Mục tiêu nghiên cứu của luận án nhằm đánh giá được sự đa dạng di truyền gà Liên Minh sử dụng trình tự nucleotide D-loop ADN ty thể và xác định mối quan hệ di truyền, xuất xứ của gà Liên Minh. Xác định được mối liên quan di truyền giữa các gen ứng viên (PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR) với tính trạng năng suất trứng ở gà Liên Minh.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ BÌNH NGUN ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN VÀ PHÂN TÍCH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT TRỨNG Ở GIỐNG GÀ LIÊN MINH Chuyên ngành Mã số : Cơng nghệ sinh học : 9420201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP Hà Nội, 2019 Cơng trình hồn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Diệu Thúy TS Nguyễn Hữu Đức Phản biện 1: ……………………………………………… Phản biện ……………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp viện họp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam - Thư viện DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Tran Thi Binh Nguyen, Nguyen Huu Duc, Do Vo Anh Khoa, Nguyen Thi Dieu Thuy (2018), “Effect of nucleotide polymorphism of candidate genes on egg production traits in native Lien Minh chicken”, Livestock Research for Rural Development 30(6) Tran Thi Binh Nguyen, Nguyen Huu Duc, Vu Duc Quy, Pham Thu Giang, Nguyen Manh Linh, Dinh Thi Ngoc Thuy, Nguyen Thi Dieu Thuy (2018) “Polymorphism in candidate genes of Lien Minh chicken”, Vietnam Journal of Agricultural Sciences 1(2), tr 174-182 Trần Thị Bình Nguyên, Nguyễn Hùng Cường, Vũ Thị Tiến, Tạ Thị Loan, Đỗ Võ Anh Khoa, Nguyễn Thị Diệu Thuý (2018).,“Đa hình gen Neuropeptide y (NPY) liên quan tính trạng suất trứng gà Liên Minh”, Hội nghị khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Hà Nội 26/10/2018, tr 1828-1833 Trần Thị Bình Nguyên, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Diệu Thuý (2018), ”Đa hình gen prolactin liên quan tính trạng sản xuất trứng giống gà liên Minh”, Tạp chí cơng nghệ sinh học, 16(2), tr 1-8 Trần Thị Bình Nguyên, Đỗ Thị Liễu, Nguyễn Hữu Đức, Hồng Thị Yến, Vũ Cơng Quy, Nguyễn Hùng Cường Nguyễn Thị Diệu Thúy (2016),” Khả sinh sản đa hình ứng cử gen liên quan tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật chăn nuôi, số 212, tr 2-8 MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Gà Liên Minh giống gà địa huyện đảo Cát Hải, thành phố Hải Phòng, Việt Nam Gà Liên Minh thích hợp với ni chăn thả, chịu đựng tốt điều kiện thức ăn nghèo dinh dưỡng, khả đề kháng cao Nhu cầu thị trường giống sản phẩm thịt gà Liên Minh lớn Tuy nhiên, khả sinh sản gà Liên Minh thấp, nghiên cứu 30 hộ xã Trân Châu, huyện Cát Hải, thành phố Hải Phòng gà Liên Minh nuôi hộ theo phương thức chăn thả có tuổi thành thục muộn (đẻ trứng 197,5 ngày tuổi) sản lượng trứng thấp (75,6 quả/mái/năm) (Doan BH et al, 2016) Trong lúc sản lượng trứng gà Ri hoa mơ 38 tuần tuổi đạt 58,99 quả/mái (Ngô Thị Kim Cúc cs, 2014) Vì vậy, vấn đề cải thiện suất trứng gà Liên Minh cấp thiết nhằm bảo tồn, khai thác phát triển giống gà Liên Minh Sản lượng trứng gà kết tác động từ yếu tố: Di truyền, dinh dưỡng, ánh sáng, chế độ chăm