Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (coffea robusta) để lên men tạo ethanol tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩm Mã ngành: 62.54.01.01 L PHẠM T ĐỖ VIẾT PHƯƠNG ẤN QUỐC NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL Cần Thơ, 2020 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS TS Lê Nguyễn Đoan Duy P Người hướng dẫn phụ: TS Phạm Văn TấnGS.TS Nguyễn Văn Mười Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp sở Họp tại: Vào lúc: Phản biện 1: S Đái Thị Xuân Trang Phản biện 2: GS.TS Đống Thị Anh Đào Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Đỗ Viết Phương, Phạm Văn Tấn Lê Nguyễn Đoan Duy 2017 Determination of caffeine in coffee pulp (Coffea robusta) using UVVisible spectrophotometer Vietnam Journal of Chemistry, 55: 86-91 (ISSN 0866-7144) Do Viet Phuong, Pham Van Tan and Le Nguyen Doan Duy 2017 Optimizing decaffeination conditions from coffee pulp in Vietnam (Coffea robusta) using hot water extraction Proceedings of the 15th ASEAN Conference on Food Science and Technology, 112-118 (ISBN 978-604-67-1007-3) Đỗ Viết Phương, Lê Hương Thủy, Đàm Sao Mai, Đặng Thị Sáu, Lê Nguyễn Đoan Duy Phạm Văn Tấn 2018 Thu nhận enzyme cellulase từ Trichoderma asperellum QT5 phân lập từ cà phê huyện Krôngbuk, tỉnh Đăklăk, Việt Nam Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thôn, 3+4: 150-159 (ISSN 1859-4581) Đỗ Viết Phương, Lê Nguyễn Đoan Duy Phạm Văn Tấn 2019 Khảo sát trình tiền xử lý, thủy phân lên men vỏ cà phê để tạo thành cồn sinh học Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, 5: 115-123 (ISSN 1895-4581) Do Viet Phuong, Le Pham Tan Quoc, Pham Van Tan and Le Nguyen Doan Duy 2019 Production of bioethanol from Robusta coffee pulp (Coffea robusta L.) in Vietnam Foods and Raw materials, 7(1): 10-17 (ISSN 2310-9599) Chương MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết luận án Trong vài thập niên trở lại đây, đứng trước nhu cầu lượng ngày gia tăng vấn đề ô nhiễm môi trường sử dụng nhiên liệu hóa thạch thúc đẩy nước phải quan tâm nhiều việc theo đuổi thay nguồn lượng tái tạo đặc biệt sản xuất ethanol sinh học Một nguồn nguyên liệu dồi đến thời điểm để sản xuất ethanol sinh học sinh khối lignocellulose Các nhà khoa học ước tính sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose tăng gấp 16 lần sản lượng (Kwon et al., 2013) Nghiên cứu gần tiềm tuyệt vời phế thải vỏ cà phê việc sản xuất ethanol sinh học (Saha and Cotta, 2008) Nếu đốt ethanol thay xăng giảm 80% lượng khí thải carbon môi trường (Mussatto et al., 2011) Tuy nhiên rào cản lớn việc sản xuất ethanol từ nguồn ngun liệu ngun liệu có chứa nhiều hemicellulose lignin Các chất liên kết chặt chẽ với cellulose tạo rào chắn bảo vệ cơng loại hóa chất loại enzyme tới phân tử cellulose (Ragauskas et al., 2006; Hahn-Hägerdal et al., 2006) Đứng trước khó khăn nhà khoa học nghiên cứu tìm nhiều phương pháp tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose trước tiến hành đường hóa lên men Mặt khác, lignin biết đến thành phần cấu thành nên thành tế bào thực vật tảo Lignin diện nhiều tất loại thân gỗ, cịn gọi “chất gỗ” (Martone et al., 2009) Trong vỏ cà phê lignin chiếm khoảng 20,07% so sánh hàm lượng lignin vỏ cà phê với số nguồn sinh khối lignocellulose tương tự như: Lignin rơm rạ chiếm 4,65% ; lignin lõi bắp chiếm 15%; bã mía 20% cỏ 12÷18% (Sun and Cheng, 2002; Mosier et al., 2005; Goyal et al., 2008; Sassner et al., 2008; Zhang et al., 2009) Có thể nhận thấy