Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (coffea robusta) để lên men tạo ethanol

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠKHOA NÔNG NGHIỆP

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆVI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI

(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨNGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠKHOA NÔNG NGHIỆP

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG MSNCS: P1114004

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆVI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI

(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ

LỜI CẢM ƠN

Để có được kết quả như ngày hôm nay, ngoài sự phấn đấu và nổ lực của chính bản thân còn có sự hỗ trợ rất lớn từ quý Thầy, Cô, gia đình, người thân cùng bạn bè Xin được ghi nhớ và gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý vị.

Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Lê Nguyễn Đoan Duy, người hướng dẫn chính và TS Phạm Văn Tấn, người hướng dẫn phụ Hai thầy đã truyền cho tôi rất nhiều kiến thức, thật nhiều kinh nghiệm và đặc biệt có những ý kiến đóng góp, trao đổi thật sự bổ ích, thiết thực về luận án tiến sĩ của tôi Nó như là nguồn động lực giúp tôi luôn luôn cố gắng và phấn đấu hết mình Một lần nữa tôi muốn nói, tôi rất biết ơn hai thầy.

Cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Hồ Quảng Đồ, PGS TS Nguyễn Văn Mười, PGS TS Lý Nguyễn Bình, PGS TS Nguyễn Công Hà, PGS TS Trần Thanh Trúc đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt tiến trình học tập.

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, Khoa Sau Đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Phòng thí nghiệm; các Phòng ban, Khoa liên quan đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại trường.

Đặc biệt, xin được gửi đến Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất Nhà trường và Viện đã hỗ trợ kinh phí, điều kiện và thời gian cho tôi trong bốn năm học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Cần Thơ Bên cạnh đó, tôi thật sự cảm động trước tình cảm và sự quan tâm giúp đỡ của các bạn đồng nghiệp trong và ngoài trường, xin cảm ơn các bạn rất nhiều.

Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã luôn luôn ủng hộ, sát cánh bên tôi Công ơn này tôi xin khắc sâu trong lòng.

NCS Đỗ Viết Phương

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định phương pháp tiền xử lý thích

hợp nhất trên đối tượng vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) Đồng thời, nghiên

cứu cũng tập trung thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ nấm mốc phân lập được từ quả cà phê Sau đó là quá trình ứng dụng enzyme này vào quá trình thủy phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả thủy phân với enzyme thương mại Bên cạnh đó, việc đưa ra chế độ khử độc dịch thủy phân, thiết lập các thông số cho quá trình lên men tạo ethanol cũng được quan tâm nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu đầu tiên là quá trình khử bớt caffeine và polyphenol trong vỏ quả cà phê bằng ba phương pháp trích ly khác nhau bao gồm: Trích ly thông thường, trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng và trích ly có sự hỗ trợ của siêu âm Tiếp sau đó là các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các tác nhân tiền xử lý acid, kiềm, vi sóng và vi sinh vật hay sự kết hợp của các tác nhân đến mức độ suy giảm hemicellulose và lignin Trong nội dung thứ hai, tiến hành phân lập nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ các nguồn: đất trồng, quả cà phê, thân cành lá Sau đó là quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc đã phân lập được bằng các tác nhân gây kết tủa khác nhau bao gồm: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone Enzyme thu nhận được cùng với enzyme thương mại được sử dụng để thủy phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả kinh tế là những vấn đề cơ bản trong nội dung 3 Bên cạnh đó, để đảm bảo cho quá trình lên men được thuận lợi thì dịch thủy phân cần phải được kiểm tra và loại bỏ một số chất có độc tính đối với nấm men Nội dung cuối cùng là khảo sát một số yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men cũng như là khảo sát một số phương pháp lên men khác nhau.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu suất khử caffeine và polyphenol bằng phương pháp trích ly có sự hỗ trợ vi sóng đạt 92,3% (đối với caffeine) và 87,7% (đối với polyphenol) cao hơn so với hai phương pháp còn lại Tuy nhiên, vì lý do kinh tế và tính khả thi nên phương pháp trích ly thông thường bằng nước nóng được lựa chọn cho việc khử caffeine và polyphenol Khi so sánh các phương pháp tiền xử lý khác nhau cho thấy, tiền xử lý bằng phương pháp kết hợp acid-kiềm-vi sóng đạt hiệu quả cao nhất khi loại bỏ được 71,4% hemicellulose và 79,2% lignin nhưng vẫn giữ lại được 69,5% cellulose ở điều kiện xử lý: H2SO4 2% ở 140oC trong thời gian 45 phút, NaOH (0,2 g/g) ở 120oC trong thời gian 20 phút và vi sóng ở mức công suất 327 W trong vòng 20 phút Trong số 5 dòng nấm mốc phân

lập được thì chủng Trichoderma asperellum QT5 (phân lập từ quả) có khả năng

sinh tổng hợp cellulase hoạt tính cao nhất và đạt 1,17 U/mL (CMCase) sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường lỏng cơ bản Sau đó enzyme cellulase thô được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol (tỷ lệ

enzyme:ethanol là 1:3,5) thì hoạt tính CMCase tăng lên đáng kể (21,72 U/mL) Ngoài ra, khi ứng dụng enzyme cellulase thu nhận được vào quá trình thủy phân và lên men kết quả cho thấy, đường khử tạo ra trong dịch thủy phân bởi enzyme cellulase thu nhận được là 26,02 g/L thấp hơn so với thủy phân bằng enzyme thương mại Viscozyme (43,26 g/L) nhưng hàm lượng ethanol tạo thành chỉ thấp hơn 13,8% Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, phương pháp lên men SHF cho hiệu quả thủy phân cao hơn SSF và SHF+SSF nếu không xem xét đến mặt thời gian nhưng ngược lại phương pháp lên men SSF cho hiệu quả thủy phân cao hơn nếu xét trong cùng một khoảng thời gian như nhau.

Từ khóa: Ethanol, sinh khối lignocellulose, Trichoderma asperellum,

thu nhận cellulase, tiền xử lý, thủy phân cellulose, vỏ quả cà phê.

The aim of the study was to determine the most suitable pretreatment

method for coffee pulp (Coffea robusta) In addition, the study also focused on

recovery of mold cellulase enzyme from coffee berries After that, this enzyme was used in hydrolysis of the coffee pulp Hydrolysis efficiency of the enzyme was compared with that of commercial enzymes Besides, the condition of hydrolysate detoxification and parameters of the ethanol fermentation process were also studied.

The first research content was to eliminate caffeine and polyphenols from coffee pulp using three different extraction methods including maceration, microwave-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction Then, experiments were to investigate the effects of pretreatment agents such as acid, alkali, microwave and microbiological or a combination of the agents on removing of hemicellulose and lignin In the second research, the isolation of mold which has high biosynthesis capacity to cellulase collected from various sources such as soil, branches, trunks, coffee pods The third research was the recovering process of cellulase enzyme from the mold isolated using various precipitating agents: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol and acetone The cellulase enzyme (crude) and commercial enzyme were used to hydrolyze the coffee pulp Then, the economic efficiency in coffee pulp hydrolysis were compared between the two enzymes Besides, to ensure that the fermentation was perfect, the hydrolyzate needs to be tested to remove some substances that were toxic to yeast The final content was to study some main factors affecting the fermentation process as well as to investigate some different fermentation methods.

