Nhân giống in vitro dứa Cayen

Dứa là loại cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao đồng thời là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Quả dứa khi chín có mùi vị thơm ngon, màu sắc hấp dẫn. Trong trái dứa tươi có nhiều đường, vitamin C

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Mở đầu

Dứa là loại cây ăn quả có giá trị dinh dỡng cao đồng thời là mặt hàngxuất khẩu có giá trị Quả dứa khi chín có mùi vị thơm ngon, màu sắc hấp dẫn.Trong trái dứa tơi có nhiều đờng, vitamin C, axit amin, axit hữu cơ, muốikhoáng và các chất thơm Dứa tơi và các sản phẩm chế biến từ dứa rất đợc achuộng trên cả thị trờng trong nớc và thị trờng quốc tế Vì vậy, trong các sảnphẩm rau quả chế biến, xuất khẩu, dứa luôn chiếm vị trí hàng đầu (chiếm 50%tổng sản lợng) Mặt khác, dứa còn đợc sử dụng để phủ xanh đất trống trênnhững vùng đất dốc vốn khó sử dụng cho những cây nông nghiệp khác nhnglại rất thích hợp cho dứa.

Hiện nay, nhu cầu của thị trờng về việc xuất khẩu các sản phẩm chếbiến từ dứa ngày càng tăng Trong khi đó, giống dứa ở nớc ta hiện nay chủ yếulà giống dứa Queen có năng suất thấp, quả nhỏ (0,5 - 0,7 kg), vỏ dầy, mắtsâu… nên việc chế biến lát cắt từ giống dứa này gặp nhiều khó khăn, cha phùhợp với việc chế biến dứa hộp xuất khẩu Do đó, vấn đề đặt ra hiện nay là phảilàm cách nào đó để tăng năng suất và phẩm chất dứa nhằm mục đích đáp ứngkịp thời nhu cầu của thị trờng.

Theo kế hoạch của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn thì trongnhững năm trớc mắt cần phải mở rộng diện tích trồng dứa, đồng thời cần thaydần giống dứa Queen truyền thống bằng giống dứa Cayen có năng suất cao,quả to, chất lợng phù hợp với việc chế biến dứa xuất khẩu Chính vì vậy, nhucầu về giống dứa Cayen hiện nay là rất lớn Tuy nhiên, giống dứa Cayen lại cóhệ số nhân tự nhiên rất thấp Một số biện pháp nhân giống dứa Cayen bằnghom, nhân nách lá, thân cắt khoanh đã đợc ứng dụng nhng vẫn không đáp ứngđợc nhu cầu cây giống cho việc mở rộng sản xuất.

Trớc yêu cầu của thực tiễn sản xuất, một giải pháp khả thi đã đợc thựchiện nhằm đáp ứng nhu cầu cây giống cho các khu vực trồng và sản xuất dứa,

đó là: sử dụng phơng pháp nhân giống in vitro dứa Cayen Phơng pháp này có

u điểm là trong thời gian ngắn có thể tạo đợc nguồn cây giống sạch bệnh,đồng đều về phẩm chất và giữ đợc các đặc tính quý của nguyên liệu ban đầuvới hệ số nhân giống cao gấp nhiều lần so với sử dụng phơng pháp nhân giốngvô tính truyền thống

Tuy nhiên, trong quá trình nhân giống và cả trong thực tế sản xuất, doảnh hởng của nhiều yếu tố, giống dứa Cayen đã xuất hiện nhiều biến dị làmTài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

1

giảm năng suất và chất lợng của giống Để khắc phục tình trạng trên cần tiến

hành nghiên cứu hoàn thiện phơng pháp nhân giống in vitro dứa Cayen để bảo

tồn giống, đồng thời cung cấp giống dứa Cayen giữ nguyên đặc tính di truyềnu việt của giống gốc tránh hiện tợng lai tạp giống Xuất phát từ ý nghĩa khoa

học và thực tiễn đã nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài Nhân giống in vitro“Nhân giống in vitro

dứa Cayen” nhằm mục đích tạo ra giống dứa Cayen có năng suất cao và ổn

định, để phục vụ yêu cầu thâm canh cho các khu vực trồng dứa

CHƯƠNG 1 tổng quan tài liệu

1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại cây dứa

Cây dứa (Pineapple, Ananas) là loại cây ăn quả rất tiêu biểu thuộc vào giớithực vật Plantae, ngành hạt kín Magnoliophyta, lớp Liliopsida, bộ Tầm GửiBromeliales, họ Tầm Gửi Bromeliaceae, chi Ananas, loài Ananas comosus L [27].

Dứa có nguồn gốc từ Nam Mỹ nằm trong tứ giác bao gồm vùng phía Nam Braxinvà vùng phía Bắc Achentia, Paraguay, giữa vĩ tuyến Nam 150 và 300 và kinh tuyến400 và 600 Tây Dứa đợc du nhập vào châu Âu và châu á từ thế kỷ 16 [3].

Trên thế giới có rất nhiều loại dứa khác nhau Tuỳ thuộc vào các đặcđiểm hình thái nh hình dạng, kích thớc, đặc điểm lá, trọng lợng quả và một sốchỉ số về hàm lợng đờng, hàm lợng chất khô mà ngời ta chia các loại dứathành 4 nhóm sau [10]:

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Nhóm này đang rất đợc a chuộng trong công nghiệp sản xuất dứa hộptrên thế giới [12].

Đặc điểm của giống dứa Cayen là cây cao to, lá không có gai, quả hìnhtrụ, mắt quả dẹt, kích cỡ đồng đều Khi chín thịt quả vàng tơi, mùi vị thơmngon, hàm lợng đờng và độ chua cao Giống này cho năng suất cao, trọng lợngquả trung bình đạt 2 kg, nếu chăm sóc tốt thì trọng lợng quả có thể lên tới 5 - 7kg [24] Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn thành phố Hồ Chí Minh,năng suất của dứa Cayen bình quân đạt 40 - 45 tấn/ha, tăng gấp ba lần so vớigiống dứa Queen Điều này mở ra triển vọng lớn cho việc phát triển trồng dứaCayen phục vụ nhu cầu chế biến dứa xuất khẩu [31].