rằng, hàm lượng lignin vỏ cà phê cao số nguồn sinh khối lignocellulose tương tự điều cản trở lớn cho trình tiền xử lý vỏ cà phê trước thủy phân lên men tạo ethanol Do đó, cần thiết phải có khảo sát phương pháp tiền xử lý để loại bỏ thành phần lignin đồng thời phải giữ lại lượng cellulose có nguyên liệu trước tiến hành trình thủy phân lên men tạo ethanol sinh học Trên thực tế, việc sản xuất cà phê Việt Nam lại tập trung chủ yếu tỉnh Tây Nguyên giảm thiểu chi phí thu gom ngun liệu Ngồi ra, nhận thấy tiềm trữ lượng vỏ cà phê Việt Nam lớn, với vấn đề mang tính thời tốn giải nhiễm trường, tìm thay nguồn lượng hóa thạch dần cạn kiệt Chính vậy, vỏ cà phê chọn lựa làm nguyên liệu cho nghiên cứu: “Nghiên cứu trình tiền xử lý hệ vi sinh vật phân giải vỏ cà phê để lên men tạo ethanol” 1.2 Mục tiêu đề tài Sử dụng tác nhân acid lỗng, kiềm lỗng, vi sóng hay nấm mục trắng để tiền xử lý vỏ cà phê vối nhằm loại bỏ nhiều hemicellulose lignin khỏi nguyên liệu Đồng thời trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc ứng dụng vào thủy phân vỏ cà phê Dịch thủy phân đem lên men để so sánh hiệu thủy phân enzyme thu nhận với enzyme thương mại 1.3 Nội dung nghiên cứu Khảo sát trình khử caffeine, polyphenol trình tiền xử lý vỏ cà phê đồng thời tối ưu hóa thơng số trình khử caffeine, khử polyphenol Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ nấm mốc tinh sơ phương pháp kết tủa với dung môi hữu muối vô So sánh hiệu thủy phân enzyme thu nhận enzyme thương mại Đồng thời khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình thủy phân tối ưu hóa điều kiện thủy phân nhằm thu hàm lượng đường khử cao Kiểm tra thành phần dịch thủy phân đưa phương pháp khử độc dịch thủy phân Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men phương pháp lên men dịch thủy phân để tạo ethanol 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án Nghiên cứu đưa giải pháp hữu ích nhằm giải vấn đề phụ phẩm công nghiệp chế biến khuynh hướng nghiên cứu quan tâm nước Việc sử dụng vỏ cà phê vối lựa chọn có ý nghĩa thực tiễn Việt Nam nước xuất cà phê nhân lớn thứ giới (đặc biệt, xuất cà phê Robusta lớn giới) Kết nghiên cứu từ luận án cung cấp số liệu thành phần hóa học vỏ cà phê vối, cho thấy tính khả thi việc sử dụng nguồn phụ phẩm nguồn sinh khối lignocellulose tiềm để sản xuất ethanol sinh học Nghiên cứu trọng sử dụng giải pháp hạn chế sử dụng hóa chất độc hại nồng độ cao việc kết hợp phương thức tiền xử lý 1.5 Điểm luận án Đề xuất giải pháp tiền xử lý có hỗ trợ vi sóng để giảm đáng kể lượng hóa chất sử dụng (chỉ sử dụng kiềm lỗng, acid lỗng), giúp giảm ảnh hưởng đến mơi trường tăng hiệu suất; cần thiết việc điều chỉnh thứ tự bước tiền xử lý theo thành phần nguyên liệu Đánh giá hình thành tác động số chất hóa học nguy hại cho trình lên men đề xuất giải pháp loại trừ Thu nhận enzyme cellulase từ dòng nấm mốc Trichoderma asperellum (QT5) phân lập từ bề mặt vỏ cà phê hỏng, ứng dụng có hiệu thủy phân vỏ cà phê vối Thông tin từ kết nghiên cứu tư liệu khoa học cho việc nghiên cứu ethanol sinh học từ nguồn phụ phẩm có hàm lượng lignin cao, sử dụng giảng dạy quản lý tận dụng phụ phẩm sản xuất thực phẩm 1.6 Kết cấu luận án Luận án bao gồm 142 trang với chương: Chương 1- Giới thiệu (trang 1-4); Chương 2- Tổng quan tài liệu (trang 5-51); Chương 3Phương pháp nghiên cứu (trang 52-79 với 28 thí nghiệm); Chương 4- Kết thảo luận (trang 78-141); Chương 5- Kết luận đề xuất (trang 142) Trong nội dung có 33 bảng 65 hình Bài viết sử dụng 