The result showed that the eliminating efficiency of caffeine and polyphenols using the microwave-assisted extraction method reached 92.3% and 87.7% for caffeine and polyphenols, respectively These were higher than those of the other methods However, due to economic aspects and feasibility, the maceration was also selected for decaffeine and depolyphenols process When comparing different pretreatment methods, it revealed that the pretreatment in combination of dilute acid, dilute alkali and microwave was the most effective method, By the combination method, 69.5% of cellulose was retained; while 71.4% of hemicellulose and 79.2% of lignin were removed under treatment conditions as follows: H2SO4 2% at 140oC for 45 minutes, alkali pretreated with NaOH 0.2 g/g biomass at 120oC for 20 minutes, and microwave at 327 W for 20

minutes Among five strains of molds isolated, Trichoderma asperellum QT5 had

the highest activity of cellulase biosynthesis and reached

to 1.17 U/mL (CMCase) after 48 hours of culture in a basic liquid medium Then, the crude enzyme was purified using ethanol (enzyme:ethanol ratio was 1:3.5), the CMCase activity increased significantly (21.72 U/mL) In addition, when using the recovery cellulase enzyme for the hydrolysis and fermentation processes, the results indicated that the reduction sugar in the hydrolyzate using the recovery cellulase was 26.02 g/L lower than that of the commercial Viscozyme (43.26 g/L) but ethanol content was only 13.8% lower Furthermore, result of the study also showed that the SHF fermentation method was more effective hydrolysis than SSF and SHF + SSF if ignoring the fermentation time By contrast the SSF fermentation method was more effective hydrolysis than the others in the same fermentation time.

Keywords: Biomass lignocellulose, cellulose hydrolysis, coffee pulp,

enzyme recovery, ethanol, pretreatment, Trichoderma asperellum.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác.

Cần Thơ, ngày tháng năm

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 3

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 3

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu: 3

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu: 3

1.4 Ý nghĩa của luận án 4

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 4

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

1.5 Điểm mới của luận án 4

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Nguyên liệu cà phê 5

2.1.1 Giới thiệu về vỏ quả cà phê vối 5

2.1.2 Một số ứng dụng từ vỏ quả cà phê 8

2.1.3 Khả năng kháng vi sinh vật của caffeine và polyphenol 10

2.2 Sinh khối lignocellulose (nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học) 11

2.2.1 Cấu tạo và tính chất của cellulose 13

2.2.2 Cấu tạo và tính chất của hemicellulose 15

2.2.3 Cấu tạo và tính chất của lignin 18

2.3 Quá trình thủy phân vỏ quả cà phê 19

2.3.1 Cơ chế phân hủy sinh học cellulose 20

2.3.2 Cơ chế thủy phân hemicellulose 22

2.3.3 Cơ chế phân hủy lignin 26

2.4 Một số phương pháp tiền xử lý sinh khối lignocellulose 27

2.4.1 Tiền xử lý bằng acid 28

2.4.2 Tiền xử lý bằng kiềm 31

2.4.3 Tiền xử lý bằng vi sinh vật 33

2.5 Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus và Trichoderma 36

2.5.1 Giới thiệu về Aspergillus niger 36

2.5.2 Giới thiệu về Trichoderma 37

2.5.3 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 38

2.6 Thực trạng sản xuất ethanol trên thế giới và ở Việt Nam 42

2.6.1 Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới 42

2.6.2 Tình hình sản xuất ethanol ở Việt Nam 44

2.7 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 46

2.7.1 Một số nghiên cứu về tiền xử lý sinh khối lignocellulose 46

2.7.2 Một số nghiên cứu về sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose 48

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52

3.1 Phương tiện nghiên cứu 52

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 52

3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất 52

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị 53

3.2 Phương pháp nghiên cứu 54

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 54

3.2.2 Các phương pháp phân tích và đo đạc 55

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 56

3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 57

3.3.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả cà phê vối 58

3.3.2 Nội dung 1: Khảo sát quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê 58

3.3.3 Nội dung 2: Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc 66

3.3.4 Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 70

3.3.5 Nội dung 4: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men 74

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 78

4.1 Xác định thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối 78

4.2 Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin 79

4.2.1 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine và polyphenol 79 4.2.2 Tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine và polyphenol 82

4.2.3 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin 84

4.2.4 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin 90

4.2.5 Tiền xử lý vỏ quả cà phê bằng chủng nấm P chrysosporium 93

4.2.6 Hiệu quả của việc kết hợp nhiều phương pháp tiền xử lý trên đối tượng vỏ quả cà phê 96

4.3 Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc 103

4.3.1 Kết quả phân lập một số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấm Aspergillus và Trichoderma 103

4.3.2 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm mốc phân lập được 105 Định danh năm dòng nấm mốc phân lập được 108

4.3.3 Xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy nấm T asperellum QT5 109

4.3.4 Thu nhận enzyme cellulase từ T asperellum QT5 bằng muối (NH4)2SO4 115

4.3.5 Thu nhận enzyme cellulase từ T asperellum QT5 bằng muối NaCl 116

4.3.6 Thu nhận enzyme cellulase từ T asperellum QT5 bằng dung môi ethanol và acetone 117

4.4 Nghiên cứu quá trình thủy phân cellulose có trong vỏ quả cà phê bởi hệ enzyme cellulase 120

4.4.1 Ảnh hưởng của loại enzyme đến hiệu quả quá trình thủy phân 120

4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân 123

4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình thủy phân 125

4.4.4 Tối ưu hóa các thông số quá trình thủy phân bởi enzyme cellulase thu nhận từ nấm mốc T asperellum QT5 127

4.4.5 Nghiên cứu quá trình khử độc dịch thủy phân 131

4.5 Nghiên cứu quá trình lên men dịch thủy phân vỏ quả cà phê 135

4.5.1 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu bổ sung vào quá trình lên men 135 4.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu được 136

4.5.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được 137

4.5.4 Ảnh hưởng của phương pháp lên men đến hàm lượng ethanol thu được 139

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 142

5.1 Kết luận 142

5.2 Đề xuất 142

TÀI LIỆU THAM KHẢO 143

PHỤ LỤC A: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA PHÂN TÍCH 160

PHỤ LỤC B: BẢNG KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 172

PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ GỬI MẪU PHÂN TÍCH 200

PHỤ LỤC D: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 209

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của quả cà phê vối 5

Bảng 2.2: Thành phần hóa học lớp vỏ quả cà phê vối 6

Bảng 2.3: Thành phần hóa học của lớp vỏ nhớt và vỏ trấu của quả cà phê vối 7

Bảng 2.4: Thành phần chất xơ có trong sinh khối lignocellulose 13

Bảng 2.5: Loại kiềm thường được sử dụng để tiền xử lý sinh khối lignocellulose 32

Bảng 2.6 Loại kiềm thường được sử dụng để tiền xử lý sinh khối lignocellulose 39

Bảng 2.7: Dự tính sản lượng ethanol toàn cầu 43

Bảng 3.1: Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích và đo đạc 56

Bảng 4.1: Thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối 78

Bảng 4.2: Mức thay đổi của các nhân tố tối ưu 82

Bảng 4.3: Bố trí thí nghiệm và kết quả dự đoán theo mô hình CCF 82

Bảng 4.4: Kết quả phân tích phương sai và các hệ số phương trình hồi quy 83

Bảng 4.5: Các thông số tối ưu của mô hình quy hoạch thực nghiệm 84

Bảng 4.6: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin theo nồng độ H2SO4 85 Bảng 4.7: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong vỏ quả cà phê theo tỷ lệ NaOH 90

Bảng 4.8: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin theo thời gian và độ ẩm nguyên liệu 94

Bảng 4.9: Số dòng nấm mốc được phân lập từ một số nguồn 104

Bảng 4.10: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme cellulase 106

Bảng 4.11: Đường kính vòng phân giải và hoạt tính CMCase từ các dòng nấm mốc 107 Bảng 4.12: Kết quả định danh các chủng nấm mốc phân lập được 109

Bảng 4.13: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến khả năng thu nhận enzyme Bảng 4.18: Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử và glucose giải phóng sau quá trình thủy phân 121