Nhóm Hoàng Hậu (Queen Pineaple)

Đây là nhóm thích hợp cho xuất khẩu quả tơi hơn là cho chế biến vàsản xuất dứa hộp Đặc điểm của nhóm này là sinh tr ởng kém hơn nhómCayen, lá ngắn, có nhiều gai Quả nhỏ, hình tháp, trọng lợng quả trungbình đạt 0,5 - 0,7 kg, hàm lợng chất khô và độ chua thấp, thịt quả ăn rấtthơm ngon và giòn Ngoài ra, giống dứa Queen còn có khả năng chốngchịu với các điều kiện môi trờng tốt nên ít bị sâu bệnh Các giống dứa ởViệt Nam chủ yếu thuộc vào nhóm này

Nhóm Tây Ban Nha đỏ (Red Spanish)

So với nhóm Cayen và nhóm Queen thì nhóm này có năng suất thấp, ládài, quả nhỏ và hình táo nên nhóm này không đợc trồng phổ biến.

Nhóm Tây Phi (Abacaxi)

Đặc điểm của nhóm này là quả nhỏ, có hình tháp, lá có gai, màu sắc quảvà thịt quả nhạt, không phù hợp cho cả xuất khẩu quả tơi và chế biến dứa hộp.Do vậy, giống dứa này chủ yếu là phục vụ cho nhu cầu của địa phơng.

1.2 Giá trị kinh tế và sử dụng của dứa

Dứa là loại cây ăn quả có giá trị dinh dỡng, giá trị kinh tế và giá trị xuấtkhẩu cao Vì vậy, hiện nay ngành trồng dứa đang phát triển rất mạnh mẽ.

Trong quả dứa chín có hàm lợng đờng từ 10 - 12%, nếu chăm sóc tốt cóthể đạt 15 - 18% Trong đó có 60 - 70% là đờng Saccarose và 30 - 40% là đ-ờng Glucose và Fructose Lợng axít chiếm khoảng 0,6% (trong đó có trên80% là axít Citric), chất tro chiếm 0,4 - 0,6% trọng lợng tơi của trái dứa.

Dứa còn chứa vitamin C với hàm lợng 24 - 28 mg/100g trái Ngoài ra,trong quả dứa còn chứa Bromelin là loại enzym có tác dụng phân giải protein.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn3

Quả dứa có thể dùng để ăn tơi, chế biến dứa hộp, nớc giải khát, làm mứtkẹo Các phụ phẩm từ dứa còn là nguồn nguyên liệu để sản xuất phân bón,

làm giấy hoặc sản xuất thức ăn gia súc [3].

Theo những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy: dứa là loại quả ăn rấtmát và đợc coi là một trong những cây ăn quả nhiệt đới hàng đầu, rất đợc achuộng Dứa đã trở thành món tráng miệng khá phổ biến của những ngời dân ởHawai, Philippines, Brazil, Malaysia, Thái Lan và Việt Nam [27].

1.3 Tình hình sản xuất dứa ở Việt Nam

Trong số các loại cây ăn quả ở Việt Nam thì dứa là loại cây ăn quả lâu đờivà có nhiều lợi thế hơn so với các cây ăn quả khác nh: cam, quýt, chuối [3] Vìvậy, việc trồng dứa ở nớc ta đã đợc quan tâm từ những năm 1936 - 1937 vàcho đến nay, ngành trồng dứa vẫn giữ vị trí rất quan trọng trong ngành trồngtrọt ở nớc ta Dứa là loại cây dễ trồng, không kén đất do đó ở Việt Nam dứa đ-ợc trồng phổ biến ở cả 3 miền Bắc - Trung - Nam [1].

ở các tỉnh miền Bắc: Do nhiệt độ trung bình trong năm từ 120C - 230C,độ ẩm không khí 83% nên tơng đối thích hợp cho sinh trởng của cây dứa Sảnlợng dứa của khu vực này đạt khoảng 42.000 - 47.000 tấn/năm Trong mấynăm gần đây, diện tích và sản lợng dứa ở miền Bắc tăng cao và trở thànhnguồn cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy chế biến dứa hộp.

ở các tỉnh miền Trung: Mặc dù có khí hậu nhiệt đới nhng ở miền

Trung do ảnh hởng của gió Lào nên nhiệt độ trung bình cao khoảng 390C, độẩm không khí thấp 40 - 45% nên sự sinh trởng của dứa là kém.

ở các tỉnh miền Nam: Do có khí hậu nhiệt đới điển hình nên ở khu

vực này đã hình thành đợc các khu trồng dứa trọng điểm nổi tiếng ở nớc tanh: Hậu Giang, Kiên Giang, Long An, Minh Hải, thành phố Hồ Chí Minh Sản lợng dứa của vùng này cung cấp hầu hết cho các nhà máy chế biến dứa ởmiền Nam [10] Có thể nói đây là vùng có diện tích và sản l ợng dứa lớn nhấtso với cả nớc.

Theo tài liệu của FAO (2001) sản lợng dứa của nớc ta hiện nay đạt khoảng415.000 tấn/năm Còn ở một số nớc khác thuộc khu vực Đông Nam á nh Thái Lanđạt 1.979 triệu tấn, Philippines đạt 1.618 triệu tấn, Brazil đạt 143 triệu tấn Tổng sảnlợng dứa của cả thế giới trong năm 2001 là 14.220 triệu tấn [27].