262 tài liệu tham khảo, bao gồm 236 tài liệu tiếng Anh 26 tài liệu tiếng Việt Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vỏ cà phê Vỏ cà phê phụ phẩm thu trình chế biến cà phê nhân ướt Vỏ chiếm khoảng 43,2% trọng lượng tươi 28,7% trọng lượng chất khơ tồn cà phê Thành phần chất xơ (bao gồm cellulose, hemicellulose lignin) vỏ cà phê chiếm đến 51% (so với khối lượng vỏ khô), thành phần khác protein, pectin, tinh bột, đường khử, chiếm 49% Vỏ cà phê xem nguồn thức ăn tốt cho động vật nguồn dinh dưỡng cao Tuy nhiên vỏ cà phê có chứa số thành phần phi dinh dưỡng khơng tốt cho chuyển hóa thức ăn động vật như: tannin hay caffeine Bên cạnh đó, vỏ cà phê chứa lượng chất xơ lớn: 25,88% cellulose; 3,6% hemicellulose 20,07% lignin Do đó, vỏ cà phê xem nguồn sinh khối lignocellulose dùng sản xuất bioethanol (thế hệ sản xuất ethanol thứ 2) 2.2 Giới thiệu trình tiền xử lý Tiền xử lý xem bước quan trọng quy trình sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose thơng qua q trình tiền xử lý mà polymer carbohydrate sinh khối lignocellulose bị chuyển đổi thành dạng đường đơn giản trước thực trình lên men Việc chuyển đổi thường thực enzyme thủy phân Tuy nhiên tính chất không đồng phức tạp sinh khối lignocellulose (ví dụ như: độ kết tinh cellulose, mức độ trùng hợp, độ ẩm, diện tích bề mặt, mức độ liên kết lignin hemicellulose) nên sinh khối bắt buộc phải tiền xử lý trước để điều chỉnh hoạt động thủy phân enzyme Điều quan trọng trình tiền xử lý phải làm giảm nhiều lượng lignin hemicellulose có nguyên liệu mà giữ lại nhiều thành phần cellulose làm giảm độ kết tinh cellulose Để đánh giá hiệu trình tiền xử lý cần thiết phải dựa vào lượng đường khử giải phóng sau q trình thủy phân cần xem xét đến q trình trung hịa dịch tiền xử lý Bên cạnh cần phải quan tâm đến tính kinh tế tồn q trình xem xét chọn phương pháp tiền xử lý 2.3 Giới thiệu trình thủy phân vỏ cà phê Quá trình thủy phân vỏ cà phê sau tiền xử lý q trình phân giải sinh học cellulose hemicellulose có vỏ cà phê tác dụng enzyme Thường cellulose thủy phân tạo thành glucose, giống q trình thủy phân tinh bột thành đường glucose Nhưng khác chỗ, glucose cellulose nối với liên kết beta cấu trúc tinh thể khó phân hủy nhiều so với liên kết alpha tinh bột vơ định hình (Holtzapple, 1993) Để thủy phân hồn tồn cellulose thành glucose phải nhờ phối hợp xúc tác phức hệ cellulase Cần có ba kiểu enzyme tham gia vào phức hệ này: endo-β-1,4-glucanases, exo-β-1,4-glucanases βglucosidases Hemicellulose bị thủy phân enzyme endoxylanases, exoglycanases, xylanases, endomannanases, β4 xylosidase, …Bên cạnh đó, tác nhân acid lỗng kiềm lỗng thủy phân hemicellulose 2.4 Các nghiên cứu trình tiền xử lý sản xuất ethanol Trong thập niên gần đây, có nhiều nghiên cứu trình tiền xử lý sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose như: rơm rạ, lúa mì, bã mía, thân bắp, lõi bắp, cỏ gỗ mềm Chỉ có vài nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ vỏ cà phê Mới nhất, theo nghiên cứu (Shenoy et al., 2011) nghiên cứu trình sản xuất ethanol từ vỏ cà phê phương pháp thủy phân acid H2SO4 2% thời gian 30 phút 90oC Hàm lượng đường tổng số thu sau trình thủy phân 1,62 g/100 mL dịch thủy phân, đường khử 0,7 g/100 mL dịch thủy phân Sau đem lên men thu lượng ethanol 0,46 g/g đường Một nghiên cứu khác thực đối tượng vỏ trấu cà phê Vỏ trấu cà phê thủy phân acid H2SO4 1÷5%, tỷ lệ nguyên liệu:acid 1:10 thời gian thủy phân Hỗn hợp dịch thủy phân sau tiến hành lên men với