Bảng 4.19: Chi phí thủy phân của các loại enzyme khác nhau 122

Bảng 4.20: Mức thay đổi của các nhân tố tối ưu 128

Bảng 4.21: Bố trí thí nghiệm và kết quả dự đoán theo mô hình CCF 128

Bảng 4.22: Kết quả phân tích phương sai và các hệ số phương trình hồi quy 129

Bảng 4.23: Các thông số tối ưu của mô hình quy hoạch thực nghiệm 131

Bảng 4.24: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được 138

Bảng 4.25: So sánh hiệu quả lên men SHF, SSF và SHF+SSF 140

Bảng PL B.1: Ảnh hưởng của các phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine và polyphenol 172

Bảng PL B.2: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin theo nồng độ H2SO4 172

Bảng PL B.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay

đổi hàm lượng cellulose 173

Bảng PL B.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng hemicellulose 174

Bảng PL B.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng lignin 176

Bảng PL B.6: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin theo nồng độ NaOH 178

Bảng PL B.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng cellulose 178

Bảng PL B.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng hemicellulose 180

Bảng PL B.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng lignin 182

Bảng PL B.10: Tiền xử lý bằng chủng nấm P chrysosporium 183

Bảng PL B.11: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự thay đổi hàm lượng đường khử có trong dịch tiền xử lý 185

Bảng PL B.12: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau 185

Bảng PL B.13: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành đường glucose và đường khử sau quá trình thủy phân vỏ quả cà phê 186

Bảng PL B.14: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme cellulase 187

Bảng PL B.15: Đường kính vòng phân giải và hoạt tính CMCase 189

Bảng PL B.16: Hoạt tính CMCase theo các điều kiện nuôi cấy 189

Bảng PL B.17: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với muối Bảng PL B.21: Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử và glucose được giải phóng sau quá trình thủy phân 194

Bảng PL B.22: Chi phí khi sử dụng các loại enzyme khác nhau 194

Bảng PL B.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme cellulase bổ sung vào quá trình thủy phân 195 Bảng PL B.24: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng đường khử 195

Bảng PL B.25: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử 196

Bảng PL B.26: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành HMF và furfural có trong dịch thủy phân 196

Bảng PL B.27: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến sự tạo thành kết tủa CaSO4 197 Bảng PL B.28: Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến quá trình lên men 197

Bảng PL B.29: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol 198

Bảng PL B.30: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol 198

Bảng PL B.31: So sánh hiệu quả lên men SHF, SSF và SHF+SSF 199

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Cấu tạo quả cà phê vối 5

Hình 2.2: Các thành phần của vỏ qủa cà phê 6

Hình 2.3: Quy trình chế biến cà phê nhân ở Việt Nam 7

Hình 2.4: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ vỏ quả cà phê 8

Hình 2.5: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ nguồn cellulose trong vỏ quả cà phê 9 Hình 2.6: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ nguồn hemicellulose trong vỏ quả cà phê 9

Hình 2.7: Cấu trúc của lignocellulose 12

Hình 2.8: Mô phỏng cấu trúc của sinh khối lignocellulose 12

Hình 2.14: Các đơn vị cơ bản của lignin 19

Hình 2.15: Cơ chế hoạt động của Endo-β-1,4-glucanases 20

Hình 2.16: Cơ chế hoạt động của Endo-β-1,4-glucanases 21

Hình 2.17: Cơ chế hoạt động của Exo-β-1,4-glucanases 21

Hình 2.18: Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulase 22

Hình 2.19: Quá trình thủy phân hemicellulose bởi acid/kiềm 23

Hình 2.20: Sơ đồ chung quá trình thủy phân hemicellulose 24

Hình 2.21: Sơ đồ hình thành furfural từ đường 5C 24

Hình 2.22: Sơ đồ hình thành HMF từ đường 6C 25

Hình 2.23: Hydrate hóa HMF 25

Hình 2.24: Tóm tắt sơ đồ hình thành một số chất gây độc 26

Hình 2.25: Quá trình phân hủy lignin bởi kiềm 27

Hình 2.26: Quá trình phân hủy lignin bởi acid 27

Hình 2.27: Cấu trúc nguyên liệu trước và sau khi tiền xử lý 28

Hình 2.28: Phanerochaete chrysosporium trên môi truờng nuôi PGA 35

Hình 3.1: Quả và vỏ cà phê vối tươi 52

Hình 3.2: Các kích thước vỏ quả cà phê sau khi nghiền và sàng 55

Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 57

Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ 61

Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ, nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ 63

Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng nấm mục trắng P chrysosporium đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ 64

Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 cho vào để khử độc dịch thủy phân 73

Hình 4.1: Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine và polyphenol 80

Hình 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng cellulose có trong vỏ quả cà phê 87

Hình 4.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng hemicellulose có trong vỏ quả cà phê 87

Hình 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng lignin có trong vỏ quả cà phê 87

Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi

hàm lượng cellulose có trong vỏ quả cà phê 91

Hình 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng hemicellulose có trong vỏ quả cà phê 91

Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng lignin có trong vỏ quả cà phê 91

Hình 4.8: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự thay đổi hàm lượng đường khử có trong dịch tiền xử lý 98

Hình 4.9: Sự thay đổi thành phần chất xơ trong vỏ quả cà phê theo các phương pháp tiền xử lý khác nhau 98

Hình 4.10: Bề mặt của vỏ quả cà phê sau khi được tiền xử lý bằng các phương pháp khác nhau dưới kính hiển vi điện tử (SEM) 100

Hình 4.11: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành đường glucose và đường khử sau quá trình thủy phân 101

Hình 4.12: Sự thay đổi tỷ lệ các thành phần có trong vỏ quả cà phê qua các bước tiền xử lý khác nhau 103

Hình 4.13: Sự thay đổi màu sắc, hình dạng của nguyên liệu qua các bước tiền xử lý khác nhau 103

Hình 4.14: Khuẩn lạc của Aspergillus phân lập được từ cành lá mục, quả cà phê và từ đất trồng (Các hình tương ứng từ trái sang phải) 105

Hình 4.15: Khuẩn lạc của Trichoderma phân lập được từ cành lá mục, quả cà phê và từ đất trồng (Các hình tương ứng từ trái sang phải) 105

Hình 4.16: Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng nấm mốc 108

Hình 4.17: Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt lực CMCase 110

Hình 4.18: Ảnh hưởng của pH và nồng độ dịch chiết khoai tây đến hoạt lực CMCase 112 Hình 4.19: Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến hoạt lực CMCase 113

Hình 4.20: Ảnh hưởng của cơ nguồn nitơ và khoáng chất đến hoạt lực CMCase 114

Hình 4.21: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy 124

Hình 4.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử

Hình 4.26: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành HMF và furfural có trong dịch thủy phân 132

Hình 4.27: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến sự tạo thành kết tủa CaSO4 134

Hình 4.28: Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến hàm lượng ethanol và đường glucose 135

Hình 4.29: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu được 136

Hình 4.30: Ethanol thu được theo thời gian lên men 138

Hình PL D.1: P chrysosporium nuôi cấy 7 ngày 209

Hình PL D.2: Nhân giống chủng P chrysosporium 209

Hình PL D.7: A niger và T asperellum phân lập được từ cà phê 211

Hình PL D.8: T longibrachiatum và P Chrysosporium phân lập được từ cà phê 211

Hình PL D.9: Nguyên liệu ban đầu 212

Hình PL D.10: Nguyên liệu sau tiền xử lý 212

Hình PL D.11: Xác định hàm lượng chất xơ 212

Hình PL D.12: Chuẩn bị mẫu tiền xử lý 213

Hình PL D.13: Tiền xử lý bằng chủng P chrysosporium sau 10, 15 và 20 ngày 213

Hình PL D.14: Kết tủa enzyme thô 213

Hình PL D.15: Xây dựng đường chuẩn 214

Hình PL D.16: Nhân giống nấm men 214

Hình PL D.17: Dịch thủy phân 214

Hình PL D.18: Lên men dịch thủy phân 214

: Năng lượng sinh học : Potato glucose agar : Phụ phẩm nông nghiệp : Phòng thí nghiệm