sóc thú y Hiện nay, đa hình gen nghiên cứu nhằm cải thiện đặc điểm kinh tế gà địa Các đa hình gen PRL (Prolactin), VIP (Vasoactive Intestinal Peptide), VIPR1 (Vasoactive Intestinal Peptide Receptor 1), NPY (Neuropeptide Y), GH (Growth hormone) GHR (Growth hormone receptor), xác định liên quan đến khả sinh sản số giống gà địa giới Một số đa hình gen ứng dụng chị thị ADN, nhằm cải thiện suất trứng gà địa Mặt khác, chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng nguồn gen dựa trình tự nucleotide vùng D-loop gen ty thể gà Liên Minh Kết nghiên cứu sử dụng nhằm cung cấp thông tin đa dạng di truyền, hỗ trợ cho việc đăng ký quyền giống gà Liên Minh, đồng thời góp phần xây dựng tranh tồn cảnh mức độ đa dạng di truyền giống gà địa Vì vậy, Đánh giá nguồn gen phân tích thị phân tử liên quan tính trạng suất trứng giống gà Liên Minh nhằm cung cấp thông tin di truyền vùng Dloop gen ty thể gen ứng viên cải thiện khả sản xuất trứng, hỗ trợ công tác bảo tồn khai thác phát triển giống gà Liên Minh MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Đánh giá đa dạng di truyền gà Liên Minh sử dụng trình tự nucleotide D-loop ADN ty thể xác định mối quan hệ di truyền, xuất xứ gà Liên Minh - Xác định mối liên quan di truyền gen ứng viên (PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR) với tính trạng suất trứng gà Liên Minh Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 3.1 Ý nghĩa khoa học Cung cấp thông tin khoa học trình tự nucleotide vùng D-loop gen ty thể giống gà Liên Minh Tài liệu khoa học nghiên cứu tần số xuất alen/kiểu gen đa hình gen PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR đối tượng gà Liên Minh; bước đầu đánh giá mối liên quan đa hình gen PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR với khả sản xuất trứng Kết nghiên cứu tính đa hình gen ứng viên với tính trạng sản lượng trứng sở khoa học nghiên cứu ứng dụng thị phân tử hỗ trợ chọn lọc gà Liên Minh có suất trứng cao, đồng thời cung cấp thơng tin gà Liên Minh cho nhà chọn giống, tài liệu tham khảo cho nhà nghiên cứu, sinh viên người quan tâm gà địa 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp sở khoa học góp phần xây dựng thương hiệu gà Liên Minh Cung cấp thơng tin có khoa học để quảng bá phát triển thị trường tiêu thụ sản phẩm đặc sản gà Liên Minh Cung cấp thông tin để Trung tâm ứng dụng tiến Khoa học Cơng nghệ Hải phịng, cơng ty, sở chăn nuôi hỗ trợ chọn lọc đàn gà Liên Minh hạt nhân cãi thiện sản lượng trứng NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Đánh giá nguồn gen gà Liên Minh: Phân tích trình tự nucleotide vùng D-loop gen ty thể gà Liên Minh để đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen - Xác định tần số alen/kiểu gen gà Liên Minh: Đã xác định tần số alen/kiểu gen PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR gà Liên Minh - Đánh giá mối liên quan đa hình gen tính trạng suất trứng: Nghiên cứu giống gà Liên Minh mối liên quan đa hình gen PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH, GHR với khả sản xuất trứng ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 5.1 Đối tượng nghiên cứu Gà địa Liên Minh thuộc Thôn Liên Minh - Xã Trân Châu - Huyện Cát Hải Thành phố Hải Phòng 5.