1.4 Các phơng pháp nhân giống dứa

1.4.1 các phơng pháp nhân giống vô tính truyền thống

Nhân giống bằng các loại chồi

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Chồi là cơ quan quan trọng đợc dùng trong nhân giống dứa theo phơngpháp nhân giống vô tính truyền thống Trong sản xuất hiện nay, giống dứaphục vụ cho sản xuất chủ yếu là các loại chồi Tuỳ theo vị trí của chồi trêncây ngời ta phân biệt thành 5 loại chồi sau: chồi thân, chồi cuống, chồi nách,chồi ngầm và chồi ngọn [17].

Nhân giống bằng thân

Dứa Cayen có rất ít chồi do đó để phát triển nhanh giống dứa này ngời takết hợp việc sử dụng các loại chồi và nhân giống bằng thân dứa đã thu quả [24].

Dùng thân dứa có nhiều mầm ngủ, bóc sạch lá và cắt thành từngkhoanh dày 2,5 - 3 cm Sau đó xử lý các khoanh bằng thuốc diệt nấm và giâmvào đất có độ ẩm 15 - 16% Sau một thời gian mỗi một khoanh có thể thu đợc1 - 3 chồi nên từ một thân dứa có thể thu đợc 9 - 10 chồi [9].

Nhân bằng cách chẻ nhỏ các chồi

Có thể tăng hệ số nhân giống bằng cách dùng chồi chẻ đôi hoặc chẻ t đểgiâm Các phần chẻ sẽ cho 1 - 2 chồi Sau khi các chồi có từ 7 - 8 lá lại tiếptục chẻ để tăng hệ số nhân giống [19].

1.4.2 Nhân giống bằng nuôi cấy in vitro

Hiện nay, ngành trồng dứa ở Việt Nam đang có kế hoạch tăngnhanh về quy mô sản xuất và mở rộng diện tích Do đó, việc sử dụng cácphơng pháp nhân giống vô tính truyền thống cha đáp ứng đợc nhu cầu vềgiống dứa cho sản xuất.

Giải pháp cho vấn đề trên là ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhângiống Biện pháp nhân giống vô tính giống dứa bằng kỹ thuật nuôi cấy mô đợcđề xuất vào năm 1977 đã mở ra một triển vọng mới cho ngành sản xuất dứa [27].

Quy trình nhân giống in vitro cây dứa bao gồm 5 giai đoạn nh sau:

1 Tạo chồi

2 Tạo cây, nhân và duy trì chồi nuôi in vitro

3 Nuôi cây4 Vờn ơm5 Đồng ruộng

ở Việt Nam, trớc yêu cầu của thực tiễn sản xuất về số lợng và chất lợng

cây giống thì vấn đề nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đang đợc hết

sức quan tâm và chú ý Đã có nhiều công trình nghiên cứu thành công phơngpháp nhân giống dứa Cayen nh: Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển đề nghịquy trình nhân nhanh giống dứa Cayen dới dạng thể chồi [17] Đặng XuyếnNh, Hoàng Thị Kim Hoa và các cs đa ra quy trình nhân nhanh giống dứa CayenTài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

5

Phú Hộ và Đồng Giao [8] Trơng Thị Hảo đa ra quy trình nhân nhanh giống dứaCayen bằng kỹ thuật nuôi cấy phát sinh phôi giả (PLB – protocorm like body)trong điều kiện tự nhiên [28] Đào Kim Thoa đã nghiên cứu thành công một sốbiện pháp kỹ thuật làm tăng hệ số nhân giống vô tính cây dứa Cayen [29], LêVăn Thợng cũng đã nghiên cứu một số biện pháp tăng nhanh năng suất trồngdứa trên đất đồi và đất phèn [11].

Tuy nhiên, vấn đề sản xuất cây giống in vitro hiện nay còn gặp nhiều

khó khăn nhất là việc hoàn thiện, rút ngắn và đơn giản hoá quy trình chăm sóc

dứa in vitro ở giai đoạn vờn ơm [7]

1.5 Các điều kiện ảnh hởng đến sinh trởng của cây dứa

1.5.1 ảnh hởng của điều kiện ngoại cảnh lên sinh trởng và tỷ lệ sốngsót của cây

Nói chung, trong đời sống của thực vật ảnh hởng của điều kiện ngoạicảnh nh: ánh sáng, độ ẩm… có ý nghĩa quyết định đến sinh trởng và phát triểncủa cây Nó tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến quá trình thực hiện các chứcnăng sinh lý của cây nh: hô hấp, quang hợp, dinh dỡng khoáng hoặc trao đổinớc, tổng hợp sắc tố [14], [16].

Đối với cây dứa nuôi cấy mô do có đặc điểm là sinh trởng trong môi ờng giàu dinh dỡng, ánh sáng, nhiệt độ ổn định, độ ẩm không khí cao nên khiđa cây ra vờn ơm thì các điều kiện ngoại cảnh có ảnh hởng rất lớn đến sinh tr-ởng và tỷ lệ sống sót của cây [5] Khi nghiên cứu giải phẫu lá cây Brasisicaphát triển từ hạt và cây nuôi cấy mô, Wetzstein đã đi đến kết luận là: có sựkhác biệt giữa chúng về sinh lý học, về các hợp chất hoá học và về khả năng

tr-quang hợp [25] Ngoài ra, cấu tạo của lá cây nuôi trong ống nghiệm còn có

đặc điểm là: mô giậu giảm, thịt lá tăng, lớp sáp trên lá mỏng nên khi đa cây rangoài môi trờng có độ ẩm thấp cây dễ bị mất nớc và héo [23]

Các tác giả trên cũng lu ý khi đa cây ra ngoài ống nghiệm cần trồngtrong nhà kính (có cờng độ ánh sáng thấp) Trớc lúc đa cây ra đồng ruộng nêntạo độ ẩm 80 - 100% để cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên, tạo thêmnhiều rễ mới.