: Scanning electron microscopy

: Separate hydrolysis and fermentation

: Simultaneous saccharification and fermentation

: Thí nghiệm

: Thành phố Hồ Chí Minh : Tiền xử lý

: Vi sinh vật

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam hiện nay là nước xuất khẩu cà phê vối đứng thứ nhất trên thế giới, cũng như có tổng sản lượng cà phê nhân xuất khẩu đứng thứ hai trên thế giới chỉ sau Brazil Tổng sản lượng trong năm 2018 là 1.758.000 tấn cà phê nhân (USDA, 2018) và hàng năm thải ra môi trường khoảng 460.000 tấn vỏ cà phê khô Lượng phế thải này chủ yếu là làm chất đốt để sấy quả và hạt cà phê Tuy nhiên việc dùng vỏ cà phê để làm chất đốt hiện nay gây ô nhiễm môi trường một cách trầm trọng Ngoài ra, một phần vỏ cà phê người dân ủ đống và bón lại cho các gốc cây cà phê nhưng cũng không có hiệu quả cao vì vỏ cà phê chưa qua xử lý để chuyển thành phân bón Cho đến thời điểm hiện tại, cũng chỉ một phần nhỏ được sản xuất làm phân bón và làm thức ăn gia súc.

Trên thế giới cũng có các công trình nghiên cứu tận dụng phế thải từ cà phê như: Sử dụng vỏ cà phê, lá cà phê làm giá thể để trồng nấm (Leifa et al., 2001), sửdụng vỏquảcà phê, vỏtrấu cà phê làm nguồn carbon để lên men tạo acid gibberellic từ đó sản xuất acid citric (Shankaran and Lonsane, 1994) Vỏ cà phê còn được sử dụng để sản xuất than hoạt tính trong công nghiệp xử lý nước thải (Franca et al., 2009) Đáng quan tâm nhất, vỏ quả cà phê cũng được nghiên cứu sản xuất ra ethanol bằng phương pháp hóa học (Shenoy et al.,

2011) Tuy nhiên nghiên cứu này có hạn chế lớn khi dùng acid và kiềm mạnh để thủy phân vỏ quả sẽ gây ô nhiễm môi trường ở mức nghiêm trọng cũng như trang thiết bị cơ giới hóa tốn kém, khó chế tạo.

Trong vài thập niên gần đây, đứng trước nhu cầu năng lượng ngày càng tăng và vấn đề ô nhiễm môi trường do sử dụng nhiên liệu hóa thạch đã thúc đẩy các nước phải quan tâm nhiều hơn trong việc theo đuổi và thay thế bằng các nguồn năng lượng tái tạo và đặc biệt là sản xuất ethanol Một trong những nguồn nguyên liệu dồi dào nhất đến thời điểm hiện tại để sản xuất ethanol đó là sinh khối lignocellulose Các nhà khoa học ước tính rằng sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose có thể tăng gấp 16 lần sản lượng hiện tại (Sahaand Cotta, 2008).

Nghiên cứu gần đây chỉra tiềm năng tuyệt vời của phế thải vỏcà phê trong việc sản xuất ethanol (Kwon et al., 2013) Nếu đốt ethanol thay vì xăng sẽ giảm hơn 80% lượng khí thải carbon ra môi trường (Mussattoet al., 2011).

Tuy nhiên rào cản lớn nhất trong việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu này đó chính là trong nguyên liệu có chứa nhiều hemicellulose và lignin Các chất này liên kết chặt chẽ với cellulose và tạo rào chắn bảo vệ sự tấn công của các loại hóa chất cũng như các loại enzyme tới phân tử cellulose (Ragauskas et al., 2006;

chiếm khoảng 17,5÷20,07% là tương đối cao Điều này như là một cản trở lớn cho quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê trước khi thủy phân và lên men tạo ethanol Do đó, cần thiết phải có những khảo sát về các phương pháp tiền xử lý để loại bỏ thành phần lignin này đồng thời phải giữ lại lượng cellulose có trong nguyên liệu trước khi tiến hành quá trình thủy phân và lên men tạo ethanol.

Để có thể sản xuất ethanol, các polymer sinh học mà chủ yếu là cellulose phải được phân giải thành các đường đơn Có hai hướng tiếp cận vấn đề này, đó là thông qua thủy phân bằng acid và thủy phân bằng enzyme Công nghệ thủy phân bằng acid cho đến hiện nay không còn nghiên cứu nhiều mà các nghiên cứu tập trung vào thủy phân bằng enzyme hứa hẹn sẽ mang lại nhiều đột phá về mặt công nghệ Tuy nhiên, thủy phân bằng enzyme gặp phải vấn đề lớn đó là giá thành enzyme còn khá cao Các chế phẩm enzyme cellulase thương mại đến từ các nhà sản xuất lớn trên thế giới như Mỹ, Đan Mạch, Ấn

Độ giá thành dao động tùy thuộc vào hoạt lực chẳng hạn như: Cellulase từ A.niger giá 4,5 triệu đồng cho 25g (hoạt tính 0,8 U/mg), hay cellulase từ T.reesei giá 3,5 triệu đồng cho 50 mL (hoạt tính 700 U/g).

Cho đến hiện nay, các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme cellulase chủ yếu tập trung vào việc tách dòng gen mã hoá cellulase, tinh sạch và nghiên cứu đặc điểm hoá sinh của cellulase, tối ưu những điều kiện nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme từ các loài nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn Trái lại, việc khai thác ứng dụng cellulase từ nguồn tự nhiên gặp nhiều hạn chế do năng lực sinh tổng hợp của chủng giống, không chủ động nguồn enzyme, khó can thiệp thay đổi tính chất về động học enzyme, độ bền nhiệt độ và pH, khả năng hoạt động trong những điều kiện nồng độ cao chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ Do đó, rất cần có những nghiên cứu về việc ứng dụng cellulase có nguồn gốc tự nhiên mà đặc biệt là từ các chủng nấm mốc hiện diện ngay trên cơ chất thủy phân của enzyme cellulase.

Trên thực tế, việc sản xuất cà phê ở Việt Nam lại tập trung chủ yếu ở các tỉnh Tây Nguyên cho nên sẽ giảm thiểu được chi phí thu gom nguyên liệu Ngoài ra, có thể nhận thấy được tiềm năng về trữ lượng vỏ cà phê ở Việt Nam rất lớn, cùng với vấn đề mang tính thời sự đó là bài toán giải quyết ô nhiễm trường, tìm và thay thế nguồn năng lượng hóa thạch đang dần cạn kiệt Chính vì vậy, vỏ cà phê vối được chọn lựa làm nguyên liệu cho nghiên cứu: “Nghiên

cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffearobusta) để lên men tạo ethanol”.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Sử dụng các tác nhân acid, kiềm, vi sóng hay nấm mục trắng để tiền xử lý vỏ quả cà phê vối nhằm loại bỏ nhiều nhất hemicellulose và lignin ra khỏi nguyên liệu Đồng thời là quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc và ứng dụng vào thủy phân vỏ quả cà phê Dịch thủy phân được đem đi lên men để so sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme thu nhận được với enzyme thương mại.

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

(1) Khảo sát quá trình khử caffeine, polyphenol và quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê đồng thời tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine, khử polyphenol (2) Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ nấm mốc và tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với dung môi hữu cơ và muối vô cơ.

(3) So sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme thu nhận được và enzyme thương mại Đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và tối ưu hóa điều kiện thủy phân nhằm thu được hàm lượng đường khử là cao nhất.