nấm men thương mại S cereviciae nhiệt độ 30oC, pH = 5, thời gian 24 thu nồng độ ethanol cao 7,9 g/L (Sahu, 2014) Đa số cơng trình nghiên cứu trước tập trung dùng acid H2SO4 nồng độ trung bình đến cao để tiền xử lý kết hợp với thủy phân sinh khối lignocellulose nhằm mục đích thu đường khử ưu điểm thời gian xử lý rút ngắn nhiều so với việc dùng enzyme để thủy phân Ngoài tính kinh tế yếu tố ln quan tâm tiến hành sản xuất thương mại nghiên cứu trước đáp ứng điều dùng enzyme để thủy phân tốn nhiều lần so với dùng acid Tuy nhiên, nhược điểm lớn dùng acid để thủy phân gây ô nhiễm môi trường mức nghiêm trọng, thiết bị yêu cầu phải chịu acid nhiệt độ cao Cho nên nghiên cứu sau khơng cịn sử dụng acid để thủy phân mà phải sử dụng đến enzyme Theo nghiên cứu thuộc đề tài “Nghiên cứu công nghệ xử lý số loại phụ phẩm nông nghiệp (PPNN) nước áp suất cao để thu dung dịch đường có khả lên men tạo thành ethanol” (Nguyễn Hoàng Dũng, 2008), PPNN sử dụng rơm, rạ, trấu Để tạo thành ethanol, rơm, rạ, trấu xử lý thiết bị phản ứng thủy nhiệt quy mơ phịng thí nghiệm Sau tiếp tục nghiên cứu quy mô pilot thiết bị cấp nước áp suất cao Năm 2005, nhóm nghiên cứu TS Phan Đình Tuấn, trường Đại học Bách Khoa TP.HCM phụ trách thực nghiên cứu công nghệ xử lý phế phẩm sản xuất nông nghiệp rơm, rạ, trấu… nhằm sản xuất bioethanol, tiến tới xây dựng mơ hình “thị trấn biomass” xã Thái Mỹ, huyện Củ Chi, TP.HCM Sau gần năm thực hiện, nhà khoa học nghiên cứu, sản xuất thành công xăng sinh học từ rơm rạ chất thải có nguồn gốc cellulose (Hồng Hoa, 2014) Tuy nhiên, khó khăn dự án giá thành xăng sinh học sản xuất từ rơm rạ cao, chi phí phân hủy cellulose rơm rạ lớn Quá trình tiêu tốn nhiều lượng, hiệu suất nồng độ đường tạo thấp, dẫn đến hiệu suất trình lên men nồng độ ethanol tạo thấp nhiều so với trình sản xuất ethanol từ tinh bột Nếu phân hủy cellulose hóa chất, giá thành thấp hơn, dung dịch đường tạo chứa lượng hóa chất, khơng thuận lợi cho việc lên men ethanol Do đó, dự án hướng đến mục tiêu khơng dùng hóa chất để phân hủy cellulose Chi phí tinh chế ethanol sau lên men vấn đề khó khăn, gây tốn mặt lượng, dù thành công việc sản xuất xăng sinh học từ rơm rạ, để thương mại hóa sản phẩm, nhà khoa học tiếp tục nỗ lực nghiên cứu nhằm hạ giá thành sản phẩm Cũng có nhiều nghiên cứu q trình tiền xử lý kiềm loãng đối tượng rơm, bã mía, gỗ, … Tương ứng với loại nguyên liệu phải có khảo sát riêng biệt để tìm phương pháp tiền xử lý tối ưu cho loại ngun liệu Hầu hết loại sinh khối nơng nghiệp thơng thường có chế độ tiền xử lý tối ưu Tuy nhiên đối tượng vỏ cà phê chưa có nhiều nghiên cứu chun sâu Nhược điểm lớn sử dụng kiềm để tiền xử lý gặp phải khó khăn việc thu hồi lượng kiềm dịch sau thủy phân Ngoài việc sử dụng hóa chất địi hỏi dụng cụ thiết bị chịu nhiệt độ khả chịu ăn mòn cao Phương pháp khơng khuyến thích sử dụng quy mơ cơng nghiệp khả gây nhiễm môi trường tương đối nghiêm trọng Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện phương pháp nghiên cứu 3.1.1 Nguyên liệu Vỏ cà phê vối tươi thu nhận xã Pơng Drang, huyện Krông Buk, tỉnh Đăk Lăk Thời gian thu nhận từ tháng 11 đến tháng dương lịch Quả cà phê chín có màu đỏ tươi, không bị dập, không bị mốc Quả cà phê tươi sau thu hái tiến hành cho vào thùng xốp có ướp thêm đá vận chuyển phịng thí nghiệm thời gian khơng q 12 3.1.2 Enzyme nấm men Các enzyme thương mại sử dụng: Viscozyme® Cassava C: (Bagsvaerd, Đan Mạch), Celluclast® 1.5L (Novozyme, Đan Mạch), Glucosidase (Novozyme, Đan Mạch) Nấm