượng sản phẩm Nguyên lý: Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn trình tự DNA mong muốn Nguyên lý kỹ thuật dùng enzym polymerase để tổng hợp nên DNA từ DNA khn ban đầu Thành phần phản ứng gồm có DNA khn, mồi, dung dịch đệm, loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP), DNA polymerase Gồm giai đoạn chính: Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95°C) để tách hai mạch chuỗi DNA xoắn kép Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ hạ xuống tạo điều kiện cho tự bắt cặp mồi vào sợi DNA khuôn Nhiệt độ phụ thuộc vào chất mồi trình tự số lượng Nucleotide mồi Giai đoạn kéo dài: Tại 720C DNA polymerase hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotide dựa vào mạch khuôn sử dụng loại deoxyrinucleotidtriphosphate [13] Trình tự mồi quy trình PCR cụ thể cho vùng gen chứa alen *2, *3, *17 trình bày đây: Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR: Sử dụng phương pháp điện di tiến hành tương tự điện di kiểm tra chất lượng DNA sau tách chiết - Tinh sản phẩm PCR - Xác định kiểu gen SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 sử dụng phương pháp cắt enzyme giới hạn (RFLP) có đối chiếu với phương pháp GTT Sản phẩm PCR sau tinh pha lỗng/cơ đặc đến nồng 40-50 ng/µl tiến hành cắt enzyme cắt giới hạn Để đảm bảo phản ứng cắt xảy hoàn toàn kiểm tra độ lặp lại phản ứng, mẫu cắt (quá trình ủ) thời gian vùng thời gian cắt hồn tồn tối ưu Sau có kết kiểu gen SNP CYP2C19*2 CYP2C19*3 sử dụng phương pháp RFLP, để kiểm tra độ xác phương pháp này, tiến hành phương pháp GTT 15 mẫu người bệnh đầu Nếu kết hai phương pháp cho kết nhau, điều cho thấy phương pháp RFLP tối ưu tốt cho kết xác Do đó, mẫu người bệnh tiến hành phương pháp RFLP cho xác định kiểu gen SNP CYP2C19*2 CYP2C19*3, phương pháp cho kết nhanh hiệu kinh tế cho người bệnh 20µl sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu sáng nét gửi tinh giải trình tự chiều hãng First Base (Malaysia) Kết giải trình tự đọc phần mềm BioEdit version 7.1.9 Kết kiểu gen SNP dựa pic thu được, với SNP cho loại kiểu gen nêu phương pháp RFLP - Xác định kiểu gen SNP CYP2C19*17 sử dụng phương pháp GTT Do vị trí điểm đa hình SNP CYP2C19*17 khơng có trình tự nhận biết cho enzyme giới hạn, chúng tơi sử dụng phương pháp GTT để xác định kiểu gen CYP2C19*17 20µl sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu sáng nét gửi tinh giải trình tự chiều hãng First Base (Malaysia) Kết giải trình tự đọc phần mềm BioEdit version 7.1.9 Với alen CYP2C19*17: điểm đa hình thay C T, alen CYP2C19*17 có kiểu gen dại: CC, dị hợp tử đa hình: CT đồng hợp tử đa hình: TT - Cách đọc kết kiểu gen CYP2C19 Để tìm kiểu gen người bệnh nghiên cứu chúng tơi, trình bày trên, chúng tơi cần tìm kiểu gen alen hay nói cách khác xác định SNP Trong nghiên cứu này, chọn SNP: CYP2C19*2, CYP2C19*3 CYP2C19*17 để phân tích Mặc dù gen CYP2C19 cịn số SNP CYP2C19*4, *5, *6, *7, *8, tần số xuất SNP thấp qua nghiên cứu quần thể người Châu Á, mức độ ảnh hưởng chúng không nhiều hạn chế mặt kinh phí, nên với đề tài coi SNP alen kiểu dại (CYP2C19*1) 3.4.2 Xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu Nguyên lý chung: cho thêm chất kích tập từ ngồi vào ADP, collagen TC có khả ngưng tập, qua phản ánh