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài ứng dụng công nghệ sinh học công cụ tin sinh học để phân tích đa dạng di truyền gà Liên Minh, phục vụ công tác bảo tồn, khai thác phát triển giống gà Liên Minh Đề tài tập trung nghiên cứu gen ứng viên liên quan đến khả sản xuất trứng, từ xác định gen mục tiêu, phục vụ công tác chọn lọc giống gà Liên Minh có suất trứng cao Bố cục luận án Luận án trình bày 107 trang (không kể phần tài liệu tham khảo phụ lục): Mở đầu (3 trang); chương 1: Tổng quan tài liệu (36 trang); chương 2: Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu (13 trang); chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận (61 trang); Kết luận đề nghị (2 trang) Tài liệu tham khảo sử dụng 177, có 32 tài liệu tiếng Việt 145 tài liệu tiếng Anh Luận án có 34 bảng, 44 hình, phụ lục, cơng trình cơng bố CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án sử dụng phân tích 33 tài liệu tham khảo tiếng Việt 147 tài liệu tiếng Anh, liên quan đến nội dung sau: Ty thể (Mitochondria) bào quan có mặt hầu hết tất sinh vật nhân chuẩn, với gen riêng kích thước gen phân tử khoảng 16 kb DNA ty thể với đặc điểm: i) số lượng lớn; ii) tồn dạng đơn bội khơng có tượng tái tổ hợp; iii) tốc độ đột biến tương đối nhanh (so với locus hệ gene nhân) iv) di truyền theo dịng mẹ phần lớn lồi, sử dụng cơng cụ phân tích mối quan hệ tiến hố đánh giá biến đổi di truyền loài (Harpending et al., 1998) Trình tự nucleotide vùng D-loop vùng có mức độ tiến hóa nhanh so với vùng khác mtDNA, vùng thích hợp phân tích đa dạng di truyền quần thể, đặc biệt thay đổi bên loài Để cải thiện khả sinh sản gà Liên Minh cần nghiên cứu mối liên quan đặc điểm sinh sản với gen ứng viên Các gen ứng viên lựa chọn xuất phát từ kiến thức sinh lý sinh sản báo cáo ảnh hưởng gen ứng viên đến khả sinh sản dòng gia cầm thương mại Hormone prolactin polypeptide tiết tuyến yên trước, có liên quan có ảnh hưởng lớn tới sinh lý như: Điều hịa thẩm thấu, luteolysis (buồng trứng thối hóa), kiểm sốt trì hành vi địi ấp gà mái Các nghiên cứu PRL xuất vùng đồi, tuyến yên, ống dẫn trứng trứng, với mức độ cao tìm thấy tuyến yên (Li cs, 2009a) Ở gà, hormone prolactin hormone đóng vai trò quan trọng sản xuất trứng Nồng độ prolactin tăng mạnh huyết tương, gây hành vi ấp trứng (Sockman cs, 2000) dẫn đến giảm sản xuất trứng (Reddy cs, 2002) Một đột biến xảy vùng điều khiển (promotor) ảnh hưởng đến biểu gen PRL, ảnh hưởng đến sản xuất trứng Sự tiết prolactin chim chủ yếu điều hòa yếu tố giải phóng, số peptite Vasoactive (Kagya-Agyemang cs, 2012) Peptite Vasoactive (VIP) yếu tố giải phóng prolactin chim (ElL Halawani et al.et al., 1990; 1997) Neuropeptide Y (NPY) chất điều chế thần kinh quan trọng, có liên quan đến chức tuyến sinh dục chim động vật có vú (Hilal et al.et al., 1996) NPY ảnh hưởng đến tốc độ sản xuất trứng thơng qua vai trị kiểm sốt rụng trứng (Dunn et al.et al., 2004) Gen mã hóa neuropeptite Y liên quan đến tuổi thành thục sinh dục sản lượng trứng (Xu cs, 2011a; Xu cs, 2011a; Dunn cs, 2004; Li cs, 2009b) Gen NPY tạo dấu