men: Sacharomyces cerevisiae 3.1.3 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tiền xử lý Cân 50 g nguyên liệu vỏ cà phê sấy khơ cho vào bình cầu L, sau cho thêm 500 mL dung dịch H2SO4 2% (w/w) Nguyên liệu tiền xử lý nồi hấp tiệt trùng 140oC 45 phút Lấy để nguội dùng vải để lọc thu lấy phần bã rắn Rửa bã nhiều lần với nước pH trung tính Tiếp tục cho vào bình cầu 500 mL dung dịch NaOH nồng độ 0,2 g NaOH/g nguyên liệu Quá trình tiền xử lý kiềm thực 120oC 20 phút, sau chuyển vào lị vi sóng thực q trình tiền xử lý vi sóng mức cơng suất 327 W, thời gian 20 phút Cuối cùng, lọc, rửa trung tính sấy khô ban đầu (Phuong, Le Pham and Le Nguyen, 2019) Phương pháp thủy phân enzyme cellulase Cân 15 g nguyên liệu qua tiền xử lý cho vào erlen 250 mL Tiếp tục cho vào 150 mL dung dịch đệm citrate 0,05 mol/L, pH 4,8 Một thể tích enzyme cellulase cho vào với nồng độ 25 FPU/g 30 CBU/g Quá trình thực máy lắc có gia nhiệt 50oC, 150 vịng/phút thời gian 72 Kết thúc trình thủy phân, dịch ly tâm 2500 vòng 10 phút Thu lấy dịch ly tâm bỏ phần cặn Dịch ly tâm đem xác định tiêu đường khử, đường glucose (Phuong, Le Pham and Le Nguyen, 2019) Phương pháp lên men tạo ethanol Cho 250 mL dịch thủy phân vào bình lên men 500 mL Bổ sung thêm vào số thành phần môi trường: (NH4)2SO4 (1 g/L), K2HPO4 (0,1 g/L), MgSO4.7H2O (0,2 g/L) Hỗn hợp hấp tiệt trùng 121oC 20 phút sau làm nguội đến nhiệt độ phòng Bổ sung vào dịch lên men lượng tế bào nấm men S cereviciae ban đầu 3x108 cfu/mL Quá trình lên men thực điều kiện pH 5, nhiệt độ 30oC lắc 120 vòng/phút Tại thời điểm lên men khác lấy lượng dịch lên men xác định tiêu: ethanol, đường khử, đường glucose (Phuong, Le Pham and Le Nguyen, 2019) Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính enzyme cellulase (CMCase) Thí nghiệm 16-19: Ảnh hưởng nồng độ tác nhân kết tủa (NH4)2SO4, NaCl, ethanol acetone đến hoạt lực enzyme cellulase thu từ nấm mốc Mục tiêu: Khảo sát thay đổi hoạt lực enzyme cellulase thu từ nấm mốc thay đổi nồng độ tác nhân kết tủa enzyme Yếu tố khảo sát: Nồng độ (NH4)2SO4, nồng độ NaCl, tỷ lệ ethanol/enzyme thô, tỷ lệ acetone/enzyme thô Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính, hoạt tính riêng, hiệu suất thu hồi 3.2.4 Nội dung 3: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình thủy phân vỏ cà phê Thí nghiệm 20: Ảnh hưởng loại enzyme đến hàm lượng đường khử thu sau trình thủy phân Mục tiêu: Khảo sát thay đổi hàm lượng đường khử sau trình thủy phân thay đổi loại enzyme cho vào trình thủy phân Yếu tố khảo sát: Enzyme thu nhận, Viscozyme, Celluclast 1.5L, Glucosidase Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng đường khử, đường glucose Thí nghiệm 21-22: Ảnh hưởng nồng độ enzyme, nhiệt độ thời gian đến hàm lượng đường khử thu sau trình thủy phân Mục tiêu: Khảo sát thay đổi hàm lượng đường khử sau trình thủy phân thay đổi nồng độ enzyme, nhiệt độ thời gian thủy phân Yếu tố khảo sát: Nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng đường khử, đường glucose Thí nghiệm 23: Tối ưu hóa thơng số trình thủy phân Yếu tố khảo sát: Nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng đường khử 3.2.5 Thí nghiệm 24: Ảnh hưởng thể tích Ca(OH)2 đến hiệu khử độc dịch thủy phân Mục tiêu: Chọn thể tích Ca(OH)2 thích hợp để kết tủa gốc sulphate dịch thủy phân nhiều trước lên men tạo ethanol Yếu tố khảo sát: Thể tích Ca(OH)2 Chỉ tiêu đánh giá: Khối lượng kết tủa 12 3.2.6 Nội dung 4: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng q trình lên men Thí nghiệm 25-27: Ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men, nhiệt độ thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu Mục tiêu: Khảo sát thay đổi hàm lượng ethanol glucose thay đổi mật độ tế bào nấm men ban đầu cho vào trình lên men Yếu tố khảo sát: Mật độ tế bào nấm men, nhiệt độ lên men, thời gian lên men Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng ethanol tạo thành Thí nghiệm 28: Ảnh hưởng phương pháp lên men đến hàm lượng ethanol thu Mục đích: Khảo sát thay đổi hàm lượng ethanol tạo thành thực trình lên men với phương pháp khác thời điểm lên men khác Yếu tố khảo sát: Lên men SHF, lên men SSF, lên men SHF kết hợp SSF Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng ethanol tạo thành Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định thành phần hóa học vỏ cà phê vối Kết cho thấy thành phần hóa học vỏ cà phê bao gồm: đường tổng 9,18±0,23%, pectin 4,37±0,06%, protein tổng 9,52±0,23%, cellulose 25,88±0,91%, hemicellulose 3,6±0,18%, lignin 20,07±0,56%, chất béo 1,22±0,11%, caffeine 0,78±0,01%, polyphenol 8,69±0,12% tro 6,29±0,09% 4.2 Ảnh hưởng phương pháp tiền xử lý đến thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose lignin 4.2.1 Ảnh hưởng phương pháp trích ly hiệu suất khử caffeine polyphenol có vỏ cà phê Đối với phương pháp trích ly thơng thường: hiệu suất khử caffeine 88,1%, khử polyphenol 80,6% Đối với phương pháp trích ly nước có hỗ trợ siêu âm: hiệu suất khử caffeine 91,4%, khử polyphenol 85,5% Đối với phương pháp trích ly nước có hỗ trợ vi sóng: hiệu suất khử caffeine 92,3%, khử polyphenol 87,7% Phương pháp khử caffeine polyphenol lựa chọn trích ly nước nóng thơng thường tính kinh tế, hiệu thuận tiện 13 4.2.2 Tối ưu hóa thơng số trình khử caffeine polyphenol Để tìm giá trị tối ưu trình khử caffeine polyphenol nước nóng, tương tác ảnh hưởng nhân tố đến hiệu suất khử caffeine polyphenol, tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) với mơ hình CCF với thông số thay đổi là: X1: tỷ lệ dung mơi/ngun liệu, X2: nhiệt độ trích ly, X3: thời gian trích ly hàm mục tiêu nghiên cứu Y1 (%, hiệu suất khử caffeine), Y2 (%, hiệu suất khử polyphenol) Bảng 4.1: Thông số trình trích ly Các nhân tố tối ưu Ký hiệu Tỷ lệ dung mơi/ngun liệu (v/w) Nhiệt độ trích ly (oC) Thời gian trích ly (phút) X1 X2 X3 Các mức độ thay đổi -1 30/1 40/1 50/1 70 80 90 90 120 150 Phương trình hồi quy thu nhận sau: Y1= 88,33–3,56X1+5,17X2–7,6X12–9,97X22–5,23X32+4X1X3+4,49X2X3 (1) Y2= 80,65–1,28X1+1,59X2–4,24X12–3,19X22+0,52X1X2+0,77X1X3 (2) Cả phương trình hồi quy có p0,8) hệ số đánh giá khả dự đoán mơ hình Q2 0,968 0,914 (>0,5) chứng tỏ mơ hình đạt độ tin cậy cao Bảng 4.2: Các thơng số tối ưu mơ hình quy hoạch thực nghiệm Nhân tố Giá trị dự đoán tối ưu Giá trị kiểm tra X1 38,6/1 X2 82,9 X3 136,7 Y1 88,1 89,52±0,49 Y2 80,95 78,77±0,44 Kết tối ưu đạt từ mơ hình chọn lựa ban đầu là: Hiệu suất khử caffeine đạt 89,52% khử polyphenol đạt 78,77% điều kiện tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 38,6/1, nhiệt độ trích ly 82,9oC thời gian trích ly 136,7 phút 4.2.3 Ảnh hưởng trình tiền xử lý H2SO4 đến thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose lignin Khi tăng nồng độ acid, nhiệt độ thời gian tiền xử lý suy giảm cellulose, hemicellulose lignin tăng theo Tuy nhiên acid lỗng thực có hiệu việc loại bỏ hemicellulose khơng có hiệu cao lignin Điều kiện tiền xử lý tối ưu acid loãng H2SO4 vỏ cà phê là: Nồng độ acid 2% (w/w), tỷ lệ acid:nguyên liệu 10:1, nhiệt độ tiền xử lý 140oC thời gian 45 phút Ở điều kiện tiền xử lý 14 cellulose tổn thất 7,5%, hemicellulose bị loại bỏ 43,9% lignin bị loại bỏ 4,2% A–B Hình 4.1: Bề mặt vỏ cà phê trước (A) sau (B) tiền xử lý H2SO4 2% kính hiển vi điện tử (SEM) 4.2.4 Ảnh hưởng trình tiền xử lý NaOH đến thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose lignin Tiền xử lý kiềm lỗng thực có hiệu so với acid loại bỏ 46,11% hemicellulose, 76,63% lignin khỏi nguyên liệu giữ lại 71,25% cellulose Kết có tốt so với tiền xử lý acid loãng chưa phải tốt Điều kiện tiền xử lý tối ưu kiềm loãng NaOH vỏ cà phê là: Tỷ lệ kiềm 0,2 g/g NL, tỷ lệ nguyên liệu/dịch kiềm 1:10, nhiệt độ tiền xử lý 120oC thời gian 20 phút A–C Hình 4.2: Bề mặt vỏ cà phê trước (A) sau (C) tiền xử lý NaOH 0,2 g/g NL kính hiển vi điện tử (SEM) 4.2.5 Tiền xử lý vỏ cà phê chủng nấm P chrysosporium Sau 50 ngày tiền xử lý: cellulose giảm tối đa 23,7%, hemicellulose giảm 14,1% lignin giảm 51,4% Phương pháp tiền xử lý chủng nấm P chrysosporium chưa thực có hiệu việc loại bỏ hemicellulose lignin Tuy nhiên phương pháp thực nhiệt độ phòng khơng sử dụng đến hóa chất chi phí thấp khơng gây nhiễm mơi trường 15 A–D Hình 4.3: Bề mặt vỏ cà phê trước (A) sau (D) tiền xử lý nấm mục trắng kính hiển vi điện tử (SEM) 4.2.6 Hiệu việc kết hợp nhiều phương pháp tiền xử lý đối tượng vỏ cà phê 100 Cellulose Hemicellulose 90 % bị loại bỏ 78.5 76.6 80 54.8 60 43.9 40 47.1 28.7 30 34.2 7.5 50.2 34.4 29.6 20.7 12.8 20 10 79.2 71.4 77.4 68.7 70 50 Lignin 4.2 Acid Kiem Acid-Kiem Kiem-Acid VSV Acid-Kiem-Vi song Phương pháp tiền xử lý Hình 4.4: Sự thay đổi thành phần chất xơ theo phương pháp tiền xử lý khác Đã có cải thiện đáng kể phần trăm loại bỏ thành phần chất xơ có vỏ cà phê có kết hợp hay phương pháp tiền xử lý với Nếu xét tiêu chí loại bỏ cảng nhiều tốt hemicellulose lignin phương pháp tiền xử lý acid-kiềm-vi sóng lựa chọn, loại bỏ 71,4% hemicellulose 79,2% lignin Tuy nhiên xét phương diện tổn thất cellulose phương pháp tiền xử lý acid lựa chọn, tổn thất 7,5% cellulose Do để có sở cho việc lựa chọn phương pháp tiền xử lý tốt cần phải xem xét đến lượng đường khử tạo sau trình thủy phân phương pháp thay đổi Với hàm mục tiêu 16 đường khử tạo phương pháp tiền xử lý cao phương pháp lựa chọn A–E Hình 4.5: Bề mặt vỏ cà phê trước (A) sau (E) tiền xử lý acid-kiềm-vi sóng kính hiển vi điện tử (SEM) Bảng 4.3: Ảnh hưởng phương pháp tiền xử lý khác đến hình thành đường khử Phương pháp TXL Acid Kiềm Vsv Acidkiềm Kiềmacid Kiềmvi sóng Đường khử g/L 19,85 28,21 13,19 41,27 39,29 38,21 Acidkiềmvi sóng 43,26 Kết Bảng 4.3 cho thấy, có sở cho việc lựa chọn phương pháp tiền xử lý thích hợp vỏ cà phê có kết hợp acidkiềm-vi vóng Khác 44.09% Hemi 1.05 % Celulose 25.88% Lignin 20.07% Tro 5.20 % Khác 12.09% Celulose 77.49% Lignin 4.17% Tro Hemi 6.29% 3.67% NL TXL acid-kiềm-vi sóng NL chưa TXL Hình 4.6: Thành phần nguyên liệu trước sau tiền xử lý Nguyên liệu sau tiền xử lý cịn lại chủ yếu cellulose (77,49%, tính theo hàm lượng cellulose ban đầu), tro số chất khác (Hình 4.6) Vỏ cà phê sau tiền xử lý có đặc điểm cảm quan mềm xốp, màu vàng nâu nhạt, khả thấm nước tốt 17 4.3 Thu nhận enzyme cellulose từ nấm mốc 4.3.1 Kết phân lập số dịng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấm Aspergillus Trichoderma Bảng 4.4: Số dòng nấm mốc phân lập từ số nguồn TT Nguồn phân lập Đất trồng cà phê Quả cà phê Cành mục Tổng số Số dòng nấm Aspergillus 13 Ký hiệu mẫu Số