Qua nghiên cứu cũng cho thấy: ở cây dơng xỉ nhân bằng kỹ thuật nuôi

cấy in vitro do nuôi cấy trong điều kiện độ ẩm cao nên lợng sáp trên lá giảm

thấp (2,8 g/mg trọng lợng tơi) Khi đặt cây trong điều kiện độ ẩm thấp 60

-Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

70% hàm lợng sáp trên bề mặt lá tăng nhanh và đã làm tăng tỷ lệ sống sót củacây từ 72 - 96% [21]

Từ những kết quả thu đợc cho thấy: đối với cây nuôi cấy mô trớc khi đara trồng ở điều kiện tự nhiên cần có quá trình thích nghi dần với điều kiện tựnhiên nh chế độ ánh sáng, độ ẩm…

1.5.2 ảnh hởng của chất điều hoà sinh trởng

Trong quá trình sinh trởng và phát triển của thực vật ngoài các chất hữucơ (protein, gluxit, lipid, axit nucleic…) để cấu trúc lên tế bào, mô, cơ quan vàcung cấp cho hoạt động sống của cây thì cây còn cần rất nhiều chất có hoạttính sinh học nh: vitamin, enzym và các hoocmon, trong đó các hoocmon cóvai trò rất quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh trởng phát triểnvà các hoạt động sinh lý của thực vật [22].

Các chất điều hoà sinh trởng phát triển của thực vật gồm cácPhytohoocmon và các chất điều hoà sinh trởng đợc tổng hợp nhân tạo Đây lànhững chất có bản chất hoá học rất khác nhau nhng chúng đều có tác dụngđiều tiết các quá trình sinh trởng phát triển của cây từ lúc tế bào trứng đợc thụtinh phát triển thành phôi cho đến khi cây ra hoa kết quả, hình thành cơ quansinh sản, dự trữ và kết thúc chu kỳ sống của mình [14]

Hiện nay, trong nền nông nghiệp thâm canh cao thì các chất điều hoàsinh trởng ngày càng có vai trò tích cực hơn trong việc điều chỉnh quá trìnhsinh trởng và phát triển của cây một cách hợp lý nhất làm tăng năng suất vàphẩm chất thu hoạch [12] Trong nuôi cấy mô tế bào, các chất điều hoàsinh trởng nh: Auxin, Cytokinin là thành phần không thể thiếu đợc để

chủ động điều khiển sự phát sinh hình thái thực vật in vitro.

Went (1928) và Thimann (1937) đã phát hiện ra Auxin Đại diệncủa Auxin là: Indole acetic acid (IAA) [14] Auxin có tác dụng sinh lýrất nhiều mặt lên các quá trình sinh trởng của tế bào, hoạt động của tầngphát sinh, sự hình thành rễ, hiện tợng u thế ngọn, tính hớng của thực vật,sự sinh trởng của quả và tạo quả không hạt… Trong đó, tác dụng sinh lýđặc trng nhất của Auxin là kích thích sự ra rễ [20].

Vai trò của Auxin cho sự phân hoá rễ thể hiện rất rõ trong nuôi cấymô Trong môi trờng chỉ có Auxin thì mô nuôi cấy chỉ xuất hiện rễ màTài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

7

thôi [25] Vì vậy, trong kỹ thuật nhân giống vô tính thì việc sử dụngAuxin để kích thích sự ra rễ là cực kỳ quan trọng và bắt buộc.

C ytokinin

Cytokinin đợc phát hiện vào năm 1953 (sau Auxin) bởi Miller,Skoog và các cs Hiệu quả sinh lý đặc trng nhất của Cytokinin đối vớithực vật là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ Vì vậy, ng ời ta xemchúng nh là các chất hoạt hoá sự phân chia tế bào, tác động lên sự phân

hoá cơ quan đặc biệt là sự phân hoá chồi [15 ] Ngời ta đã chứng minh

đ-ợc sự cân bằng tỷ lệ giữa Auxin và Cytokinin có ý nghĩa quyết định trong

quá trình phát sinh hình thái của mô cấy in vitro cũng nh trên cây nguyên

vẹn Nếu tỉ lệ Auxin lớn hơn tỉ lệ Cytokinin thì kích thích sự ra rễ, cònnếu tỉ lệ Cytokinin lớn hơn tỉ lệ Auxin thì kích thích sự xuất hiện và pháttriển của chồi [18]

Để tăng hệ số nhân giống, ngời ta tăng nồng độ Cytokinin trong

môi trờng nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro [26].

Bên cạnh Auxin và Cytokinin thì Gibberellin là một nhóm chất điều hoàsinh trởng đợc sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp do nó có tác dụng tích cựclên sự sinh trởng phát triển của cây [7] Gibberellin đợc phát hiện bởi nhànghiên cứu ngời Nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa.Gibberellin đợc sử dụng rộng rãi nhất là Gibberelic acid (GA3) [6].

Tác dụng sinh lý rõ rệt nhất của Gibberellin là làm tăng sinh trởng ởcây nguyên vẹn [18] Gibberellin kích thích mạnh mẽ sự sinh trởng của tế bàothực vật theo chiều dọc làm kéo dài thân, lóng cũng nh chiều cao cây Do đó,trong các chất kích thích sinh trởng thực vật thì Gibberellin là chất quan trọngđợc sử dụng để kích thích sinh trởng kéo dài thân, lóng của cây.