hiệu cho tuổi bắt đầu đẻ thơng qua vai trị việc kiểm sốt rụng trứng, ảnh hưởng đến tốc độ sản xuất trứng Tiêm NPY làm thay đổi nồng độ hormone luteinizing hormone tăng trưởng huyết tương (Pierroz et al.et al., 1996) Hormon tăng trưởng (GH), kết hợp với thụ thể hc mơn tăng trưởng hình thành đường dẫn tín hiệu GH-GHRIGFs, ảnh hưởng đến phát triển gà (Lau et al.et al., 2007) Các thụ thể hormone tăng trưởng (GHR) kiểm soát số lượng nang trứng động vật vào giai đoạn tăng trưởng nhanh (Roberts et al.et al., 1994; Monget et al.et al., 2002) Vì nghiên sử dụng trình tự nucleotide vùng D-loop để đánh giá đa dạng nguồn gen gà Liên Minh Đồng thời sử dụng gen ứng viên liên quan đến khả sinh sản nhằm tìm đa hình gen có liên quan đến khả sản xuất trứng gà Liên Minh CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật Liệu 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1.1 Mẫu dùng để phân tích đa dạng nguồn gen Thu mẫu máu gà Liên Minh hộ gia đình thuộc thơn Liên Minh để phân tích đa dạng di truyền (2015) Các cá thể gà Liên Minh lựa chọn dựa tiêu chí: Hạn chế quan hệ huyết thống (từ hộ nuôi khác thuộc thôn Liên Minh, xã Trân Châu, huyện Cát Hải, Hải Phòng), gà trống (n=12 cá thể) gà mái (n=12 cá thể), cá thể trưởng thành mang đặc điểm đặc trưng giống, xác nhận chuyên gia giống tham gia đề tài “Khai thác phát triển giống gà Liên Minh Hải Phòng" định số 2398/QĐ-BKHCN ngày 31/8/2012 Bộ trưởng Bộ Khoa học Cơng nghệ Ngồi ra, hai giống gà địa gà Đông Tảo – GDT (n=18) Gà Nhiều Ngón – GNN (n=6) thu mẫu từ địa phương nơi nguồn gốc chúng (Huyện Khoái Châu, Hưng Yên Vườn Quốc gia Xuân Sơn, Phú Thọ) 2.1.1.2 Mẫu dùng đánh giá mối liên quan đa hình gen ứng viên với tính trạng suất trứng Thu trứng gà Liên Minh gia đình thuộc thơn Liên Minh, ấp nở, chăm sóc, tiêm phòng theo dõi Trung tâm ứng dụng tiến KH&CN thành phố Hải Phịng theo hình thức cá thể từ lúc nở (01 ngày tuổi) đến 44 tuần tuổi Gà Liên Minh chăm sóc thú y, dinh dưỡng, môi trường giống theo dõi đặc điểm liên quan đến tính trạng sản xuất trứng 2.1.1.3 Danh sách mồi sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2 Thơng tin mồi sử dụng phân tích trình tự nucleotide Gen Vùng Ty thể D-loop Trình tự mồi [5’ -3’] Kích thước [bp] F: AGGACTACGGCTTGAAAAGC 1321 R: CATCTTGGCATCTTCAGTGCC F: Mồi xuôi R: Mồi ngược Nguồn Oka et al, 2007 Bảng 2.3 Thông tin mồi sử dụng phân tích gen ứng viên Locus PRL Đa hình C-2402T (PRL5) 358/chèn/xóa 24bp(PRL24) C2161G C+338T VIP G5138982T VIPR1 NPY C1715301T (VIPR1/TaqI) C1704887T (VIPR1/ HhaI) Chèn/xóa bp 3139135 C31394761T GH C2983T GHRi2 A294-541G GHRi5 C571T Trình tự mồi [5’ -3’] Nhiệt độ gắn mồi (oC) F: AGAGGCAGCCCAGGCATTTTAC R: CCTGGGTCTGGTTTGGAAATTG F:TTTAATATTGGTGGGTGAAGAGACA R: ATGCCACTGATCCTCGAAAACTC F: AGAGGCAGCCCAGGCATTTTAC R: CCTGGGTCTGGTTTGGAAATTG F:GCTTGGACTGATGCGTACTT R:GTATCACTGCAAATGCTCTG F: GCTTGGACTGATGCGTACTT R: GTATCACTGCAAATGCTCTG F:CTCCTCAGGCAGACCATCATG R:CTTGCACGTATCCTTGGGTAGC F:CCCCGTTAAACTCAGCAGAC R:CCCAAAGTCCCACAAGGTAA F: TCTCAGAGCTCCAACGTATGA R: ATATTTCTGTGCCTGAACAACA F:CGTGGCTGCTTTGCTTCCTTTC R:GGGGTACGAGGCAAGGACATG F: CTAAAGGACCTGGAAGAAGGG R: AACTTGTCGTAGGTGGGTCTG