Nghiên cứu bào chế liposome làm chất mang thuốc

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÚY NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME LÀM CHẤT MANG THUỐC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÚY NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME LÀM CHẤT MANG THUỐC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2012.Y Người hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN THANH HẢI ThS NGUYỄN VĂN LÂM Hà Nội – 2017 Lời cảm ơn Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy giáo Khoa Y Dược dìu dắt, giúp đỡ em suốt học ghế nhà trường tạo điều kiện cho em làm khóa luận tốt nghiệp Đồng thời em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thanh Hải thầy người trực tiếp giao đề tài bảo, định hướng cho em thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ hỗ trợ tạo điều kiện cho em làm thực nghiệm Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội Với tình cảm chân thành lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Văn Lâm Thầy người tận tình bảo hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ em nhiều suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực đề tài Cuối xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè ln động viên, cổ vũ suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Hà Nội, tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Thúy DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Viết tắt CHOL DC DĐVN DLS DOX EE GUV HBG HBS HEPES HSPC KTTP LUV LTP MLV MUV MVVs OLV PBS PDI PEG PL PTX SPC SUV Tc TCCS TEM VOR Từ/ cụm từ đầy đủ Cholesterol Dược chất Dược điển Việt Nam Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động Doxorubicin Encapsulation Efficient - Hiệu suất liposome hóa Giant Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp khổng lồ HEPES Buffer Glucose – HEPES pH 7,4 môi trường glucose 5% HEPES Buffer Saline – HEPES pH 7,4 môi trường NaCl 0,9% N-2- hydroxy ethyl piperazin-N-2-ethansulfonic acid Soy Phosphatidylcholin - Phosphatidyl cholin dầu đậu nành hydrogen hóa Kích thước tiểu phân Large Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp lớn Latanoprost Multi Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp Medium Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp trung bình Multi Vesicular Vesicle – Liposome kép – liposome liposome Oligo Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp nhỏ Đệm photphat pH 7,4 môi trường NaCl 0,9% Polydispersity Index – Chỉ số đa phân tán Polyethylen glycol Phospholipid Paclitaxel Phosphatidylcholin dầu đậu nành Small Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp nhỏ Nhiệt độ chuyển dạng Tiêu chuẩn sở Trasmission electron microscopy - Kính hiển vi điện tử truyền qua Voriconazole DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1 Một số phân loại liposome theo cấu trúc lớp vỏ Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng 18 Bảng 3.1 Kết đo KTTP, PDI điện zeta hệ môi trường hydrat nước 23 Bảng 3.2 Kết đo KTTP, PDI điện zeta hệ môi trường hydrat đệm acetat pH 4,0 24 Bảng 3.3 Kết đo KTTP, PDI điện zeta hệ môi trường hydrat đệm citrat pH 4,0 25 Bảng 3.4 Kết đo KTTP, PDI zeta hệ môi trường hydrat amoni pH 5,5 25 Bảng 3.5 Kết đo KTTP, PDI zeta hệ môi trường hydrat: dung dịch glucose 5% 26 Bảng 3.6 Kết đo KTTP, PDI zeta hệ môi trường hydrat:dung dịch saccarose 10% 26 Bảng 3.7 Kết đo KTTP, PDI zeta hệ môi trường hydrat: dung dịch NaCl 0,9% 27 Bảng 3.8 Kết đo KTTP, PDI zeta hệ môi trường hydrat: đệm PO4/ NaCl 27 Bảng 3.9 Sự thay đổi KTTP, PDI hệ môi trường hydrat nước trước sau đổi mơi trường bên ngồi 28 Bảng 3.10 Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian hệ môi trường hydrat: đệm acetat pH 4,0 trước sau đổi mơi trường bên ngồi 30 Bảng 3.11 Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian hệ môi trường hydrat: đệm citrat pH 4,0 trước sau đổi môi trường bên 31 Bảng 3.12 Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian hệ môi trường hydrat: đệm amoni pH 5,5 trước