Ngoài các chất điều hoà sinh trởng kể trên, bột ra rễ ABT - một loại chấtkích thích sinh trởng mới đang đợc sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khácnhau Hiện nay có khoảng 10 loại ABT, trong đó mỗi loại có u thế sử dụng vớicác loại cây trồng riêng biệt Các tổng kết mới đây cho thấy các ABT6 - 10 khixử lý đã tăng thu hoạch từ 6 - 20%, cao hơn 4 - 8% so với xử lý ABT4 Có thểnói: ABT6 đợc sử dụng rộng rãi cho nhiều loại cây trồng và đem lại hiệu quảcao nhất Hiện nay, ở Việt Nam chất kích thích ABT đã và đang đợc sử dụng để

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

kích thích sự ra rễ của nhiều loại cây trồng, thúc đẩy quá trình nảy mầm của hạtgiống, kích thích sinh trởng và tăng năng suất cây trồng [13].

1.6 Phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.6.1 Lịch sử phát triển của phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1902, Harberland là ngời đầu tiên đã quan niệm rằng bất kỳ một tếbào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triểnthành một cá thể hoàn chỉnh Ông đã cho rằng: “Nhân giống in vitro Bằng cách nuôi cấy tế bào đãphân lập, ngời ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dỡng” Ôngcũng đã tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây một lá mầm nh:

Erythronium, Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công Hơn mời năm

sau, Kotte và Robbin (1924) đã nuôi cấy đỉnh sinh trởng rễ của một loại câyhoà thảo Họ đã thu đợc một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ nhng chỉ duy trì đợc hệ rễnày trong một thời gian ngắn.

Từ năm 1934 đợc xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào thực

vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua (Lycopersiconesculentum) trong môi trờng dịch thể có chứa muối khoáng, đờng Saccaroza và

dịch chiết nấm men Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay thế dịch chiếtnấm men bằng các vitamin nhóm B (B1, B3, B6) Cùng thời gian đó, nhà khoahọc Pháp - Gautheret đã nuôi cấy thành công mô tợng tầng của một số cây thângỗ [17] Sau khi Went và Thimann tìm ra và tinh chế đợc chất điều hoà sinh tr-ởng đầu tiên là IAA, Gautheret thấy rằng việc bổ sung các vitamin nhóm B và

IAA vào môi trờng đã nâng cao khả năng sinh trởng của mô tợng tầng cây Salixcapraea và Populus nigra.

Vào năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì đợc

sinh trởng của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trong một thời gian dài Trong nămđó, White đã nuôi cấy thành công con lai cây thuốc lá (Nicotiana glauca và N.langdoffi) Năm 1941, Van Overbeek và cs đã phát hiện thấy nớc dừa có ảnh h-ởng tích cực đến sự phát sinh phôi và tạo mô sẹo ở cây họ cà (Datura) [23] Cũng

trong thời gian này nhiều chất điều hoà sinh trởng nhân tạo thuộc nhóm auxinnh: NAA; 2,4-D đã đợc tổng hợp Nhiều tác giả đã xác nhận cùng với nớc dừa,2,4-D và NAA đã giúp tạo ra mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối t-ợng thực vật mà trớc đó khó khăn nuôi cấy.

Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm DNA chiết từ tinh dịch cá bẹ

(Lerringperm) vào môi trờng nuôi cấy mô thân cây thuốc lá Ông nhận thấy

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn9

chế phẩm này có tác dụng kích thích sinh trởng mô nuôi cấy rõ rệt Mộtnăm sau, Skoog và cs đã xác nhận chất gây ra hiện tợng trên là 6-furfurylamino purine và đặt tên là Kinetin Sau đó ngời ta đã tìm ra và tổng hợp mộtsố chất có tác dụng kích thích phân bào tơng tự nh Kinetin và cùng vớiKinetin gọi chung là nhóm Cytokinin Cytokinin đợc tách chiết từ thực vật bậccao đầu tiên là Zeatin có trong mầm ngô Các hợp chất này có khả năng kíchthích sự phân chia tế bào của các mô đã biệt hoá cao nh tế bào thịt lá hoặc nộinhũ của hạt đã phơi khô.

Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ảnh hởngcủa tỷ lệ (Kinetin/auxin) trong môi trờng nuôi cấy đối với sự phát sinh hìnhthái của mô sẹo cây thuốc lá Khi giảm thấp tỷ lệ này thì mô sẹo có khuynh h-ớng tạo chồi Hiện tợng này cũng đã đợc xác nhận trên nhiều đối tợng khácnhau và từ đó đóng góp rất lớn vào sự sinh trởng và phát triển của các cơ quan,mô, tế bào trong nuôi cấy Thành công của hai nhà khoa học này đã dẫn tớinhiều phát hiện quan trọng khác nhau mở đầu cho gian đoạn thứ ba về nuôicấy mô tế bào thực vật: kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy túi phấn, hạtphấn, nuôi cấy tạo phôi xoma nhân tạo…

Trong thời gian 1954 - 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đãđợc chú ý rất nhiều Muir, Hildebrandt và Riker đã tách tế bào đơn ở dạngthể huyền phù bằng cách nuôi cấy mô sẹo trong môi trờng lỏng, có lắc.Năm 1956, Nickell cũng nuôi cấy huyền phù tế bào đơn của loài đậu

(Phaseolus vulgaris) liên tục trong thời gian dài Năm 1960, Bergman đã

dùng phơng pháp lọc đơn giản để thu đợc huyền phù các tế bào độc lập.Ngời ta có thể cấy các tế bào này vào môi tr ờng thạch, chúng tiếp tục phânchia và tạo ra mô sẹo

Ngời ta đã bắt đầu chú ý đến kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấnkể từ khi Guha và Maheswari (1964) phát hiện đợc những cấu trúc giống

phôi khi nuôi cấy bao phấn cây cà độc dợc (Datura inoxia) Năm 1966, họ

đã tạo đợc cây đơn bội đầu tiên thông qua nuôi cấy bao phấn Năm 1967,nhóm Bourgin và Nitch tạo ra cây thuốc lá đơn bội từ bao phấn Cho đếnnay phơng pháp này đã trở nên có hiệu quả cao trong việc tạo ra các câyđơn bội nh: lúa, lúa mạch, lúa mì, ngô…

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Một hớng khác của nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đợc ứng dụng rộngrãi cho nhân giống và phục hồi giống Bắt đầu từ những năm 1960 khi Morelnhận thấy protocorm của cây địa lan khi nuôi cấy đã hình thành nên cácprotocorm khác Nếu trong môi trờng thích hợp thì các protocorm đó có thểphát triển thành cây con.