F: GGCTCTCCATGGGTATTAGGA R: GCTGGTGAACCA ATCTCGGTT F: ACGAAAAGTGTTTCAGTGTTGA R: TTTATCCCGTGTTCTCTTGACA F: Mồi xuôi R: Mồi ngược Kích thước [bp] Nguồn 56 439 Cui et al, 2006 54 154/130 Xu et al, 2011 56 439 Cui et al, 2006 55 520 Zhou et al, 2010 55 520 Xu et al, 2011a 61 486 Xu et al, 2011 61 434 Xu et al, 2011 56 248 Xu et al, 2011a 58 324 Xu et al, 2011 62 1164 Makhsous et al, 2013 58 718 Li et al, 2008 60 750 Li et al, 2008 Thành phần phản ứng cắt (tổng thể tích phản ứng 15 µl): nước deion (2,5 µl), đệm cắt 10X (1,5 µl), sản phẩm PCR (10 µl), enzym cắt hạn chế (10U), thời gian ủ 16 giờ,nhiệt độ ủ tương ứng với enzyme cắt (Bảng 2.4) Bảng 2.4 Thông tin phản ứng enzyme cắt hạn chế (RE) Locus PRL VIP AB011438 Kích thước sản phẩm cắt [bp] 439/304/160/144/81/54 Nhiệt độ cắt [oC] 37 - AF288765 154/130 37 Thermo, Mỹ Csp6I HinfI ApoI AB011438 NC_006090 NC_006090 439/405/34 520/480/40 520/486/34 37 37 37 Thermo, Mỹ Thermo, Mỹ Thermo, Mỹ Đa hình RE Số hiệu GenBank C-2402T (PRL5) – 358/ chèn/xóa 24 bp (PRL24) C2161G C+338T G5138982T AluI Hãng sản xuất Thermo, Mỹ VIPR1 NPY GH GHR GHR C1715301T C1704887T Chèn/xóa bp 3139135 TaqI HhaI DraI NC_006089 NC_006089 M87298 C31394761T KpnI GI:35797382 C-2983T C571T (intron 5) A294-541G (intron 2) SacI NspI JN675393 NC_006127 HinIII NC_006127 486/310/176 434/253/181 248(252) 167/81 324/200/124 200/124 1164/1020/ 570/450/144 750/550/200 718/428/290 258/170/290 65 37 37 Thermo, Mỹ Thermo, Mỹ Thermo, Mỹ 37 Thermo, Mỹ 37 37 Thermo, Mỹ Thermo, Mỹ 37 Thermo, Mỹ 2.1.2 Các hóa chất -Hóa chất dùng nghiên cứu sinh học phân tử hãng Sigma (Đức), Merck (Đức), Thermo (Mỷ) 2.1.3 Máy móc thiết bị sử dụng Máy PCR Eppendorf AQ mastercycle 5332YN056927 (Đức), máy điện di ngang FCIE-PLAS-HU1030012479 (Anh), máy ổn nhiệt (JSR-JSWB22T-Hàn Quốc), tủ lạnh bảo quản 40C (Panasonic - Nhật Bản), máy soi gel (UVP-M-26V/P/N95-045802, Mỹ), máy ly tâm lạnh (HETTICH-UNI version 320R, Đức), Máy đo áp lực võ trứng, Thiết bị đo quang phổ Nano Drop 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền gà Liên Minh dựa ADN ty thể - Nội dung 2: Phân tích mối liên quan thị di truyền tính trạng sản xuất trứng giống gà Liên Minh + Thí nghiệm 1: Xác định số liên quan đến tính trạng sản xuất trứng 90 cá thể gà mái Liên Minh; + Thí nghiệm 2: Xác định tần số alen/kiểu gen gen ứng viên (PRL, VIP, VIPR1,NPY, GH GHR) liên quan tính trạng suất trứng; Xác định mối liên quan gen ứng viên tính trạng sản lượng trứng gà Liên Minh 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp thu mẫu máu Mẫu máu gà Liên Minh lấy xylanh ml từ tĩnh mạch cánh, nhanh chóng chuyển sang ống đựng máu chứa chất chống đông EDTA-K Bảo quản ống máu 4ºC, đưa phịng thí nghiệm bảo quản -20ºC 2.3.2 Phương pháp tách ADN hệ gen từ máu ADN hệ gen tách chiết từ mẫu máu theo phương pháp Ausubel cộng (1995) 2.3.3 Phương pháp nhân đoạn ADN phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Để đánh giá đa dạng nguồn gen kiểm tra đa hình gen, trước tiên phải khuếch đại đoạn ADN: D-loop, PRL, VIP, VIPR1, NPY, GH GHR sử dụng cặp mồi đặc hiệu (Mullis, 1990) 2.3.4 Phương pháp tinh PCR giải trình tự gen