sau đổi môi trường bên 33 Bảng 3.13 Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian hệ môi trường hydrat: dung dịch glucose 5% trước sau đổi môi trường bên 35 Bảng 3.14 Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian hệ môi trường hydrat: dung dịch NaCl 0,9% trước sau đổi mơi trường bên ngồi 36 Bảng 3.15 Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian hệ môi trường hydrat: đệm PO4/ NaCl pH 7,4 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Tên hình vẽ Số hiệu Trang Hình 1.1 Cấu trúc liposome Hình 1.2 Các cách mang dược chất liposome Hình 1.3 Phân loại liposome dựa vào kích thước cấu trúc số lớp Hình 1.4 Các dạng liposome biến đổi Hình 1.5 Sơ đồ bào chế liposome phương pháp hydrat hóa màng film Hình 1.6 Cơ chế hình thành liposome phương pháp bốc pha đảo Hình 1.7 Hệ thống phương pháp bốc pha đảo siêu tới hạn 10 Hình 1.8 Sự giải phóng thuốc có kích thích bên ngồi với cấu trúc đa lớp đơn lớp 11 Hình 1.9 Thiết bị đùn tay mini extruder thiết bị nén đẩy áp suất cao 13 Hình 1.10 Khả tập trung mơ đích liposome dựa hiệu ứng EPR 15 Hình 1.11 Sự khác biệt mạch máu mơ bình thường mơ ung thư 16 Hình 2.1 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu 21 Hình 3.1 Hình ảnh chụp TEM mẫu liposome 23 Hình 3.2 Sự thay đổi điện zeta theo thời gian mẫu liposome có mơi trường hydrat H2O 29 Hình 3.3 Sự thay đổi điện zeta theo thời gian mẫu liposome có mơi trường hydrat đệm acetat pH 4,0 30 Hình 3.4 Sự thay đổi điện zeta theo thời gian mẫu liposome có mơi trường hydrat đệm citrat pH 4,0 32 Hình Sự thay đổi điện zeta theo thời gian mẫu 34 3.5 liposome có mơi trường hydrat amoni pH 5,5 Hình 3.6 Sự thay đổi điện zeta theo thời gian mẫu liposome có mơi trường hydrat dung dịch glucose 5% 35 Hình 3.7 Sự thay đổi điện zeta theo thời gian mẫu liposome có mơi trường hydrat dung dịch NaCl 0,9% 37 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm liposome 1.2 Phân loại 1.2.1 Phân loại theo kích thước cấu trúc số lớp 1.2.2 Phân loại theo thành phần cấu trúc lớp vỏ 1.3 Thành phần cấu tạo liposome 1.3.1 Phospholipid 1.3.2 Cholesterol 1.4 Phương pháp bào chế 1.4.1 Phương pháp Bangham (hydrat hóa màng film) 1.4.2 Phương pháp tiêm 1.4.3 Phương pháp bốc pha đảo (Reverse – phase evaporation method) 1.4.4 Phương pháp bốc pha đảo siêu tới hạn (supercritical reverse phase evaporation method) 1.5 Ảnh hưởng đặc tính tiểu phân đến tới chất lượng liposome 10 1.5.1 Ảnh hưởng KTTP 10 1.5.2 Ảnh hưởng điện zeta đến độ ổn định 11 1.6 Phương pháp giảm kích thước tiểu phân 12 1.6.1 Phương pháp siêu âm 12 1.6.2 Phương pháp nén/ đẩy qua màng 12 1.6.3 Phương pháp đông lạnh - giải đông (freeze- thawed) 12 1.6.4 Phương pháp vi hóa lỏng (microfluidization) 13 1.7 Ứng dụng liposome 13 1.7.1 Ứng dụng liposome điều trị ung thư 13 1.7.2 Ứng dụng đưa thuốc tới mắt 15 1.7.3 Ứng dụng đưa thuốc tới phổi 16 1.8 Ưu điểm nhược điểm liposome 16 1.8.1 Ưu điểm 16 1.8.2 Nhược điểm 17 Chương - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Nguyên vật liệu 18 2.3 Phương tiện nghiên cứu 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Bào chế liposome phương pháp hydrat hóa màng film 19 2.4.2 Nghiên cứu quy trình làm giảm đồng kích thước tiểu phân 20 2.4.3 Đánh giá ảnh hưởng môi trường bên bên ngồi đến đặc tính tiểu phân liposome 20 2.5 Phương pháp đánh giá liposome tạo thành 21 2.5.1 Đánh giá cảm quan 21 2.5.2 Phương pháp đánh giá hình thái, cấu trúc liposome 21 2.5.3 Phương pháp đánh giá đặc điểm hóa lí hệ có mơi trường ngồi khác 21 Chương - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Hình thái, cấu trúc liposome 23 3.2 Đánh giá quy trình giảm đồng KTTP 23 3.2.1 Hệ môi trường hydrat nước (H2O) 23 3.2.2 Hệ môi trường hydrat: đệm acetat pH 4.0 24 3.2.3 Hệ môi trường hydrat: đệm citrat pH 4.0 24 3.2.4 Hệ môi trường hydrat: đêm amoni pH 5.5 25 3.2.5 Hệ môi trường hydrat: dung dịch Glucose 5% 26 3.2.6 Hệ môi trường hydrat: dung dịch saccarose 10% 26 3.2.7 Hệ môi trường hydrat: dung dịch NaCl 0.9% 27 3.2.8 Hệ môi trường hydrat: đệm Phosphat NaCl pH 7.4 (PBS) 27 3.3 Đánh giá độ ổn định hệ liposome với thành phần mơi trường ngồi khác 28 3.3.1 Môi trường bên nước 28 3.3.2 Môi trường bên đệm acetat pH 4,0 (AB –acetat buffer) 29 3.3.3 Môi trường hydrat: đệm citrat pH 4.0 (CB- citrate buffer) 31 3.3.4 Hệ môi trường hydrat: đệm amoni pH 4.0 (AmB – amoni buffer) 33 3.3.5 Môi trường hydrat: dung dịch glucose 5% (Glu) 34 3.3.6 Môi trường hydrat: dung dịch saccarose 10% (Sac) 36 3.3.7 Môi trường hydrat: dung dịch NaCl 0.9 % (NaCl) 36 3.3.8 Hệ môi trường hydrat: đệm Phosphat NaCl pH 7.4 (PBS) 37 Chương - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đánh giá ảnh hưởng môi trường liposome đến thay đổi KTTP PDI ta có bảng sau: Bảng 3.10: Sự thay đổi KTTP, PDI qua thời gian hệ môi trường hydrat: đệm acetat pH 4,0 trước sau đổi môi trường bên ngồi Mơi trường AB/ AB Ngày AB/ HBS AB/ HBG AB/ H2O Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI 74.30 0.152 _ _ _ _ _ _ 83.02 0.177 82.21 0.160 75.90 0.140 81.02 0.177 82.20 0.170 83.22 0.163 76.02 0.144 87.20 0.178 14 86.60 0.162 88.70 0.182 82.43 0.155 87.12 0.191 30 102.3 0.141 116.3 0.116 88.16 0.170 88.70 0.196 Nhận xét: - Mẫu có mơi trường ngồi liposome đệm acetat có KTTP tăng dần theo thời gian từ 74.3 nm lên 102.3 nm, giá trị PDI thay đổi bất thường hạt tiểu phân kích thước lớn rơi xuống đáy lọ, lơ lửng hạt có kích thước nhỏ - Sau tiến hành đổi môi trường bên liposome ta nhận thấy: với hệ đệm bên HBS KTTP tăng dần theo thời gian Hệ đệm HBG nước cất không tăng nhiều, KTTP dao động khoảng 88 nm, giá trị PDI khoảng 0.2 sau 30 ngày bảo quản cho thấy hệ ổn định Điều thể rõ qua việc đánh giá ổn định hệ thông qua việc đo điện zeta Hình 3.3: Sự thay đổi điện zeta theo thời gian mẫu có hệ mơi trường hydrat đệm Acetat (AB) Dựa vào đồ thị ta nhận thấy: - Mẫu có mơi trường ngồi đệm acetat zeta giảm dần từ +32.4 mV xuống +27.5 mV cho thấy hệ không ổn định theo thời gian bảo quản Điều có 30 thể giải thích mơi trường pH q thấp s làm gia tăng thủy phân phospholipid làm hệ ổn định - Khi thay đổi mơi trường bên ngồi liposome từ đệm acetat sang môi trường khác nhận thấy có thay đổi điện tích từ dương sang âm chứng tỏ bề mặt liposome hấp phụ nhiều ion (-) làm thay đổi điện tích bề mặt chúng - Với mơi trường bên ngồi đệm HBS, mẫu đo zeta giảm dần theo thời gian - Với mơi trường bên ngồi liposome đệm HBG nước thay đổi điện khơng đáng kể, mẫu có giá trị khoảng -30 mV cho thấy hệ ổn định Đánh giá ảnh hưởng môi trường bên ngồi đến đặc tính tiểu phân liposome ta khẳng định với môi trường bên đệm acetat mơi trường bên ngồi nước đệm HBG s ổn định Trong nước mơi trường thích hợp 3.3.3 Môi trường hydrat: đệm citrat pH 4.0 (CB- citrat buffer) Đối với hệ có mơi trường bên bên ngồi citrat, tiến hành thẩm tích đổi mơi trường bên ngồi liposome thành nước cất, đệm HBG HBS, ta có hệ mơi trường khác sau: Các hệ Mơi trường ngồi liposome CB/ CB Mơi trường ngồi liposome đệm citrate CB/ H2O Môi trường đệm citrat ngồi liposome nước CB/ HBG Mơi trường đệm citrat liposome đệm HBG CB/ HBS Mơi trường đệm citrat ngồi liposome đệm HBS Đánh giá ảnh hưởng môi trường liposome đến thay đổi KTTP PDI ta có bảng sau: Bảng 3.11: Sự thay đổi KTTP, PDI qua thời gian hệ môi trường hydrat: đệm citrat pH 4.0 trước sau đổi môi trường bên ngồi Ngày CB/ CB Mơi trường CB/ HBS CB/ HBG CB/ H2O Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI 124.1 126.2 136.2 150.1 211.6 0.187 0.19 0.196 0.261 0.332 _ 125.2 127.4 144.7 156.9 _ 0.184 0.188 0.210 0.243 _ 125.3 126.3 128.3 130.8 _ 0.187 0.191 0.193 0.197 _ 127.3 128.1 134.6 147.5 _ 0.185 0.190 0.214 0.245 14 30 Nhận xét: - Đối với mẫu có mơi trường ngồi đệm citrat có KTTP tăng từ 124.1 nm lên 211.6 nm giá trị PDI tăng từ 0.187 lên 0.332 theo thời gian pH 31 thấp s làm gia tăng thủy phân phospholipid Do khơng phải môi trường tốt để bảo quản liposome - Khi tiến hành thẩm tích để đổi mơi trường bên ngồi liposome sang hệ mơi trường có pH cao cho thấy hệ có xu hướng ổn định Khơng có thay đổi