(4) Kiểm tra thành phần dịch thủy phân và đưa ra phương pháp khử độc dịch thủy phân.

(5) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men và các phương pháp lên men dịch thủy phân để tạo ethanol.

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu1.3.1 Đối tượng nghiên cứu:

Vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta): Quả cà phê vối tươi được thu nhận

tại xã Pơng Drang – huyện Krông Buk – tỉnh Đăk Lăk Sau đó tách lấy vỏ quả rồi sấy khô ở 60oC trong 12 giờ.

Nguồn phân lập nấm mốc: Quả cà phê mốc, cành, thân, lá cây cà phê, đất trồng được thu nhận tại vườn trồng cà phê (xã Pơng Drang – huyện Krông Buk – tỉnh Đăk Lăk).

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu:

Phạm vi không gian: Đề tài chi tập trung các khâu chính như: tiền xử lý, nuôi cấy nấm mốc, thu nhận enzyme thô, thủy phân và lên men Một số nội dung khác đề tài không khảo sát như: tinh sạch enzyme, chưng cất.

3

Phạm vi thời gian: Khó khăn của đề tài là ở công đoạn tiền xử lý bằng vi sinh vật có thể kéo dài vài tháng, cho nên đề tài chỉ tập trung nghiên cứu, khảo sát thời gian tối đa là 60 ngày.

1.4 Ý nghĩa của luận án1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu và đưa ra các giải pháp hữu ích nhằm giải quyết vấn đề phụ phẩm trong công nghiệp chế biến là khuynh hướng nghiên cứu đang được quan tâm ở trong và ngoài nước Việc sử dụng vỏ quả cà phê vối là lựa chọn có ý nghĩa thực tiễn khi Việt Nam là nước xuất khẩu cà phê nhân lớn thứ 2 thế giới (đặc biệt, xuất khẩu cà phê Robusta lớn nhất thế giới).

Kết quả nghiên cứu từ luận án đã cung cấp số liệu về thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối, cho thấy tính khả thi của việc sử dụng nguồn phụ phẩm này như nguồn sinh khối lignocellulose tiềm năng để sản xuất ethanol.

Nghiên cứu đã chú trọng sử dụng các giải pháp hạn chế sử dụng hóa chất độc hại nồng độ cao bằng việc kết hợp các phương thức tiền xử lý.

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đặt cơ sở cho việc xây dựng quy trình sản xuất ethanol từ vỏ quả cà phê quy mô công nghiệp Đồng thời, góp phần khai thác triệt để và có hiệu quả nguồn phụ phẩm từ ngành công nghiệp cà phê ở Việt Nam.

1.5 Điểm mới của luận án

Đề xuất được giải pháp tiền xử lý có sự hỗ trợ của vi sóng để giảm đáng kể lượng hóa chất sử dụng (chỉ sử dụng kiềm loãng, acid loãng), giúp giảm ảnh hưởng đến môi trường và tăng hiệu suất; sự cần thiết của việc điều chỉnh thứ tự của các bước tiền xử lý theo thành phần nguyên liệu.

Đánh giá được sự hình thành và tác động của một số chất hóa học nguy hại cho quá trình lên men và đề xuất được giải pháp loại trừ.

Thu nhận được enzyme cellulase từ dòng nấm mốc Trichodermaasperellum (QT5) được phân lập từ bề mặt vỏ quả cà phê hỏng, ứng dụng có

hiệu quả trong thủy phân vỏ quả cà phê vối.

Thông tin từ kết quả nghiên cứu là tư liệu khoa học cho việc nghiên cứu về ethanol sinh học từ các nguồn phụ phẩm có hàm lượng lignin cao, sử dụng trong giảng dạy về quản lý và tận dụng phụ phẩm trong sản xuất thực phẩm.

2.Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu cà phê

2.1.1 Giới thiệu về vỏ quả cà phê vối

Vỏ cà phê là phụ phẩm đầu tiên thu được trong quá trình chế biến cà phê nhân ướt (Hình 2.3) Vỏ quả chiếm khoảng 43,2% trọng lượng tươi hoặc 28,7% trọng lượng chất khô của toàn bộ quả cà phê (Bảng 2.1) Ước tính hàng năm trên thế giới thải ra môi trường khoảng 22 triệu tấn vỏ quả tươi, 2,4 triệu tấn vỏ nhớt và khoảng 8,6 triệu tấn vỏ thóc Còn ở Việt Nam hàng năm thải ra môi trường khoảng 500 nghìn tấn vỏ quả khô Để xử lý nguồn phế phụ phẩm này đòi hỏi rất nhiều yếu tố như công nghệ, kinh tế và vấn đề môi trường Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của quả cà phê vối

Hình 2.1: Cấu tạo quả cà phê vối

(Nguyễn Thị Hiền và Nguyễn Văn Tặng, 2010)

Vỏ lụa khôVỏ trấu khô

Hình 2.2: Các thành phần của vỏ qủa cà phê

Hình 2.1 cho thấy, thứ tự các lớp vỏ đi từ ngoài vào trong sẽ là: vỏ quả -> vỏ nhớt > vỏ trấu > vỏ lụa > nhân cà phê Trong đó:

Vỏ quả (coffee pulp): Là lớp vỏ ngoài, mềm có màu đỏ (lúc chín) Lớp vỏ quả có chiều dày 0,3÷0,5 mm (Hình 2.2) và chiếm 43,2% so với trọng lượng quả tươi (Bảng 2.1) Trong 100g vỏ quả cà phê có chứa khoảng: 8 g protein; 2,9 g chất béo; 28,6 g cellulose và 8,9 g tro Vỏ cà phê được xem như là nguồn thức ăn rất tốt cho động vật vì nguồn dinh dưỡng khá cao Tuy nhiên trong vỏ cà phê có chứa một số thành phần phi dinh dưỡng không tốt cho chuyển hóa thức ăn đối với động vật như: tannin (2 g/100 g) và caffeine (1,8 g/100 g) (Bảng 2.2).

Bảng 2.2: Thành phần hóa học lớp vỏ quả cà phê vối

Vỏ nhớt (mucilage): Nằm giữa lớp vỏ trấu và vỏ quả, rất khó tách ra Chiều dày lớp nhớt 0,2÷0,3 mm Thành phần chính là pectin và đường (Bảng 2.3) Lớp nhớt này không hòa tan, hút nước mạnh Lớp nhớt thường được dùng chế biến ra nước uống lên men hoặc ethanol.

Vỏ trấu (parchment): Là lớp vỏ mỏng và cứng bao bọc xung quanh nhân Vỏ trấu chứa nhiều chất xơ, caffeine (khoảng 0,4%) (Bảng 2.3) được khuếch tán ra từ nhân cà phê lúc lên men hoặc lúc phơi khô Vỏ trấu dùng thường dùng làm chất đốt hoặc than hoạt tính.

Vỏ lụa: Rất mỏng, nằm sát nhân, bám chặt vào nhân Có thể tách hoặc không tách lớp vỏ này trong quá trình chế biến cà phê nhân.

Bảng 2.3: Thành phần hóa học của lớp vỏ nhớt và vỏ trấu của quả cà phê vối

Quy trình sản xuất cà phê nhân ướtQuy trình sản xuất cà phê nhân khô

Hình 2.3: Quy trình chế biến cà phê nhân ở Việt Nam

7

2.1.2 Một số ứng dụng từ vỏ quả cà phê

Với thành phần dinh dưỡng đầy đủ như vỏ quả cà phê thì đây là điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, là nguyên nhân gây thối rữa Không phải nhà máy nào, người dân nào cũng có điều kiện để sấy khô vỏ quả cà phê vì tốn kém chi phí mà không mang lại lợi nhuận nào Chính vì lẽ đó, việc thải ra môi trường khối lượng lớn vỏ cà phê là điều không tránh khỏi Điều này đã làm lãng phí nguồn nguyên liệu có sẵn và gây ô nhiễm môi trường xung quanh.