Tinh đoạn ADN để giải trình tự: Quy trình tinh sử dụng kit QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) Sản phẩm sau tinh gửi giải trình tự gen máy đọc tự động ABI- 3100 Avant Gentic Analyzer công ty Macrogen (Hàn Quốc) 2.3.5 Phương pháp phân tích đa hình gen ứng viên Đa hình gen PRL, VIP, VIPR1,NPY, GH GHR xác định kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) với enzyme cắt đặc hiệu thích hợp 2.3.6 Đánh giá tiêu liên quan tính trạng sinh trưởng sinh sản gà Các tiêu liên quan đến khả sản xuất trứng theo dõi theo mơ tả Bùi Hữu Đồn cộng (2011) bao gồm: Tuổi đẻ trứng đầu (ngày), khối lượng trứng (gram), suất trứng (tổng số lượng trứng/ mái/ 20 tuần) khối lượng trứng (gram) số hình dạng trứng (kích thước đường kính lớn/đường kính nhỏ D/R) 2.3.7 Khối lượng thể Khối lượng thể gà Liên Minh cân vào thứ sáu hàng tuần vào 19 giờ, gà lên chuồng, sử dụng cân đồng hồ có độ xác g 2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu Trình tự nucleotide vùng D-loop gen ty thể gà xử lý chương trình phần mềm ClustalX 2.0.11, Bioedit 5.0 (Hall, 1999) Xác định, phân tích tiêu đa dạng di truyền (số vị trí đa hình, số lượng haplotype, đa dạng haplotype, đa dạng nucleotide, phép kiểm tra Tajima) sử dụng phần mềm DnaSP V5 (Librado Rozas, 2009), phả hệ di truyền xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining phần mềm MEGA 6, với giá trị bootstrap 1.000 lần lấy mẫu thử (Tamura cs., 2007) Các số liệu kiểu hình – kiểu gen (tần số alen, kiểu gen) ghi lại phần mềm Excel xử lý theo phương pháp thống kê sinh học Tần số alen tính theo cơng thức: p= (2AA + AB) / 2N q= (2BB+ AB) / 2N, p tần số alen A, q tần số alen B, N tổng số mẫu nghiên cứu, cân Hardy-Weinberg (HWE) ước lượng phương pháp Rodriguez cộng (2009) Tương quan kiểu gen tính trạng suất trứng tính tốn dựa mơ hình tuyến tính tổng quát (Genral Linear Model) MiniTab 16.0 Yij = µ + Gi + ij, đó: Yij: Tính trạng quan sát; μ: Trung bình chung; Gi: Ảnh hưởng kiểu gen; ij: Sai số ngẫu nhiên nucleotide Đặc biệt chèn nucleotide G vị trí 860 xuất tất gà Liên Minh nghiên cứu Bên cạnh đó, thay nucleotide T→C xuất 10 vị trí (167, 199, 217, 243, 246, 256, 270, 315, 367, 888) thay C→T xuất vị trí 225, 261, 310 446 3.1.4.3 Hệ số tương đồng nucleotide vùng D-loop a Phân tích hệ số tương đồng nucleotide vùng D-loop gà Liên Minh với giống gà địa Việt Nam (455 bp) Đa số giống gà địa Việt Nam sử dụng 455 bp vùng siêu biến D-loop để phân tích đa dạng di truyền (Lê Tiến cs, 2009; Cuc et al, 2011) Vì vậy, sử dụng 455 bp vùng siêu biến đoạn D-loop để so sánh mức độ tương đồng nucleotide vùng D-loop gà Liên Minh gà địa Việt Nam Kết phân tích cho thấy, hệ số tương đồng nucleotide cá thể gà Liên Minh đạt 97,5% - 100% Trong đó, có 14 cá thể gà Liên Minh nhóm I (GLM 01, GLM02, GLM03, GLM06, GLM 07, GLM 08, GLM 09, GLM 11, GLM12, GLM13, GLM14, GLM15, GLM16 GLM18) (Hình 3.4) có hệ số tương đồng trình tự nucleotide đạt 100% Các gà Liên Minh có hệ số tương đồng nucleotide với gà Liên Minh nhóm II (GLM10 GLM17) đạt 97,5% Hệ số tương đồng nucleotide gà Liên Minh gà địa Việt Nam dao động khoảng 96,8 - 99,7% Trong đó, hệ số tương