chức quan trọng tế bào Kỹ thuật đo độ ngưng tập tiểu cầu qua thay đổi mật độ quang học (phương pháp đo quang) độ trở kháng sử dụng phổ biến để đánh giá chức tiểu cầu [14] Nguyên lý phương pháp đo quang: quang phổ kế có bước sóng thích hợp cố định dùng làm thiết bị đo độ NTTC Một chùm tia ánh sáng đỏ chiếu qua ống chứa huyết tương giàu tiểu cầu chùm tia khác chiếu qua ống chứa huyết tương nghèo tiểu cầu Khi đo, để thiết lập điểm chuẩn ánh sáng bị cản hoàn toàn độ dẫn truyền ánh sáng 0%, người ta sử dụng mẫu huyết tương giàu tiểu cầu mẫu máu cần đo Bên cạnh đó, để thiết lập điểm chuẩn ánh sáng qua hoàn toàn độ dẫn truyền ánh sáng 100%, người ta sử dụng huyết tương nghèo tiểu cầu mẫu máu Khi cho chất kích tập ADP, collagen, thrombin, epinephrine, arachidonic acid, ristocetin vào huyết tương giàu tiểu cầu xảy tượng tiểu cầu ngưng tập với tạo thành đám độ dẫn truyền ánh sáng tăng lên Độ dẫn truyền ánh sáng phản ánh mức độ NTTC Kết thể % độ dẫn truyền ánh sáng huyết tương giàu tiểu cầu tiểu cầu ngưng tập tối đa [15] Hình Nguyên lý xét nghiệm NTTC (Nguồn: Principles of platelet aggregation in clinical trials, JAVA clinical Research) Trị số bình thường [16]:  Chất kích tập ADP: 59 - 88%  Chất kích tập COLLAGEN: 58 - 78% NTTC bị thay đổi nhiều bệnh rối loạn chức TC bẩm sinh mắc phải Ví dụ NTTC bị giảm với chất kích tập ristocetin người bệnh có hội chứng Bernard Soulier (thiếu GP Ib) vWF; giảm ngưng tập với ADP người bệnh dùng aspirin [17] Tiến hành: - Tiến hành máy Chrono – LOG Mỹ - Sử dụng chất kích tập ADP µM hãng Nippon Corporation (Nhật bản) - Người bệnh lấy máu tĩnh mạch theo cách thức không garo tĩnh mạch, để máu tự chảy qua kim lấy máu vào ống xét nghiệm - Lấy ml máu tĩnh mạch cho vào ống nhựa có sẵn chất chống đơng citrat natri 3.8%, chống đơng theo tỷ lệ thể tích máu/1 tỷ lệ chống đơng, sau nhẹ nhàng trộn chất chống đông với máu - Làm xét nghiệm thời gian không 30 phút kể từ lấy máu Vận chuyển máu nhẹ nhàng, tránh vỡ hồng cầu - Các mẫu máu đo độ NTTC trước hết đem ly tâm nhẹ với tốc độ 500 vòng/phút 10 phút để có huyết tương giàu TC (cần phải có số lượng TC 200 – 400 G/l), sau đem ly tâm mạnh với tốc độ 3.000 vòng/phút 10 phút để thu huyết tương nghèo TC; thực máy ly tâm KUBOTA 5910 (Nhật Bản) - Đánh giá độ NTTC dựa vào độ ngưng tập tối đa MA% (Maximum aggregation): số NTTC người bình thường với chất kích tập ADP nồng độ 10 µM 67±5% 3.4.3 Thu thập biến cố lâm sàng - Các biến cố tim mạch bao gồm: Tử vong nguyên nhân, NMCT, đột quỵ, huyết khối stent Các tiêu chí an tồn: Chảy máu nặng không gây tử vong, chảy máu nhẹ Được thu thập người bệnh nằm viện, khám lại hàng tháng sau 1, 3, 6, 12 tháng - Các thông tin khác thu thập qua thăm khám người bệnh lúc nằm viện: + Các thông tin chung người bệnh: tuổi, giới, nghề nghiệp, địa lý + Các yếu tố nguy tim mạch: tăng huyết áp, tăng cholesterol máu, đái tháo đường, hút thuốc lá, tiền sử gia đình + Các xét nghiệm tình trạng lâm sàng: suy thận, EF, tiền sử NMCT + Các xét nghiệm khác: số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu, hemoglobin 3.4.4 Quy trình nghiên cứu - Quy trình nghiên cứu thực theo sơ đồ đây: 3.5 Xử lý phân tích số liệu Số liệu xử lý phần mềm SPSS 20.0 Sử dụng test thống kê: tính trị số