ở nớc ta, cho tới nay cũng có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tếbào thực vật và đã hoàn thiện đợc một số quy trình nhân giống bằng phơngpháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nh: Viện Di truyền Nông nghiệp đã hoànthành quy trình nhân giống Mía, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cũngđã đa vào đợc trong sản xuất quy trình nhân giống Bạch Đàn…

Hiện nay, ngời ta đã và đang đẩy mạnh khai thác tiềm năng nuôi cấymô tế bào thực vật dựa trên quan điểm sinh học hiện đại: “Nhân giống in vitroMỗi tế bào riêng rẽđã đợc phân hoá đều chứa toàn bộ thông tin di truyền (DNA) cần thiết của cảcơ thể thực vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào đều có thểphát triển thành một cá thể hoàn chỉnh, đó là tính toàn năng của tế bào”

1.6.2 Thành tựu của phơng pháp nuôi cấy mô tế bào

Trải qua một thời gian cha phải là dài nhng những thành tựu mà côngnghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đạt đợc là rất lớn, với hàng loạt cây trồngnh: cây ăn quả, cây lơng thực, cây công nghiệp, cây thuốc quý hiếm có giá trịcao, cây hoa.

ở nớc ta, các hớng nghiên cứu ứng dụng phơng pháp nuôi cấy mô tếbào thực vật đợc phát triển mạnh từ những năm 80 và đã đạt đợc những kếtquả khích lệ

Ví dụ: ở cây ăn quả đã xây dựng đợc quy trình nhân giống các cây ănquả có múi ở cây lơng thực đã nhân đợc giống khoai tây, lúa, ngô Đối với

cây công nghiệp, chúng ta đã ứng dụng thành công phơng pháp nuôi cấy invitro ở một số cây nh: Bạch đàn, Keo Kỹ thuật nuôi cấy in vitro cũng đợc sử

dụng rộng rãi để nhân nhanh một số cây dợc liệu nh: Trinh nữ hoàng cung,Thanh hao, Thông đỏ nhằm thu nhận đợc nguồn nguyên liệu ổn định Một số

cây hoa cũng đợc nhân giống bằng nuôi cấy in vitro nh: Phong lan và nhiều

loại hoa khác nh: Hồng, Cúc, Cẩm chớng, Lyly, Đồng tiền

Hiện nay, thành tựu của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trongsản xuất mà nhất là sản xuất nông nghiệp ngày càng đợc thể hiện rõ Nó đã trởthành một công cụ không thể thiếu của công nghệ sinh học hiện đại, nhất làTài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

11

trong lĩnh vực ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp thực vật, công nghệ tạogiống và nhân nhanh giống hiện đại

1.6.3 Phơng pháp nhân giống in vitro

Phơng pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục đợc những trở

ngại của các phơng pháp nhân giống vô tính truyền thống đồng thời còn đemlại những lợi ích thiết thực nh sau:

 Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn đợc các tính trạngđã chọn lọc.

 Tạo đợc dòng thuần chủng của cây tạp giao Điều đó rất có ý nghĩa đốivới cây thuốc và những cây trồng để chiết lấy hoạt chất.

 Tạo đợc cây có genotype mới (đa bội, đơn bội). Lu giữ tập đoàn gen.

 Phục tráng giống thông qua kỹ thuật cấy đỉnh sinh trởng và cải tạogiống thông qua kỹ thuật gen.

 Có thể sản xuất giống cây quanh năm.

 Nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh tháinhất định hoặc nẩy mầm kém.

 Hệ số nhân cực kỳ cao.

Nói tóm lại, nhân giống in vitro một mặt tạo ra cây con sạch bệnh với hệ

số nhân cao, mặt khác đảm bảo đợc tính ổn định di truyền của cây trồng[19] Tuy nhiên, phơng pháp này đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuậtcao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân bằngcác phơng pháp khác.

Hiện nay, nhân giống in vitro đã đợc áp dụng cho nhiều loại cây Murashige(1974) đã chia quy trình nhân giống in vitro thành 4 giai đoạn nh sau [7]:

Giai đoạn 1: Nuôi cấy khởi đầu (tái sinh chồi, cụm chồi)

Đa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy phải đảm bảo: tỷ lệ nhiễm thấp,tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trởng nhanh Kết quả bớc này phụ thuộc rất nhiềuvào cách lấy mẫu Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh trởng, chồi nách, sau đó làhoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ…

Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện in vitro

Giai đoạn này kích thích tạo cơ quan phụ hoặc có cấu trúc khác mà từ đóphát sinh cây hoàn chỉnh Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

định phơng thức nhân nhanh nhất bằng môi trờng dinh dỡng và điều kiện khíhậu tối thích.

Giai đoạn 3: Tạo cây hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn quan trọng, bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện cây thíchnghi với điều kiện thay đổi của môi trờng ngoại cảnh nh: sự thay đổi nhiệt độ,độ ẩm, sự mất nớc, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dỡng sang trạng thái tựdỡng hoàn toàn.

Giai đoạn 4: Huấn luyện cây con, chuyển cây ra trồng ở điều kiện tự nhiên

Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi của cây với điều kiện tự nhiên là 2 3 tuần Trong thời gian này, cây cần đợc chăm sóc và bảo vệ tốt trớc những yếutố bất lợi nh: Mất nớc nhanh làm cây bị héo, nhiễm vi khuẩn và nấm, bệnh thốinõn, bệnh cháy lá do nắng.