nhiều KTTP PDI sau thẩm tích, khoảng KTTP nằm khoảng 124.1- 127.3 nm, PDI 0.2 - Trong thời gian bảo quản, mẫu có mơi trường bên ngồi liposome nước HBS có gia tăng KTTP giá trị PDI đo lớn 0.24 Mẫu có mơi trường bên ngồi đệm HBG khơng có tăng nhiều KTTP PDI (nhỏ 0.2) cho thấy hệ ổn định Đánh giá thêm ổn định mẫu qua việc đo zeta ta có đồ thị sau: Hình 3.4: Sự thay đổi điện zeta theo thời gian mẫu có hệ mơi trường hydrat đệm Citrat pH 4.0 (CB) Dựa vào đồ thị ta nhận thấy: - Mẫu có mơi trường ngồi đệm citrat zeta gần nên ổn định, điều chứng minh qua gia tăng KTTP PDI Do mẫu liposome không nên bảo quản môi trường pH thấp đệm citrate - Khi thay đổi môi trường bên ngồi liposome hệ có xu hướng ổn định có thay đổi điện tích từ (+) sang (-) Điều pH thấp, nhóm PO4- trạng thái khơng phân li có nhóm N bậc tích điện dương làm bề mặt liposome chuyển sang tích điện dương Khi đổi mơi trường bên ngồi liposome sang pH cao bề mặt liposome hấp phụ ion âm chuyển sang tích điện âm (do hấp phụ thừa ion âm môi trường) - Trong công thức khảo sát, hệ đệm HBS zeta cao đệm HBG hệ đệm HBS có ion Cl – làm giảm bề dày lớp khuyếch tán (hệ liposome nước có bề mặt tích điện âm nên lớp khuếch tán lớp ion (+)) làm zeta bớt âm (tức zeta cao hơn) Điều chứng tỏ qua tăng nhanh KTTP PDI thời gian bảo quản Do với liposome chứa môi trường bên đệm citrat mơi trường bên ngồi đệm HBG s ổn định zeta gần -30 mV 32 3.3.4 Hệ môi trường hydrat: đệm amoni pH 4.0 (AmB – amoni buffer) Đối với hệ có mơi trường bên bên ngồi nước, tiến hành thẩm tích đổi mơi trường bên ngồi liposome thành nước cất, đệm HBG HBS, ta có bảng sau: Quy trình đổi hệ mơi trường bên ngồi liposome Các hệ Mơi trường ngồi liposome AmB/ AmB Mơi trường ngồi liposome đệm amoni AmB/ H2O Mơi trường đệm amoni liposome nước AmB/ HBG Mơi trường đệm amoni ngồi liposome đệm HBG AmB/ HBS Môi trường đệm amoni liposome đệm HBS Đánh giá ảnh hưởng mơi trường ngồi liposome đến thay đổi KTTP PDI ta có bảng sau: Bảng 3.12: Sự thay đổi KTTP, PDI qua thời gian hệ môi trường hydrat: đệm amoni pH 5.5 trước sau đổi mơi trường bên ngồi Mơi trường Ngày AmB/ AmB AmB/ HBS AmB/ HBG AmB/ H2O Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI 89.54 0.160 _ _ _ _ _ _ 97.23 0.170 88.72 0.174 103.7 0.187 100.4 0.170 96.31 0.186 90.23 0.198 104.01 0.187 102.1 0.189 14 95.32 0.176 91.47 0.196 108.4 0.198 112 0.191 30 99.64 0.197 93.27 0.200 120.2 0.242 116.4 0.210 Nhận xét: - Đối với mẫu có mơi trường bên ngồi liposome đệm amoni có KTTP PDI tăng theo thời gian, KTTP tăng không nhiều 14 ngày bảo quản, nhiên đến ngày 30 KTTP tăng lên 99.64 nm PDI tăng từ 0.160 ngày lên 0.197 - Sau đổi môi trường bên ngồi sang hệ có pH cao nhận thấy: hệ hệ đệm HBG có gia tăng KTTP từ 103.7 nm lên 120.2 nm PDI tăng từ 0.187 lên 0.242 theo thời gian Hệ đệm HBS có KTTP nhỏ nhất, PDI 0.2 Tiếp tục đánh giá ổn định mẫu qua thay đổi giá trị zeta qua đồ thị sau: 33 Hình 3.5: Sự thay đổi điện zeta theo thời gian mẫu có hệ mơi trường hydrat đệm Amoni pH 5.5 (AmB) Dựa vào đồ thị ta nhận thấy: - Đối với hệ môi trường liposome đệm amoni, giá trị đo zeta khơng có giảm xuống theo thời gian, từ +12.8 mV xuống +10.3 mV Cùng với thay đổi KTTP PDI theo thời gian, nhận thấy môi trường bên ngồi đệm amoni khơng phải thích hợp để bảo quản liposome - Khi đổi môi trường bên ngồi liposome sang hệ mơi trường khác nhau, ta nhận thấy có thay đổi điện tích từ (+) sang (-) bề mặt liposome hấp phụ ion (-) môi trường - Trong công thức khảo sát hệ đệm ngồi HBS cho zeta dao động không nhiều theo thời gian âm Dựa vào thay đổi đặc tính tiểu phân mẫu, với mơi trường bên đệm amoni pH 5.5 mơi trường bên đệm HBS s cho mẫu ổn định 3.3.5 Môi trường hydrat: dung dịch Glucose 5% (Glu) Đối với hệ có mơi trường bên bên ngồi nước, tiến hành thẩm tích đổi mơi trường bên ngồi liposome thành nước cất, HBS, ta có bảng sau: Quy trình đổi hệ mơi trường bên ngồi liposome Các hệ Mơi trường ngồi liposome Glu/ Glu Mơi trường ngồi liposome dung dịch Glucose 5% Glu/ H2O Môi trường dung dịch Glucose