trung bình, trung vị, T- test, 2, ANOVA test, Fisher test…ở chỗ phù hợp 3.6 Đạo đức nghiên cứu Đề tài nghiên cứu thông qua hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, ngày 02/10/2015, theo mã số đề tài QG.15.32 Người bệnh trước Kiểu gen CYP2C19 *1*1 n 50 % 36,76 n 17 % 51,52 Tổng cộng n % 67 39,64 *1*2 56 41,18 10 30,30 66 39,05 *1*3 10 7,35 3,03 11 6,51 *2*2 12 8,82 12,12 16 9,47 *2*3 5,88 0 4,73 *3*3 0 3,03 0,59 136 100 33 100 169 100 Tổng số Nam Nữ p 0,135 Sự khác biệt tỉ lệ giới tính nhóm kiểu gen khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) 4.2.2 Tỷ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý kiểu gen quy định Bảng Tỷ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý kiểu gen quy định Kiểu gen CYP2C19 Tổng số (n) Nam Nữ Tổng cộng n % n % n % Tác dụng 20 14,71 15,15 25 14,80 Tác dụng giảm 66 48,53 11 33,33 77 45,56 Tác dụng bình thường 50 36,76 17 51,52 67 39,64 Tổng số 136 100 33 100 169 100 p 0,253 * Tác dụng kém: (*2*2, *3*3, *2*3); giảm: (*1*2, *1*3); bình thường: (*1*1); Sự khác biệt tỉ lệ giới tính nhóm chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) 4.2.3 Tỷ lệ người bệnh sử dụng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu theo kiểu gen Bảng Tần số tỉ lệ người bệnh sử dụng thuốc chống NTTC theo kiểu gen Loại thuốc sử dụng Tổng Ticagrelor n % n % Tác dụng 23,33 25 14,80 Tác dụng giảm 12 40,00 77 45,56 Tác dụng bình thường 11 36,67 67 39,64 Tổng 30 100 169 100 P 0,349 Chưa thấy có khác biệt mang ý nghĩa thống kê tỉ lệ sử dụng clopidogrel ticagrelor nhóm kiểu gen (p>0,05) 4.2.4 Chẩn đoán hội chứng động mạch vành cấp Kiểu gen Clopidogrel n % 18 12,95 65 46,76 56 40,29 139 100 16 Kiểu gen CYP2C19 Bảng Chẩn đoán NMCT khơng NMCT có ST ĐTNKƠĐ Tổng cộng ST chênh lên chênh lên n % n % n % n % Tác dụng 10 40 28 32 25 14,8 Tác dụng giảm 25 32,47 16 20,78 36 46,75 77 45,56 Tác dụng bình thường 27 40,30 15 22,39 25 37,31 67 39,64 Tổng 62 100 38 100 69 100 169 100 p 0,651 Sự khác biệt tỉ lệ chẩn đoán hội chứng vành cấp nhóm khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) 4.3 Hiệu chống ngưng tập tiểu cầu liên quan đến kiểu gen CYP2C19 4.3.1 Kết độ NTTC theo kiểu gen nhóm sử dụng Clopidogrel Bảng Kết đo dộ NTTC theo kiểu gen nhóm sử dụng Clopidogrel Nhóm kiểu gen Độ NTTC Tác dụng bình thường Tác dụng giảm 56 83 Trung bình (X) 25,80 31,57 Độ lệch chuẩn (SD) 10,75 12,91 Số bệnh nhân (n) p 0,0033 Kết phân tích cho thấy: người bệnh sử dụng Clopidogrel, nhóm kiểu gen tác dụng giảm có độ NTTC cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm tác dụng bình thường (p=0,0033) 4.3.2 Kết độ NTTC người bệnh chuyển hóa giảm dùng Clopidogrel sau chuyển sang dùng Ticagrelor Bảng Kết độ NTTC người bệnh chuyển hóa giảm dùng Clopidogrel sau chuyển sang dùng Ticagrelor Độ NTTC Loại thuốc sử dụng Mức chênh lệch độ NTTC Clopidogrel Ticagrelor 9 Trung bình (X) 36,44 18,88 17,55 Độ lệch chuẩn (SD) 16,23 15,31 16,43 Số bệnh nhân (n) p 0,0352 Theo kết phân tích, độ NTTC nhóm người bệnhcó kiểu gen chuyển hóa giảm (9 người) can thiệp để chuyển sang dùng Ticagrelor (độ NTTC trung bình 18,9) 17 giảm có ý nghĩa thống kê so với trước dùng Clopidogrel (độ NTTC trung bình 36,4) với p0,05) Đánh giá kết đạt kết luận Chúng