-Sơ đồ quy trình nhân giống thực vật in vitro

Hoa Đỉnh sinh tr ởng

Nhân nhanh chồiMô sẹo

Vật liệu vô trùng

Đ a cây ra đấtCụm chồi

V ờn ơm

Chơng 2 Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

2.1 Đối tợng nghiên cứu

Thí nghiệm đợc tiến hành trên cây dứa Cayen (Ananas comosus L.).

Nguồn nguyên liệu dứa đợc lấy từ các địa phơng khác nhau:1 Xã La Hiên - huyện Võ Nhai - tỉnh Thái Nguyên.2 Xã Cao Thợng - huyện Tân Yên - tỉnh Bắc Giang.

Trong đó, nguồn nguyên liệu chính để đa mẫu là các chồi ngọn hoặc chồi

nách chứa các mắt ngủ của cây (hình 2.1)

Hình 2.1 ảnh dứa Cayen ngoài tự nhiên

2.2 Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm đợc tiến hành trong khoảng thời gian từ tháng 9 - 2007đến tháng 5 - 2008 tại Phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa Khoa học Tự nhiênvà Xã hội - Đại học Thái Nguyên.

2.2.2 Phơng pháp bố trí thí nghiệm

Vờn ơm

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Các thí nghiệm đợc tiến hành trên môi trờng nền MS (Murashige Skoog, 1962 ) có bổ sung đờng 2,5%; thạch 0,8 - 0,9 %; M-inositol 100 mg/lvà các chất kích thích sinh trởng ở các thang nồng độ khác nhau.

Thí nghiệm 1 Nghiên cứu hiệu quả khử trùng

Mẫu dùng cho nuôi cấy là phần ngọn dứa hoặc chồi nách có chứa cácmắt ngủ của cây.

Ngọn dứa bóc vỏ, rửa sạch dới vòi nớc chảy, rửa tiếp bằng nớc xà phòngloãng, rửa sạch xà phòng, sau đó để dới vòi nớc chảy mạnh khoảng 5 - 10 phút.Hoá chất dùng cho việc khử trùng mẫu là cồn 700, javen 50%, thuỷ ngân clorua0,1% Thời gian khử trùng thay đổi tuỳ từng loại hoá chất Cồn 700 khử trùng

trong 30 giây, javen 50% trong 5 phút, thuỷ ngân clorua 0,1% trong 10 - 20 phút.

Các thao tác đợc tiến hành trong buồng cấy vô trùng.

Thí nghiệm 2 ảnh hởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả năngnhân chồi

Các mẫu sau khi khử trùng tách lấy các mầm ngủ và đỉnh sinh trởng cấy lêncác môi trờng cảm ứng tạo chồi ban đầu Sau đó, lấy những chồi tạo thành cấy lênmôi trờng nhân chồi Môi trờng nhân chồi sử dụng môi trờng nền MS bổ sung đ-ờng 2,5%; thạch 0,8% và các chất điều hòa sinh trởng là NAA với nồng độ 0,5;1,0; 1,5 mg/l và BAP với nồng độ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l Cụ thể nh sau:

15

dịch thể (môi trờng nền MS; 2,5% đờng và các chất điều hòa sinh trởng là NAAvới nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 mg/l; BAP với nồng độ 1,0; 1,5; 2,0 mg/l).

Thí nghiệm 5 ảnh hởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả năngnhân chồi từ protocorm ở môi trờng dịch thể

Để so sánh hiệu quả nhân chồi từ protocorm của các môi trờng dịch thểso với các môi trờng rắn chúng tôi sử dụng các môi trờng sau:

ML5: MS + 2,5% đờng + 1,0 mg/l NAA +1,5 mg/l BAPML6: MS + 2,5% đờng + 1,0 mg/l NAA +2,0 mg/l BAPML7: MS + 2,5% đờng + 1,5 mg/l NAA +1,0 mg/l BAP

Thí nghiệm 6 ảnh hởng của mật độ nuôi cấy đến sự phát sinh biến dị và hệsố nhân chồi

Để nghiên cứu ảnh hởng của mật độ nuôi cấy đến sự phát sinh chồi biến dịvà hệ số nhân chồi, chúng tôi cấy các chồi dứa vào môi trờng MT6 với số lợng chồicấy ban đầu: 5, 10, 15, 20 chồi/bình

CT1: MT6 (MS + … + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP) + 5 chồi/bình + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP) + 5 chồi/bình CT2: MT6 (MS + … + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP) + 5 chồi/bình + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP) + 10 chồi/bình

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

CT4: MT6 (MS + … + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP) + 5 chồi/bình + 1 mg/l NAA + 2 mg/l BAP) + 20 chồi/bình

Thí nghiệm 7 ảnh hởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả năng tạocây hoàn chỉnh

Các chồi dứa to, khoẻ đợc cấy vào môi trờng tạo rễ để tạo cây hoànchỉnh ở thí nghiệm này, sử dụng môi trờng nền MS bổ sung thạch 0,8%; đ-ờng 2,5%; than hoạt tính 0,2% và các chất điều hòa sinh trởng là NAA vớinồng độ là 0,1; 0,25; 0,5 mg/l và BAP với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 mg/l.