ngồi liposome nước H2O/ HBS Mơi trường dung dịch Glucose liposome đệm HBS Đánh giá ảnh hưởng mơi trường ngồi liposome đến thay đổi KTTP PDI ta có bảng sau: 34 Bảng 3.13: Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian hệ môi trường hydrat: Glucose 5% trước sau đổi mơi trường bên ngồi Mơi trường Ngày Glu / Glu Glu/ HBS Glu / H2O Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI 119.5 0.192 _ _ _ _ 125.3 0.217 118.9 0.176 117.5 0.178 123.7 0.239 120.1 0.199 118.7 0.174 14 130.4 0.423 120.9 0.231 120.4 0.218 30 147.5 0.476 121.5 0.247 124.3 0.229 Nhận xét: - Đối với hệ mơi trường ngồi liposome dung dịch Glucose 5% có tăng nhanh KTTP từ 119.5 nm lên 147.5 nm giá trị PDI tăng từ 0.192 lên 0.476 thời gian bảo quản - Tiến hành đổi mơi trường bên ngồi liposome nhận thấy trình bảo quản mẫu có gia tăng KTTP khoảng 120 nm giá trị PDI lớn 0.2 Tiếp tục đánh giá ổn định mẫu qua thay đổi giá trị zeta qua đồ thị sau: Hình 3.6: Sự thay đổi KTTP giá trị PDI theo thời gian mẫu có hệ mơi trường hydrat dung dịch Glucose 5% (Glu) Dựa vào đồ thị ta nhận thấy: - Với mơi trường ngồi liposome dung dịch Glucose có tăng điện zeta từ -12.9 mV lên -9.35 mV theo thời gian Do mơi trường bên ngồi Glucose khơng phải thích hợp để bảo quản mẫu - Sau đổi hệ môi trường bên ngồi liposome sang mơi trường khác ta nhận thấy với mơi trường ngồi nước cất zeta âm thay đổi không nhiều theo thời gian từ -27.7 mV đến -26 mV 35 Do với mẫu liposome có mơi trường dung dịch Glucose mơi trường bên ngồi nước cất s cho mẫu ổn định 3.3.6 Môi trường hydrat: dung dịch Saccarose 10% (Sac) Do mẫu có mơi trường hydrat dung dịch Saccarose 10% có KTTP lớn, PDI cao, hệ có xu hướng kết tập, không ổn định nên không tiếp tục tiến hành đổi hệ đệm bên ngồi liposome 3.3.7 Mơi trường hydrat: dung dịch NaCl 0.9 % (NaCl) Đối với hệ có mơi trường bên bên ngồi dung dịch NaCl 0.9%, tiến hành thẩm tích đổi mơi trường bên ngồi liposome ta có hệ mơi trường sau: Các hệ Mơi trường ngồi liposome NaCl/ NaCl Mơi trường ngồi liposome dung dịch NaCl 0,9 % Môi trường dung dịch NaCl ngồi liposome nước NaCl/ H2O NaCl/ HBG Mơi trường dung dịch NaCl liposome đệm HBG Đánh giá ảnh hưởng môi trường liposome đến thay đổi KTTP PDI ta có bảng sau: Bảng 3.14: Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian hệ môi trường hydrat NaCl 0,9% trước sau đổi mơi trường bên ngồi Ngày Môi trường NaCl/ H2O NaCl/ NaCl NaCl/ HBG Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI 108.6 0.29 _ _ _ _ 105.7 0.233 119.5 0.298 110.3 0.45 121.3 0.34 112.5 0.31 # # 14 181.8 0.432 126.1 0.409 # # 30 # # 140.8 0.465 # # Chú thích: ##: mẫu có giá trị KTTP >1500 nm, PDI khơng xác định _: khơng có giá trị chưa có mẫu Nhận xét: - Mẫu có mơi trường ngồi dung dịch NaCl 0,9% có tăng nhanh KTTP giá trị PDI theo thời gian Đặc biệt quan sát mắt mẫu có tượng lắng cặn, kết tập tiểu phân đáy lọ sau nửa tháng Do hệ khơng ổn định 36 - Sau thay đổi môi trường bên liposome ta nhận thấy hệ đệm đệm HBG cho giá trị KTTP PDI cao xuất kết tập tiểu phân đáy lọ theo thời gian Với mơi trường bên ngồi liposome nước cất, KTTP PDI tăng dần từ 119.5 nm lên 140.8 nm PDI tăng từ 0.298 lên 0.265 Tiếp tục đánh giá ổn định mẫu qua thay đổi giá trị zeta qua đồ thị sau: Hình 3.7: Sự thay đổi KTTP giá trị PDI theo thời gian mẫu có hệ mơi trường hydrat dung dịch NaCl 0.9% (NaCl) Dựa vào đồ thị ta nhận thấy: - Các mẫu có mơi trường bên ngồi dung dịch NaCl 0.9% đệm HBG có giá trị zeta tiệm cận mẫu khơng ổn định Điều minh chứng qua việc đo KTTP vầ PDI mẫu - Với môi trường bên ngồi nước, có tăng dần điện theo thời gian bảo quản từ -20.4 mV lên -10.5 mV Điều cho thấy hệ khơng ổn định theo thời gian Vì vậy, với liposome có mơi trường hydrat hóa dung dịch NaCl 0,9% cho mẫu không ổn định trước sau tiến hành đổi hệ đệm 3.3.8 Hệ môi trường hydrat: đệm Phosphat NaCl pH 7.4 (PBS) Đối với môi trường hydrat đệm Phosphat NaCl, khơng tiến hành đổi hệ đệm bên ngồi ta s có mơi trường ngồi liposome s đệm PBS/ PBS Đánh giá thay đổi KTTP, PDI điện zeta