Cho nên nhiều nước trên thế giới như Brazil, Mexico, Costarica, đã nghiên cứu các giải pháp tận dụng nguồn phế phụ phẩm này để chế biến ra các sản phẩm có giá trị gia tăng (Hình 2.4).

(nghiên cứu này)

Hình 2.4: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ vỏ quả cà phê

(Mussatto et al., 2011)

8

Giấy Chà, đập Cellulose Phân hủy EnzymeGlycerol Nấm men, Protein

Hình 2.5: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ nguồn cellulose trong vỏ quả

2.1.3 Khả năng kháng vi sinh vật của caffeine và polyphenol2.1.3.1 Khả năng kháng khuẩn của caffeine

Caffeine gây độc cho hạt giống nảy mầm, vi sinh vật và các sinh vật biển, là chất độc đối với vi khuẩn Caffeine ở nồng độ trên 0,0025 g/mL ức chế sự phát triển của nhiều loài vi khuẩn trong môi trường phát triển Một vài nghiên cứu đã cho thấy tác dụng gây đột biến của caffeine qua sự ức chế sửa chữa ADN

ở vi khuẩn Caffeine ở nồng độ 0,1% có khả năng làm ức chế tổng hợp protein ở vi khuẩn và nấm men và các phản ứng này hoàn toàn bị ức chế ở nồng độ 1% caffeine (Ramanavičienėet al., 2003).

Ở nồng độ thấp khoảng 10-2 M caffeine ức chế phosphodiesterase gây sự ức chế hoặc trì hoãn trong phân chia tế bào Đối với nấm men, lượng caffeine > 10 mM có thể gây đột biến Ở nồng độ thấp, có khả năng kháng khuẩn nên vẫn có thể sinh trưởng và

phát triển như E coli và các chủng vi khuẩn khác Caffeine cũng ảnh hưởng đến quá trìnhlên men lactose và sự tổng hợp của indol do E coli (Ibrahim et al., 2014) Trong nghiên

cứu về tác động của caffeine trên nấm sợi, cả loài Trichoderma và các mầm bệnh, cho

thấy rằng caffeine thể hiện chức năng kép: ức chế quá trình nấm mọc và phát triển (Sugiyamaet al., 2016).

Trong cà phê, caffeine là thành phần có khả năng kháng khuẩn Một báo cáo cho thấy rằng caffeine tinh khiết có tác dụng kháng khuẩn trực tiếp Hơn nữa, caffeine là chất chống dính và có khả năng phòng chống sâu răng vì nó có

thể làm giảm độ bám dính của vi khuẩn Streptococcus bám vào bề mặt răng

(Rahmanet al., 2014).

Aspergillus niger và Aspergillus carbonarius bị ức chế bởi caffeine vớinồng độ <1% caffeine Đối với các chủng Aspergillus westerdijkiae,Aspergillus ochraceus và Aspergillus steynii, mặc dù bị ức chế tăng trưởngnhưng một số vẫn có thể phát triển ở 4% caffeine (Akbaret al., 2016).

2.1.3.2 Khả năng kháng khuẩn của polyphenol

Một số phenolic như furanocoumarins không gây ngộ độc nhưng khi tiếp xúc với nhiệt độ cao, dưới ánh sáng có bước sóng gần với tia tử ngoại thì nó trở nên rất độc hại Ngoài ra, nó có thể gắn với DNA ở vị trí gốc kiềm pirimidine làm ức chế khả năng tự sao chép và cuối cùng tế bào chết dần hoặc bị biến đổi gen Phenolic còn có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật thông qua tác dụng bịt kín các trung tâm hoạt động của enzyme (Dương Thanh Liêm, 2012).

Flavonoid và các acid phenolic là các đại diện có trong các hợp chất phenolic có tác dụng như tác nhân kháng khuẩn, chúng có khả năng chống lại các loại vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, bao gồm cả vi khuẩn

probiotic và các tác nhân gây bệnh đường ruột như Salmonela Ngoài ra, các

hợp chất phenolic còn có khả năng ức chế sự phát triển của nấm sợi có thể có mặt trong các loại rau trái không bị hư hỏng hoặc các mô quả bị nhiễm mầm bệnh (LattéandKolodziej, 2000).

Các phenolic là chất thứ sinh được nghiên cứu sâu rộng và phổ biến nhất vì chúng có tiềm năng kháng khuẩn rất lớn Đại diện điển hình là quinon Khả năng kháng vi sinh vật của hợp chất tự nhiên này đã được nghiên cứu và chứng minh Nó tác động lên vi sinh vật dựa cơ chế tác động lên bề mặt tế bào, phá hủy lớp vỏ peptidoglycan hoặc phá hủy hệ thống enzyme màng và làm vi sinh vật chết Các hydrophenolic và các phenolic loại hydroxylcianic như caffeic acid, ferulic acid, coumaric acid,…có khả năng ức chế sự sinh trưởng

của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Salmonela typhi, Bacillussubtilis, E coli,… Các phenolic như tannin có thể ức chế một số liên cầukhuẩn như Streptococcus, Listeria monocytogenes,… Các hydroxylatephenolkhông ức chế mà gây độc cho nấm sợi, nấm men và vi khuẩn.

Phenolic có khả năng ức chế các loại nấm như Aspergillus parasiticus.Trong thí nghiệm nuôi cấy Aspergillus parasiticus cho thấy khi nồng độ tannin

được tăng lên đến 7,5%, ức chế sự phát triển của nấm đến 88%, và khi tăng

nồng độ tannin lên 20% ức chế 96% sự phát triển của Aspergillus parasiticus

(Sandersand Mixon, 1979).

Tannin là một hợp chất của phenolic và tannin có khả năng kháng nấm sợi

như: Epidermophyton floccosum; Microsporum canis; Microsporum gypseum;

Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum; Trichophyton tonsurans;Trichophyton Terrestre; Penicillium italicum; Aspergillus fumigatus; Mucorracemosus; Rhizopus nigricans và kháng nấm men như: Candida albicans,Candida glabrata; Candidata krusei; Cryptococcus neoformans Tannin có thể

gây độc cho nấm sợi, nấm men và vi khuẩn Tannin có thể tạo ra chất nền không

thể sử dụng được cho các vi sinh vật Có khả năng kìm hãm vi khuẩn Bacillus

anthracis, Corynebacterium pseudomalliae (Scalbert, 1991).

2.2 Sinh khối lignocellulose (nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học)

Sinh khối lignocellulose là hợp chất hữu cơ phong phú nhất trên trái đất Thế giới tạo ra khoảng 150 tỉ tấn sinh khối hàng năm (Balat and Ayar, 2005) Trong đó, một số cây nông nghiệp có thể tạo ra 24 tấn sinh khối/hecta/năm, các loại tảo và cỏ tạo ra 50 tấn sinh khối/năm.

Sinh khối lignocellulose là nguyên liệu đầy hứa hẹn cho nhiên liệu tái tạo trong tương lai, là nguồn tài nguyên bền vững trong việc sản xuất các sản phẩm hữu cơ Hơn nữa sinh khối lignocellulose có thể được sản xuất ở nhiều khu vực

trên thế giới không có nhiều dầu mỏ, mở ra một lộ trình mới để sản xuất nhiên liệu và hóa chất hữu cơ Vật liệu lignocellulose chủ yếu chứa hỗn hợp các polymer carbohydrate như cellulose, hemicellulose và lignin Cellulose là một polymer tuyến tính không phân nhánh của glucose Hemicellulose thuộc về một nhóm dị thể polysaccharide chứa cả đường 6 carbon và 5 carbon Cấu trúc phân tử lignin rất phức tạp với các đơn vị phenylpropane liên kết trong một cấu trúc ba chiều Ngoài ra chúng cũng chứa một ít protein và chất chiết xuất khác với tỷ lệ nhỏ (5÷15%) (Wymanet al., 2005).

Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô… Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose, lignin (Palonen and Hetti, 2004).

Hình 2.7: Cấu trúc của lignocellulose

(Palonen and Hetti, 2004)

Hình 2.8: Mô phỏng cấu trúc của sinh khối lignocellulose

(Ramos and Pereira, 2003)

Ba thành phần này liên kết chặt chẽ với nhau chủ yếu qua liên kết cộng hóa trị (Pérez et al., 2002) Trong đó cellulose là một polymer đơn giản nhất, nó chứa nhiều phân tử glucose Còn hemicellulose là một polysaccharide phức tạp chúng có vai trò liên kết các sợi cellulose lại với nhau và có liên kết chéo với lignin Lignin là một polymer ba chiều của các đơn vị phenylpropanoid, được coi là chất keo tế bào tạo nên sự vững chắc cho thành tế bào Khi ba thành phần trên liên kết chặc chẽ với nhau và chúng tạo thành một mạng lưới phức tạp và có cấu trúc vững chắc (Rubin, 2008).

Bảng 2.4: Thành phần chất xơ có trong sinh khối lignocellulose

Nguyên liệu hoặc chất thải Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%)

Là hợp chất hữu cơ có công thức (C6 H10O5)n, là một polysaccharide phức tạp, gồm một chuỗi tuyến tính từ vài trăm đến hơn 10.000 đơn phân D – glucose nối với nhau bởi liên kết 1,4 β – glucoside (Crawford, 1981; Sjostrom, 2013).

Hình 2.9: Cấu trúc cellulose

(Wyman and Charles, 1996)

Cellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào ở thực vật, nhiều loại tảo và lớp nấm trứng (Oomycetes) Một số loài vi khuẩn sản sinh cellulose để tạo thành màng sinh học Cellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trên trái đất Khoảng 33% khối lượng khô của thực vật là cellulose, sợi bông là 90%, gỗ là 40÷50% và cây gai dầu khô là khoảng 75% (Buschle-Dilleret al., 1999).

Khác với các carbohydrate phức tạp khác như tinh bột, glycogel có cấu trúc cuộn lại hoặc phân nhánh, phân tử chính mở rộng và cấu tạo giống hình que khá cứng, cellulose là một polymer có cấu trúc mạch thẳng không cuộn hoặc phân nhánh Sự khác biệt này là do các đơn phân trong cellulose nối với nhau bằng cầu nối 1,4 β – glycoside; trong khi các carbohydrate khác lại là liên kết 1,4 α – glycoside Nhờ đặc tính này mà các phân tử cellulose dai hơn, bền hơn, rất khó phân hủy ở điều kiện thường (Nguyễn Huy Phiêu và Phùng Ngọc Bộ,2002).

Cellulose bao gồm các vùng kết tinh và vùng vô định hình Các chuỗi được cấu tạo từ ít nhất 500 phân tử glucose và chúng được xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm Mỗi chuỗi có nhiều nhóm -OH tự do, vì vậy các sợi ở cạnh nhau liên kết với nhau bằng liên kết hydro Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose Cellulose có nguồn gốc từ thực vật thường được

tìm thấy trong hỗn hợp với hemicellulose, lignin, pectin và các chất khác, trong khi cellulose từ vi khuẩn là khá tinh khiết, có hàm lượng nước cao hơn nhiều (Klemm et al., 2005).

Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và lực Van der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình Trong vùng kết kinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết lỏng lẻo nên dễ bị tấn công Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình (Miettinen-Oinonen, 2004).

Tính chất:

Cellulose là một polymer rắn bán tinh thể, không bị nóng chảy và khá bền với nhiệt Ở nhiệt độ gần đến 180oC, các vùng vô định hình của cellulose chưa bị phá hủy, không có chuyển động phân tử quy mô lớn và các đặc tính cơ học vẫn được duy trì Có nghĩa là chúng trở nên cứng khi khô và dẻo khi ướt Cellulose không hòa tan trong nước và hầu hết các dung môi hữu cơ Cellulose là chất nền hút ẩm, hấp thụ 8÷14% nước ở 20oC và độ ẩm tương đối 60% (RH) (Bohnet, 2003).

Cellulose có thể phân hủy sinh học và không có độc đối với cơ thể sống Sự phân hủy sinh học của cellulose là một bước thiết yếu trong chu trình carbon Nếu có thể đạt được sự phân hủy nhanh chóng bằng enzyme sẽ mang lại tiềm năng to lớn Đặc biệt, mối quan tâm lớn nằm ở việc sử dụng sinh khối cellulose như một nguồn năng lượng thông qua phân hủy thành đường sau đó có thể được chuyển đổi thành nhiên liệu lỏng (Demain et al., 2005).

2.2.2 Cấu tạo và tính chất của hemicellulose

Cấu tạo:

Hemicellulose là một polymer carbohydrate phức tạp và chiếm 25÷30% tổng trọng lượng khô gỗ Nó là một polysaccharide với trọng lượng phân tử thấp hơn cellulose (Pérez et al., 2002) Nó thường được tìm thấy trong liên kết với cellulose, protein, lignin và các hợp chất phenolic trong thành tế bào thứ cấp và sơ cấp của thực vật thông qua liên kết cộng hóa trị, liên kết hydro, liên kết ion và tương tác kỵ nước (Slavin et al., 1981).

Hemicellulose là thuật ngữ chỉ một nhóm các homo - và heteropolymer bao gồm các đơn phân chính: D – xylose, D – mannose, D – galactose, D – glucose, và các nhóm thế: L – arabinose, acid 4 – O – methyl – glucuronic, D – galacturonic và D – glucuronic Các phân tử đường liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 β và đôi khi là 1,3 β – glycoside Sự khác biệt chính với cellulose là

hemicellulose có phân nhánh với chuỗi bên ngắn gồm các loại đường khác nhau Do đó chúng dễ bị thủy phân hơn so với cellulose (Pérez et al., 2002).

Thành phần chính của hemicellulose trong gỗ cứng là glucuronoxylan và trong gỗ mềm là Glucomannan Glucuronoxylan trong gỗ cứng và thực vật thân thảo gồm mạch chính là 1,4 β – D – xylan với nhóm thế 1,2 α – 4 – O – methyl – D – giucuronic acid (hoặc 1,2 α – D – glucuronic acid), chiếm khoảng 10% dư lượng xylose Xylan trong trong gỗ mềm và thực vật thân thảo khác với xylan trong gỗ cứng ở chỗ chúng có arabinofuranose liên kết với mạch chính xylan bằng liên kết 1,3 α (Jeffries, 1994).

Hình 2.10: O – acetyl4 – O – methyl – D – glucuronoxylan từ hạt kín (Dekker, 1985)

Hình 2.11: Arabino – 4 – O – methylglucuronoxylan từ hạt trần (Dekker, 1985)

Các glucomannoxylan được cấu thành từ 1,4 β – D – glucose và β – D – mannose dư lượng trong mạch thẳng Glucomannan trong gỗ cứng chứa liên kết 1,4 β giữa glucose và mannose hình thành chuỗi nhánh nhỏ Tỷ lệ mannose: glucose là khoảng 1,5:1 hoặc 2:1 trong hầu hết các cây gỗ cứng Glucomannan trong gỗ mềm đôi khi có các nhánh phụ galactose liên kết với mannose mạch chính bằng 1,6 α Các liên kết 1,6 α của galactose là rất nhạy cảm với acid và kiềm và có thể phân cắt trong môi trường kiềm Các xylan trong gỗ mềm và hầu

hết thực vật thân thảo đều có một phân tử L – arabinofuranosyl gắn vào thông qua liên kết với một số vị trí O – 3 của mạch chính Khoảng 60% đến 70% xylose của xylan trong gỗ cứng được acetyl hóa bằng liên kết ester ở vị trí 2 hoặc 3 Xylan trong thực vật thân cỏ và galactomannan trong gỗ mềm cũng được acetyl hóa, mặc dù mức độ thấp hơn (Jeffries, 1994).