đồng nucleotide gà Liên Minh thuộc nhóm I (n = 14) so với gà địa nằm nhánh B cao đạt từ 99,3 - 99,7% Gà Liên Minh nhóm có hệ số tương đồng nucleotide cao so sánh với gà Đông Tảo gà Nhiều Ngón (99,1-99,7%) Ngược lại, gà Liên Minh nhóm I có hệ số tương đồng nucleotide với gà địa Việt Nam nhánh C, D, E, G, I đạt từ: 97,3 -97,9% Gà Liên Minh nhóm II (GLM10 GLM17, Hình 3.4) có hệ số tương đồng cao so với gà địa nằm phân nhánh B8 (99,1%), gà Liên Minh nhóm III (GLM04, GLM19, GLM23, GLM24) lại có hệ số tương đồng nucleotide với gà địa Việt Nam nằm phân nhánh D1 99,1% Gà Liên Minh thuộc nhóm IV (GLM20) nhóm V (GLM05) có hệ số tương đồng cao với gà địa Việt Nam thuộc phân nhánh C1 (99,5-99,7%) Gà Liên Minh nhóm VI (GLM21) VII (GLM22) có hệ số nucleotide tương đồng cao so với gà nhà phân nhánh E1 (99,3-99,5%) b Phân tích hệ số tương đồng nucleotide vùng D-loop gà Liên Minh gà nhà giới (1050 bp) 10 Sử dụng 1050 nucleotide vùng D-loop gà Liên Minh để so sánh với giống gà địa giới (Oka et al, 2007) Kết phân tích cho thấy, hệ số tương đồng nucleotide cá thể gà Liên Minh đạt 98,7% - 100% Trong đó, gà Liên Minh nhóm I (GLM 01, GLM 07, GLM 08, GLM 09, GLM 11), nhóm II (GLM02, GLM18), nhóm III (GLM12, GLM13, GLM14, GLM15), nhóm IV (GLM06) nhóm V(GLM03, GLM16) có hệ số tương đồng trình tự nucleotide cao đạt từ 99,7% 99,9%, gà Liên Minh nhóm có hệ số tương đồng nucleotide đạt 100% Hệ số tương đồng nucleotide gà Liên Minh gà nhà theo kết nghiên cứu Oka cộng đạt 98,2% - 100% Gà Liên Minh thuộc nhóm I, II, III, IV V có hệ số tương đồng nucleotide với gà thuộc phân nhánh E1, E2, E3, E4 (Oka et al, 2007) đạt 99,6% - 100,0% Gà Liên Minh GLM10, GLM17, GLM21, GLM22 có hệ số tương đồng nucleotide cao với gà thuộc phân nhánh A (99,6%100,0%), gà Liên Minh thuộc nhóm VIII (GLM04, GLM19, GLM23, GLM24) có hệ số tương đồng nucleotide cao so sánh với gà nhà nằm nhánh C, đạt 99,5% Hệ số tương đồng nucleotide GLM05, GLM20 với gà nhà phân nhánh D đạt 99,8-99,9% Hệ số tương đồng thấp so sánh gà Liên Minh với gà nhà thuộc phân nhánh G, F, đạt từ 98,2% - 99,2% 3.1.4.4 Phân bố Haplotype gà Liên Minh Sử dụng phần mềm DnaSP version xác định haplotype 1050 bp 455 bp Kết phân tích haplotype 1050 bp vùng D-loop 24 mẫu gà Liên Minh nghiên cứu phân bố thành 12 haplotype (Bảng 3.3) Trong đó, gà Liên Minh tập trung nhiều vào haplotype 1, haplotype haplotype Kết phân tích haplotype 455 bp vùng D-loop gà Liên Minh nghiên cứu phân bố thành bảy haplotype (Bảng 3.4) Trong đó, gà Liên Minh tập trung nhiều vào haplotype 3.1.4.5 Cây phân loại di truyền gà Liên Minh dựa trình tự nucleotide vùng D-loop a Cây phân loại di truyền gà Liên Minh giống gà địa Việt Nam (455 bp) 11 Hình 3.10 Cây phân loại di truyền gà Liên Minh giống gà địa Việt Nam Sử dụng 455 bp vùng D-loop, xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining sử dụng MEGA 6.0 với giá trị bootstrap 1.000 (1,2,3 : Haplotype; (-): số cá thể gà haplotype; ● GLM: Gà Liên Minh, ■ DT: Gà Đơng Tảo; ▲ - GNN: Gà Nhiều Ngón 12 Cây phân loại di truyền xây dựng dựa 48 trình tự D-loop gà địa Việt Nam (24 trình tự GLM, sáu trình tự GNN 18 trình tự GDT) với 11 