theo thời gian ta có bảng sau: 37 Bảng 3.15: Sự thay đổi KTTP, PDI điện zeta theo thời gian hệ môi trường hydrat: đệm PO4/ NaCl pH 7.4 Ngày 14 30 Môi trường hydrat : đệm PO4/ NaCl pH 7.4 Z- average (d.nm) PDI Zeta (mV) 80.9 0.159 -30.7 81.1 0.164 -30.8 84.0 0.167 -29.5 92.0 0.178 -27.9 93.6 0.181 -27.6 Nhận xét: mơi trường hydrat hóa đệm phosphat NaCl, sau thời gian bảo quản có tăng KTTP từ 80.9 nm lên 93.6 nm, giá trị PDI tăng dần từ 0.159 lên 0.181 Điện zeta tăng từ -30.7 mV lên -27.6 mV Tuy nhiên hệ ổn định 38 Chương - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Nghiên cứu đạt kết sau: Với dung dịch hydrat khác s có quy trình giảm đồng kích thước khác Đánh giá ảnh hưởng môi trường ngồi khác đến đặc tính tiểu phân, từ nhận thấy với mơi trường bên khác s có mơi trường bên ngồi phù hợp để bảo quản mẫu liposome cho độ ổn định tốt thời gian bảo quản tháng là: Mơi trường Mơi trường ngồi KTTP (nm) PDI Zeta (mV) Nước Nước 73.6 0.158 -27.5 Đệm acetat pH 4.0 Nước 80.7 0.196 -30.8 Đệm citrat pH 4.0 Đệm HBG 130.8 0.197 -28.7 Đệm amoni pH 5.5 Đệm HBS 93.27 0.200 27.2 Dung dịch glucose 5% Nước 124.3 0.229 -26.0 Đệm PO4/ NaCl pH 7.4 Đệm PO4/ NaCl pH 7.4 93.6 0.181 -27.6 Trong hệ môi trường ngồi khác nhau, chọn hệ có mơi trường đệm acetat pH 4.0 bên nước cất cho hệ ổn định theo thời gian Các mẫu có mơi trường hydrat dung dịch NaCl 0,9%, dung dịch saccarose 10% cho hệ không ổn định trước sau đổi môi trường bên ĐỀ XUẤT Tiếp tục nghiên cứu tương tác mơi trường ngồi khác để cải thiện độ ổn định cho chế phẩm liposome Từ liposome bào chế ra, tiếp tục quy trình nạp loại dược chất khác vào liposome Tiếp đánh giá hiệu suất liposome hóa, hiệu mang thuốc chế phẩm liposome mơ hình in vivo đánh giá độc tính thuốc dòng tế bào khác 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Chí Đức Anh (2012), “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr – 30 Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2014), “Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc” (tập 2), NXB Y học, tr 218 -230 Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2005), “Một số chuyên đề bào chế đại”, NXB Y học, tr 158 – 187 Phạm Thị Minh Huệ, Võ Xuân Minh (2013), “Kỹ thuật nano liposome ứng dụng dược học mỹ phẩm”, NXB Y học, tr 50 – 93 Nguyễn Văn Lâm (2012), “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin đánh giá tác dụng động vật”, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr – 32 Lê Phương Linh (2013), “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng liposome doxorubicin”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr – 41 Nguyễn Thị Phương Thảo (2015), “Nghiên cứu bào chế đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa khối u động vật thực nghiệm”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr – 50 Nguyễn Thu Trang (2014),” Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin 2mg/ 10ml phương pháp pha lỗng etanol”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr –25 Đào Thanh Tùng (2012), “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin”, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr – 42 Tài liệu Tiếng Anh 10 Akbarzadeh A, Samiei M, Davaran S (2012), “Magnetic Nanoparticles: preparation, physical properties, and applications in biomedicine”, Nanoscale Res Lett; pp 7-144 10 Allen M., Pieter R (2013), “Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications”, Advanced Drug Delivery Reviews 65, pp 36–48 11 Al-Jamal W T., Al-Ahmady Z S., Kostarelos K (2012), "Pharmacokinetics & tissue distribution of temperature-sensitive liposomal doxorubicin in tumor- bearing mice triggered with mild hyperthermia", Biomaterials, 33(18), pp 4608-4617 12 Andri H., Li Ying H (2014),“Magnetic liposomes for colorectal cancer cells therapy by high-frequency magnetic field treatment”, Nanoscale Research Letters, pp - 497 13 Arcadio C, Cullis PR (1995), “Recent advances in liposomal drug-delivery systems”, Curr Opin Biotechnol, pp 698–708 14 Bangham AD, Hornre RW (1964) ‘Negative staining of phospholipid and their structural modification by surface –active agents as observed in the electron microscope’, J Mol Biol 8, pp 660-668 15 Barenholz Y et al., (1993), "Stability of liposomal doxorubicin formulations: problems and prospects", Medicinal research reviews, 13(4), pp 449-491 16 Barenholz Y (2013), “Relevancy of Drug Loading to Liposomal Formulation Therapeutic and Efficacy”, J Liposome Res, pp 1-8 17 Betageri G., Parsons D (1992), "Drug encapsulation and release from multilamellar and unilamellar liposomes", International journal of pharmaceutics, 81(2-3), pp 235-241 18 Chiu G N et al., (2005), "Encapsulation of doxorubicin into thermosensitive liposomes via complexation with the transition metal manganese", Journal of controlled release, 104(2), pp 271-288 19 Deepika S., Vaseem A (2016), “Development of liposomal cosmeceuticals”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 8(2), pp 834-838 20 Deepthi V and Kavitha AN (2014), “Liposomal Drug Delivery System-A Review”, RGUHS J Pharm Sci | Vol | Issue 2, pp 47- 56 21 Domazou A S., Luisi P L (2002), “Size distribution of spontaneously formed liposomes by the alcohol injection method”, Journal of Liposomes Research, 22(1), pp 205 – 220 22 Elisa Elizondo, Evelyn M (2011), “Liposomes and other vesicular systems: structural characteristics, methods of preparation and use in Nanomedicine”, Progress in molecular Biology and translational Science Vol.104, pp 2-43 23 Fang J., Nakamura H., Maeda H (2011), “The EPR effect: Unique features of tumor blood vessels for drug delivery, factors involved, and limitations and augmentation of the effect”, Adv Drug Deliv Rev 63, pp 136-151 24 Fernando Augusto Pires de Sáa (2015), “Liposomal voriconazole (VOR) formulation for improved oculardelivery”,Colloids and Surfaces Biointerfaces,133 , pp331–338 25 Grit M., Crommelin D J., (1993), "Chemical stability of liposomes: implications for their physical stability", Chemistry and physics of lipids, 64(1), pp 3-18 26 Hemanthkumar M, Spandana V.(2011), “ Liposomal encapsulation technology a novel drug delivery system designed for ayurvedic drug preparation”, IRJP 2011 2(10), pp 4–7 27 Himanshu A, Sitasharan P, Singhai AK, (2011), “Liposomes as drug carriers”, IJPLS 2(7), pp 945–951 28 Ishida Tatsuhiro, Harashima Hideyoshi, Kiwada Hiroshi (2002), "Liposome clearance", Bioscience reports, 22, pp 197-224 29 Kisel M., Kulik L (2001), “Liposomes with phosphatidylethanol as acarrierfor oral delivery of insulin Studies in the rat”, Inter.J.Pharm, pp 105- 206 30 Klibanov A L., Shevchenko T I., Raju B I., Seip R., Chin C T (2010), "Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble– liposome constructs: A tool for targeted drug delivery", Journal of Controlled Release, 148(1), pp 13-17 31 Koshkina NV, Waldrep JC, Roberts LE (2001), “Paclitaxel liposome aerosol treatment induces inhibition of pulmonary metastases in murine renal carcinoma model”, Clin Cancer Res 7, pp 3258-3262 32 L Lesoin, O Boutin, C Crampon, et al (2011), “CO2/water/surfactant ternary systems and liposome formation using supercritical CO2: a review”, Colloids Surf Physicochem Eng Asp, 377, pp 1–14 33 Ling S., Magosso E (2016), “Enhanced oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of a hydrophilic drug using liposomes”, DrugDev.Ind.Pharm 32, pp 335–345 34 Mayer ID, Madden TM, Bally MU, Cullis PR (1993), “pH gradient-mediated drug entrapment in liposomes”, Liposome Technology; pp 27–44 35 Mehran Alavi, Naser Karimi, Mohsen Safaei (2017), “Application of Various Types of Liposomes in Drug Delivery Systems”, Adv Pharm Bull, 7(1), pp 3-9 36 Nagayasu A, Uchiyama K, Kiwada H (1990), “The size of liposomes: a factor which affects their targeting efficiency to tumors and therapeutic activity of liposomal antitumor drugs”, Adv Drug Deliv Rev 40, pp 75–87 37 Needham D., Park J Y., Wright A., Tong J (2012), "Materials Characterization of the Low Temperature Sensitive