Do có trọng lượng phân tử thấp và ít cấu trúc tinh thể nên hemicellulose dễ bị phân hủy trong môi trường acid hơn cellulose Tương tự như cellulose, hemicellulose có thể bị thủy phân trong điều kiện kiềm nhẹ, thậm chí hemicellulose có thể tan trong kiềm hoặc acid ở nhiệt độ cao (Na2CO3 5% hoặc HCl 2%) Hemicellulose có một ái lực tương đối với nước, cho nên nó có thể hình thành một trạng thái nhớt thậm chí là trở nên đặc sệt trong nước ở nồng độ 0,5% Ở nồng độ dung dịch 2% dung dịch không thể chảy và ở 4% dung dịch được coi là gel Ái lực này được quyết định bởi các liên kết của đường pentose trong cấu tạo của hemicellulose Ví dụ, arabinose và xylose chịu trách nhiệm chính hình thành các liên kết với nước khác nhau trên phân tử hemicellulose Chính đặc điểm này mang lại những ứng dụng pentose trong công nghệ thực phẩm (Yang, 2001).

Mặc dù một số dữ liệu chỉ rằng hemicellulose có chức năng như một polysaccharide dự trữ, kết hợp các phân tử lignin và cellulose làm tăng khả năng chống lại sự phân hủy enzyme của thành tế bào và sự không hòa tan của các thành phần trong thành tế bào Một số báo cáo cũng chỉ ra rằng xyloglucan có liên quan đến sự hình thành tế bào thực vật Tuy nhiên, quan điểm được chấp nhận chung cho rằng chính chức năng của hemicellulose tham gia vào việc xây dựng cấu trúc thành tế bào và điều hòa quá trình tăng trưởng của tế bào (Yang,2001).

2.2.3 Cấu tạo và tính chất của lignin

Cấu tạo:

Lignin hoặc lignen là một hợp chất hóa học phức tạp phổ biến nhất trong gỗ, và là một phần không tách rời của thành tế bào thứ cấp ở thực vật và một số loài tảo (Martone et al., 2009) Thuật ngữ này được giới thiệu vào năm

1819 bởi de Candolle và có nguồn gốc từ tiếng Latin: lignum (Sjostrom, 2013) có nghĩa là gỗ Đây là một trong những polymer hữu cơ phong phú nhất trên trái đất, chỉ sau cellulose, nó chiếm 30% carbon hữu cơ phi hóa thạch và từ 1/4 tới 1/3 khối lượng khô của gỗ Hàm lượng lignin trong gỗ thay đổi không những phụ thuộc vào loài cây mà còn phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện địa lý Ví dụ, trong cây lá kim chứa khoảng 20÷30%, cây lá rộng 20÷25%, trong khi cỏ là 5÷9% (Jeffries, 1994).

Lignin là hợp chất raxemic với khối lượng phân tử lớn, có đặc tính thơm và kị nước Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và tan trong acid vô cơ (Martone et al., 2009) Nghiên cứu xác định độ trùng hợp của lignin, người ta thấy có sự phân đoạn trong quá trình tách chiết và phân tử có chứa nhiều loại tiền chất xuất hiện lặp đi lặp lại một cách ngẫu nhiên trong đó chủ yếu là tại các mắt xích và nhiều nhất là dẫn xuất của phenylpropan.

Thành phần của lignin gồm 62÷65% carbon, 5÷6% hydro, nhiều nhóm metoxyl (-OCH3) và hydroxyl (-OH) tự do Lignin được tổng hợp bởi sự polymer hóa các tiền chất phenylpropanoid Có ba loại tiền chất được phân loại tùy theo số lượng nhóm methoxyl trên vòng thơm; gồm: coniferyl alcohol (guaiacyl propanol), coumaryl alcohol (p-hydroxyphenyl propanol), và sinapyl alcohol (syringyl propanol) được miêu tả bằng công thức hóa học sau (Martone et al., 2009).

Hình 2.14: Các đơn vị cơ bản của lignin

(Boerjan et al., 2003)

Tính chất:

Các tính chất hóa học của lignin bao gồm: halogen hóa, nitrat hóa và oxy hóa các phản ứng trên vòng phenyl; các phản ứng trên rượu benzyl, các liên kết ete trong chuỗi mạch bên hay các phản ứng tạo màu biến tính lignin.

Dưới tác động của lực cơ học, enzyme hoặc hóa chất thì cấu trúc mạng lưới ba chiều của lignin bị phân hủy thành các mảnh lignin có nhiều kích thước khác nhau, dẫn đến sự phân tán khối lượng phân tử của lignin.

Hydroxyl và nhiều nhóm phân cực tồn tại trong cấu trúc lignin đã làm cho phân tử lignin không hòa tan trong bất kỳ dung môi nào Tuy nhiên, do có sự hiện diện của nhóm phenolic hydroxyl hoặc carboxyl làm cho lignin có thể bị hòa tan trong dung dịch kiềm loãng, nước hoặc dung dịch muối.

Lignin có thể bị thủy nhiệt ở nhiệt độ cao, lignin trở nên mềm dẻo khi nhiệt độ thủy nhiệt đạt 127÷129oC và nước sẽ đóng vai trò là chất hóa dẻo trong lignin (TD, 2001).

2.3 Quá trình thủy phân vỏ quả cà phê

Quá trình thủy phân vỏ quả cà phê sau tiền xử lý chính là quá trình phân giải sinh học của cellulose và hemicellulose có trong vỏ quả cà phê dưới tác dụng của enzyme Thường thì cellulose sẽ thủy phân tạo thành glucose, nó giống như quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose Nhưng khác nhau ở chỗ, glucose trong cellulose được nối với các liên kết beta trong cấu trúc tinh thể khó phân hủy hơn nhiều so với liên kết alpha trong tinh bột vô định hình (Holtzapple,1993) Mặt khác, hemicellulose là một loại polymer vô định hình dễ bị thủy phân thành các loại đường hơn là cellulose Tuy nhiên, hemicellulose thường được tạo thành từ năm loại đường khác nhau: arabinose, galactose, glucose, mannose và xylose.

2.3.1 Cơ chế phân hủy sinh học cellulose

Để thủy phân hoàn toàn cellulose thành glucose phải nhờ sự phối hợp xúc tác của một phức hệ cellulase Cần có ba kiểu enzyme tham gia vào phức hệ này bao gồm: endo-β-1,4-glucanases, exo-β-1,4-glucanases và β-glucosidases.

Trước tiên là quá trình tái cấu trúc tinh thể cellulose Có thể do một loại enzyme không xác định hoặc có thể do nhiệt độ cao làm cắt đứt một số liên kết hydro chuyển cellulose tự nhiên (cellulose kết tinh) thành cellulose phản ứng (cellulose vô định hình) (Hình 2.15).

Hình 2.15: Cơ chế hoạt động của Endo-β-1,4-glucanases

(Budarin et al., 2010)

Tiếp theo đó, mở đầu cho quá trình thủy phân cellulose là sự hoạt động mạnh mẽ của enzyme Endo-β-1,4-glucanases (EC.3.2.1.4): Enzyme này còn có tên gọi khác: Endoglucanase, 1,4-endoglucane hydrolase (EG), Cx, CMCase, β-1,4-glucanase, pancellase SS, elludextrinase, cellulase A alkali cellulase Enzyme này xúc tác phân cắt bất kỳ liên kết kiểu β-1,4-glucoside tại các điểm bất kỳ trên khoảng giữa nội mạch vùng vô định hình của cellulose, tạo các mạch ngắn hơn