 Đánh giá hiệu quả khử trùng

Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống / Tổng số mẫu cấy) x100 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm / Tổng số mẫu cấy) x100

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn17

Hệ số nhân chồi (lần) = (Số chồi tạo thành / Số chồi đa vào) Xác định số lá/chồi (cái) = Số lá tạo thành / Số chồi

Đo chiều cao chồi (cm)

 Đánh giá kết quả tạo protocorm từ chồi

Hệ số tạo protocorm (lần) = Số protocorm tạo thành / Số chồi đa vào Đánh giá kết quả nhân chồi từ protocorm

Hệ số nhân chồi (lần) = Số chồi tạo thành / Số protocorm đa vào Đánh giá tỷ lệ phát sinh chồi biến dị và hệ số nhân chồi

Tỷ lệ chồi biến dị (%) = (Tổng số chồi biến dị / Tổng số chồi) x100 Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi tạo thành / Tổng số chồi đa vào Đánh giá kết quả tạo cây hoàn chỉnh

Số rễ (cái/chồi) = Tổng số rễ tạo thành / Tổng số chồi ra rễ Xác định số lá/chồi (cái) = Số lá tạo thành / Số chồi

Đo chiều dài rễ (cm) Đo chiều cao chồi (cm)

2.3 Phơng pháp xử lý số liệu

Kết quả nghiên cứu đợc chúng tôi xử lý theo phơng pháp thống kê sinhhọc trên phần mềm tin học Excel.

 Tính trung bìnhGiá trị trung bình:

Độ lệch chuẩn: S =

Sai số chuẩn:

nSSX 

Sai số tuyệt đối: Xt(,f).SX

Kết quả: X = X+ XTrong đó Xi: giá trị của từng số liệu

n: số lần thí nghiệm

t(,f) tra bảng với (= 0,05 và f = n-1)

Vô trùng mẫu cấy là bớc đầu tiên có vai trò quyết định trong sự thành

công của quá trình nuôi cấy in vitro Nguồn mẫu dứa Cayen đa vào là các

chồi ngọn hoặc chồi nách có các mắt ngủ của cây đ ợc lấy ngoài tự nhiênchứa nhiều loại vi sinh vật Vì vậy, cần lựa chọn ph ơng pháp khử trùng vàloại hoá chất thích hợp để loại bỏ hoàn toàn mầm bệnh khỏi mẫu tr ớc khi đ-a vào môi trờng nuôi cấy Do đó, chúng tôi đã sử dụng các hoá chất khửtrùng là: cồn 700, javen 50% và thuỷ ngân clorua 0,1% (HgCl2) để khửtrùng mẫu trong những khoảng thời gian khác nhau.

Sau 10 ngày theo dõi chúng tôi thu đợc kết quả trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1 ảnh hởng của chế độ khử trùng đối với mẫu dứa Cayen

Chế độkhử trùng

Hoá chất và thời gian khử trùng

Số mẫu

Các chỉ tiêu đánh giáCồn

Tỷ lệmẫusống(%)

Tỷ lệmẫunhiễm

Tỷ lệmẫuchết(%)

Khi khử trùng mẫu cấy ở chế độ 1 bằng cồn 700 trong 30 giây, javen50% trong 5 phút, HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút thì tỉ lệ sống thấp chỉđạt 36%, tỉ tệ chết là 8% nhng tỉ lệ nhiễm rất cao lên tới 56%

Chế độ khử trùng 2 (HgCl2 0,1% 12 phút) cho tỉ lệ sống đạt cao hơn chếđộ 1 nhng không đáng kể, đạt 48% Còn tỉ lệ nhiễm và chết lần lợt là 44% và8%.

Khi tăng thời gian khử trùng của HgCl2 lên đến 15 phút (chế độ 3) thìhiệu quả khử trùng đạt đợc cao hơn hẳn ở chế độ khử trùng này cho tỷ lệ mẫusống là cao nhất, đạt 68% và tỷ lệ mẫu nhiễm là thấp nhất 20%.

Tiếp tục tăng thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% lên 17 phút ở chế độkhử trùng 4 thì tỉ lệ mẫu chết tăng lên đến 48% và tỉ lệ mẫu sống chỉ đạt 32%.

Nếu vẫn tiếp tục tăng thời gian khử trùng của HgCl2 0,1% lên tới 20phút (chế độ khử trùng 5) thì tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất đạt 17% nhng tỷ lệmẫu chết lại cao nhất đạt 56% và tỷ lệ mẫu sống đạt thấp nhất 27%

Nh vậy, để thu đợc các mẫu dứa Cayen vô trùng với tỷ lệ sống cao nênkhử trùng mẫu bằng cồn 700 trong 30 giây, javen 50% trong 5 phút, thuỷ ngân

Kết quả này tơng đối phù hợp với kết quả của Nguyễn Đức Thành và cskhi tiến hành nuôi cấy dứa Cayen Theo kết quả của Nguyễn Đức Thành thìkhử trùng mẫu dứa Cayen ở chế độ 3 (cồn 700 trong 30 giây, javen 50% trong5 phút, thuỷ ngân clorua 0,1% trong 15 phút) cho kết quả tốt [9].

Hình 3.2 Mẫu dứa Cayen khử trùng bằng thuỷ ngân clorua 0,1%trong 15 phút.

3.2 ảnh hởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả năng nhân chồi

Các mẫu sau khi khử trùng tách lấy các mầm ngủ và đỉnh sinh tr ởngcấy lên các môi trờng cảm ứng tạo chồi ban đầu Sau đó, lấy những chồi tạothành cấy lên môi trờng nhân chồi Môi trờng nhân chồi sử dụng môi trờngnền MS và bổ sung đờng 2,5%; thạch 0,8% và các chất điều hòa sinh trởnglà NAA với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 mg/l và BAP với nồng độ 1,0; 1,5; 2,0mg/l

Qua theo dõi chúng tôi thu đợc kết quả trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 ảnh hởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả năng nhân chồi

Chỉ tiêu sinh trởng sau 6 tuần Chỉ tiêu sinh trởng sau 10 tuầnHệ số

nhân chồi(lần)

Số lá/chồi(cái)

Chiềucao chồi

(cm)

Hệ sốnhân chồi

Số lá/chồi(cái)

Chiều caochồi (cm)MT1 20 1,300,2

0 91 3,31 0, 3,0000,3 142 5,20,1