Liposome (LTSL): Effects of Lipid Composition (Lysolipid and DSPE-PEG2000) on the Thermal Transition and Release of Doxorubicin", Faraday Discussions, pp 67- 72 38 NikitaLomis, Susan W., et al (2016), “Human Serum Albumin Nanoparticles for Use in Cancer Drug Delivery: Process Optimization and invitro cheracterization”, Nanomaterials 2016, 6, pp 1-16 39 Olga P., Jana S , Zoran K , Vesna R (2013), “Methods for Preparation and Characterization of Liposomes as Drug Delivery Systems”, Int J Pharm Phytopharmacol Res (3), pp 182-189 40 Prathyusha, Muthukumaran M., Krishnamoorthy B (2013), “Liposomes as targetted drug delivery systems present and future prospectives: a review”, Journal of Drug Delivery & Therapeutics, 3(4), pp 195-201 41 Ray A (2012), "Liposome in Drug delivery system", Asian J Res Pharm Sci, 2(2), pp 41-44 42 Riaz M (1996), “Liposome preparation method”, Pak J Pharm Sci 9(1), pp.65– 77 43 Samad A., Sultana Y., Aqil M (2007), "Liposomal drug delivery systems: an update review", Current drug delivery, 4(4), pp 297-305 44 Schroeder A., Kost J., Barenholz Y (2009), "Ultrasound, liposomes, and drug delivery: principles for using ultrasound to control the release of drugs from liposomes", Chemistry and Physics of Lipids, 162(1-2), pp 1-16 45 Scholtz J., Potchefstroom (2010), “Preparation, Stability and in Vitro Evaluation of Liposomes Containing Amodiaquine”, Boloka institutional repository, pp 69-72 46 Seynhaeve A L., Hoving S., Schipper D., Vermeulen C E., Aan De WielAmbagtsheer G , Van Tiel S T , et al (2007), "Tumor necrosis factor α mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response", Cancer research, 67(19), pp 9455-9462 47 Sheeshpal Sharma, Lishu Mishra (2010), “Liposomes: vesicular system an overview”, J Pharm Pharm Sci, Vol 2, Issue 4, pp 11­17 48 Storm G., Crommelin D J A (1998), “Liposome: quo vadis”, Pharmaceutical Science & Technology today, 1(1), pp 19 – 31 49 Su, C.W., Chiang, C.S., Li, W.M., Hu, S.H., Chen, S.Y.(2014), “Multifunctional nanocarriers for simultaneous encapsulation of hydrophobic and hydrophilic drugs in cancer treatment”, Nano medicine (Lond) 9, pp1499-1511" 50 Torchilin V (2011), "Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect", Advanced Drug Delivery Reviews, 63(3), pp.131-135 51 Torchilin V P (2005), "Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers", Nature Reviews Drug Discovery, 4(2), pp 145-160 52 Valizadeh A, Mikaeili H, Samiei M, Mussa Farkhani (2012), “Synthesis, bioapplications, and toxicity”, Nanoscale Res Lett.7, pp 480- 487 53 Vonarbourg Arnaud, Passirani Catherine, Saulnier Patrick, Benoit Jean-Pierre (2006), "Parameters influencing the stealthiness of colloidal drug delivery systems", Biomaterials, 27(24), pp 4356-4373 RES 54 Xu X., Khan M A., Burgess D J (2012), "Predicting hydrophilic drug encapsulation inside unilamellar liposomes", International journal of pharmaceutics, 423(2), pp 410-418 55 Xu X., Burgess D J (2012), "Liposomes as carriers for controlled drug delivery, Long Acting Injections and Implants”, Springer, pp 195-220 56 Yaganesh V., Marcus A (2012), “Nanomedicine for glaucoma: liposomes provide sustained release of Latanoprost in the eye”, International Journal of Nanomedicine, pp 123 -131 57 Yarenholz B, (2003), “Relevancy of drug loading to liposomal formulation therapeutic efficacy”, J Liposome Res, 13, pp 1–8 58 Ying Li, Yanping L (2015), “Cell and nanoparticle transport in tumour microvasculature: the role of size, shape and surface functionality of nanoparticles”, Interface forcus 6, pp.1-13 59 Zalba S., Navarro I., Trocóniz I F., Tros De Ilarduya C., Garrido M J (2012), "Application of different methods to formulate PEG-liposomes of oxaliplatin: Evaluation invivo", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 81(2), pp 273-280 60 Zhenjun HUANG, Xuan LI, Ting ZHANG (2014), “Progress involving new techniques for liposome preparation”, Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, pp 1-12