trình tự tham chiếu tương ứng với bảy nhánh xác định Liu cộng (2006) 37 trình tự gà địa Việt Nam phân bố bảy nhánh (Cuc et al, 2011) Sử dụng 455 bp vùng siêu biến D-loop ADN ty thể để xác định mối quan hệ di truyền gà Liên Minh giống gà địa Việt Nam (Hình 3.10) Cây phân loại di truyền dựa trình tự nucleotide vùng D-loop cho thấy gà Liên Minh phân bố bảy haplotype thuộc nhánh (A, B, C, D, E), tập trung chủ yếu nhánh B (58,3% mẫu) – nhánh phân bố giống gà địa Việt Nam Đông Nam Á Trong nghiên cứu này, khơng tìm thấy mẫu gà Liên Minh, Đơng Tảo, Nhiều Ngón phân bố nhánh G, H, I F Kết phù hợp với nghiên cứu Cuc cộng (2011) b Cây phân loại di truyền gà Liên Minh, gà Nhiều Ngón, gà Đơng Tảo giống gà nhà giới Hình 3.11 Cây phân loại di truyền gà Liên Minh, gà Đơng Tảo, gà Nhiều Ngón gà nhà giới Sử dụng 1050 bp vùng D-loop, xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining sử dụng MEGA 6.0 với giá trị bootstrap 1.000 lần lặp lại (1,2,3 : Haplotype; (-): số cá thể gà haplotype ● GLM: Gà Liên Minh, ■GNN: Gà Nhiều Ngón, ▲GDT: Gà Đông Tảo, Oka: Các gà đại diện nằm nhánh Oka cộng sự., 2007 phân tích) 13 Cây phân loại di truyền xây dựng dựa 48 trình tự D-loop gà địa Việt Nam (24 trình tự GLM, sáu trình tự GNN 18 trình tự GDT) với 11 trình tự tham chiếu tương ứng với bảy nhánh xác định Oka cộng (2007) (Hình 3.11) Sử dụng 1050 bp vùng D-loop sử dụng phương pháp NJ để xây dựng phân loại di truyền gà Liên Minh, gà Nhiều Ngón, gà Đơng Tảo gà nhà giới Kết cho thấy, 24 mẫu GLM phân bố năm nhánh A, B, C, D E, chủ yếu nhánh E (58,3%) Cụ thể là: 14 mẫu gà Liên Minh thuộc haplotype 1, 2, 3, phân bố nhánh E Các nghiên cứu trước cho thấy rằng, gà thuộc nhánh E quan sát thấy gà địa Châu Á, Trung Quốc, Lào, Nhật Bản Ấn Độ (Liu et al, 2006, Oka et al, 2007, Cuc et al, 2011, Kawabe et al, 2014) không quan sát thấy gà địa Châu Phi (Miao et al, 2013) 3.2 PHÂN TÍCH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN TÍNH TRẠNG NĂNG SUẤT TRỨNG Ở GIỐNG GÀ LIÊN MINH 3.2.1 Theo dõi tiêu liên quan tính trạng suất trứng 90 cá thể gà Liên Minh Nghiên cứu tiến hành chọn lọc nuôi 90 cá thể gà Liên Minh riêng biệt lồng, điều kiện ánh sáng, độ ẩm, chế độ dinh dưỡng tương đối giống nhau, phục vụ đánh giá tương quan gen ứng viên tính trạng suất trứng gà Liên Minh Các tiêu theo dõi bao gồm: Tuổi bắt đầu đẻ trứng (TBĐĐT), số lượng trứng (SLT), khối lượng trứng trung bình (KLTTB), khối lượng trứng trung bình từ 36 tuần đến 44 tuần tuổi, khối lượng trứng (KLQTĐT), số hình dạng trứng (CSHDT) cá thể gà Liên Minh 3.2.2 Tần số alen/kiểu gen đa hình gen PRL, PRLR, VIP, VIPR1, NPY, GH GHR; phân tích mối liên quan với tính trạng suất trứng gà Liên Minh 3.2.2.1 Tách chiết ADN hệ gen 3.2.2.2 Tần số alen/kiểu gen đa hình gen PRL mối liên quan với tính trạng suất trứng a Khuếch đại đoạn gen PRL phản ứng PCR b Phân tích đa hình gen PRL enzyme cắt giới hạn c Xác định đa hình gen PRL giải trình tự nucleotide d Phân tích tần số alen/kiểu gen vị trí đa hình gen PRL Đa hình PRL24, PRL/2161 có tần số kiểu gen tuân theo Định luật HardyWeinberg (P>0,05) Còn đa hình PRL/2402 khơng tn theo định luật HardyWeinberg (P