tơi hồn thiện quy trình xét nghiệm gen CYP2C19, đảm bảo áp dụng phịng thí nghiệm, xét nghiệm, sở khám chữa bệnh có trang thiết bị sinh học phân tử phân tích DNA phù hợp Trong nghiên cứu chúng tôi, tuổi trung bình người bệnh nghiên cứu 64  11, giới tính nam chiếm 80,4.So sánh với nghiên cứu khác giới tuổi: có tương đồng tuổi trung bình 64 (Hisao Ogawa cs.) 63,8 11,0 (Guillaume Paré cs.) Tần số phân bố kiểu gen: Tần số *1*2 (39,05%) cao so với kết nghiên cứu PLATO (17%) Tần số *3 (11,83%) phù hợp với tỷ lệ xuất allen người châu (2-9%), cao so với châu Âu Mỹ ( A), *3 (c.636G > A) *17 (c - 806C > T) gây thay đổi hoạt tính enzyme nên dẫn đến khả đáp ứng thuốc khác người bệnh Clopidogrel, ticagrelor, Prasugrel với Aspirin thường dùng cho người bệnh sau đặt stent ĐMV, Clopidogrel dùng nhiều Một tỷ lệ đáng kể người bệnh nguy tử vong, NMCT, đột quỵ, huyết khối stent liên quan đến giảm khả ức chế tiểu cầu clopidogrel Xét nghiệm gen CYP2C19 đo độ ngưng tập tiểu cầu xét nghiệm để đánh giá tình trạng hoạt hoá tiểu cầu Kết quả: Trong 169 người bệnh, tuổi trung bình 64  11; 80,47% Nam Tỷ lệ có kiểu gen làm tác dụng thuốc kém: 14,80%, giảm 45,56%, bình thường 39,64% 82,25% người bệnh dùng Clopidogrel, 17,75% dùng Ticagrelor Độ NTTC nhóm dùng Clopidogrel (29,24±12,37) cao hẳn so với nhóm dùng Ticargrelor (11,83±8,30) Độ NTTC nhóm người bệnh có kiểu gen làm tác dụng giảm (31,5712,91) cao so với nhóm người bệnh có tác dụng bình thường (25,80  10,75) với p < 0,005 Độ NTTC giảm đáng kể nhóm người bệnh có kiểu gen làm giảm tác dụng thuốc dùng Clopidogrel (36,44  16,23) chuyển sang dùng ticargrelor (18,88 15,31) với p = 0,0352 Trong nhóm dùng Clopidogrel có khác biệt rõ nhóm: độ NTTC nhóm có tác dụng 32,8313,73 nhóm có tác dụng giảm 31,22 12,76 cao so với nhóm tác dụng bình thường 25,80  10,75 (p= 0,0137 0,0069); khơng có khác biệt độ NTTC nhóm tác dụng tác dụng giảm với p= 0,3204 Tỷ lệ biến cố lâm sàng liên quan đến huyết khối gặp thời gian nghiên cứu nhóm người bệnh có kiểu gen làm giảm tác dụng thuốc clopidogrel cao hẳn nhóm có 23 kiểu gen bình thường biến cố chảy máu xẩy nhóm có kiểu gen bình thường giảm ASTRACT: CYP2C19 is one of the principal enzymes involed in the antiplatelet prodrug clopidogrel Mutant alleles such as CYP2C19 *2 (c.681G > A), *3 (c.636G > A) and *17 (c - 806C > T) have been associated with changing in enzyme activity, which may result in the ability of various drug responses in patients Clopidogrel, ticagrelor, Prasugrel with Aspirin are commonly used in patients with acute coronary syndrome, in which clopidogrel is most frequently used Significant proportions of patients are at risk for death, MI, stroke, and stent thrombosis associated with reduced platelet inhibitory capacity of clopidogrel The CYP2C19 genotyping and platelet aggregation measurements are the basic tests to assess platelet activation In 169 consecutive patients (mean age: 64  11; 80.47% Male Phenotypes based on genotypes: 14,80% Poor metabolizer; 45,56% Intermediate metabolizer; 39,64% Extensive metabolizer 82.25% of patients used clopidogrel, 17.75% received ticagrelor Platelet aggregation in the clopidogrel group: 29.24  12.37 higher than the Ticagrelor group: 11.83  8.30 (p