dòng nấm Trichoderma Ký hiệu mẫu DA1, DA2 QA1÷QA6 CA1÷CA5 11 DT1, DT2 QT1÷QT5 CT1÷CT4 Thông qua quan sát sơ đặc điểm đại thể vi thể khẳng định, 24 dịng khảo sát có 13 dịng có đặc điểm giống Aspergillus 11 dịng có đặc điểm giống Trichoderma 4.3.2 Khả sinh tổng hợp enzyme cellulase chủng nấm mốc phân lập Trong số 24 dòng nấm mốc phân lập được, nhóm nấm mốc phân lập từ cành mục thể hoạt tính cellulase cao từ đất Riêng 11 dịng phân lập từ có dịng cho hoạt tính cao (QA1, QA3, QA5, QT4, QT5) Với dịng phân lập từ cành có dịng thể hoạt tính cellulase cao (CA1, CT2, CT4) Còn lại dòng phân lập từ đất khơng có dịng thể hoạt tính cellulase cao (D < 12 mm) Có năm dịng nấm mốc có khả sinh enzyme cellulase tuyển chọn bao gồm: QA3 (phân lập từ quả), CA1 (phân lập từ cành lá), QT5 (phân lập từ quả), CT2 (phân lập từ cành lá) CT4 (phân lập từ cành lá) Riêng dịng QT5 cho kết đường kính vịng phân giải hoạt tính CMCase cao Kết định danh, xác định chủng QT5 Trichoderma asperellum với tỷ lệ đồng hình 99% 4.3.3 Xác định điều kiện môi trường nuôi cấy nấm T asperellum QT5 Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ nuôi cấy T asperellum QT5 đến hoạt lực CMCase Hoạt tính enzyme thu tăng dần theo thời gian nuôi cấy đạt cực đại thời điểm ngày Sau hoạt tính bắt đầu giảm dần thời gian ni cấy tăng từ đến ngày Đối với chủng nấm mốc T asperellum khả sinh tổng hợp cellulase tăng dần khoảng nhiệt độ từ 30÷35oC tương ứng hoạt lực tăng từ 1,69 U/mL đến cực đại 1,84 U/mL (ở 35oC) Có thể nhận thấy chủng T asperellum chủng nấm ưa ấm 18 Thời gian để nấm mốc phát triển tối ưu ngày nhiệt độ nuôi cấy tốt 35oC, tương ứng với hoạt tính CMCase đạt cực đại 1,6 U/mL Ảnh hưởng pH môi trường nồng độ dịch chiết khoai tây đến hoạt lực CMCase Hoạt tính CMCase tăng dần pH môi trường tăng hoạt lực đạt cực đại pH (2,37 U/mL), sau khả sinh tổng hợp cellulase giảm nhanh chóng pH Như vậy, chủng T asperellum có khả sinh tổng hợp cellulase mạnh điều kiện pH trung tính Ngồi ra, tăng nồng độ dịch chiết khoai tây hoạt lực CMCase tăng theo hoạt lực đạt cao nồng độ dịch chiết 100% (v/v) Ảnh hưởng chất cảm ứng đến hoạt lực CMCase Cơ chất cảm ứng yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase chủng nấm Chủng T asperellum QT5 lên men môi trường chứa nguồn chất cảm ứng khác nồng độ 1% (w/v) Kết cho thấy chất cám gạo cho khả cảm ứng sinh tổng hợp cellulase mạnh đạt 9,76 U/mL Ảnh hưởng nguồn nitơ khoáng chất đến hoạt lực CMCase Một số nguồn khoáng: KCl, MgSO4 hay CaCO3 bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng làm tăng hoạt tính CMCase Trong nghiên cứu Ali and Akhand (1992), khống NaCl KCl khơng có tác dụng làm tăng hoạt tính Endo-glucanase Tuy nhiên nghiên cứu KCl có tác dụng gia tăng hoạt tính CMCase so với MgSO4, điều cho thấy ion K+ phân ly từ KCl ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase sinh nấm mốc T asperellum Một số nghiên cứu trước rằng, (NH4)2SO4 NH4NO3 hai nguồn nitơ thích hợp chủng Trichoderma spp S1 (Ali and Akhand, 1992) Do đó, KCl (NH4)2SO4 lựa chọn để bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm T asperellum 4.3.4 Thu nhận enzyme cellulase từ T asperellum QT5 muối (NH4)2SO4, NaCl, ethanol acetone Bảng 4.5: So sánh hiệu tinh cellulase tác nhân kết tủa khác Tác nhân kết tủa Đối chứng (NH4)2SO4 NaCl Ethanol Acetone Tỷ lệ tác nhân enzyme F65-75 (w/v) 25% (w/v) 3,5:1 (v/v) 2: (v/v) Protein (mg/mL) Hoạt tính (U/mL) 0,96 0,316 0,471 0,438 0,507 13,6 13,9 16,42 21,72 13,8 19 Hoạt tính riêng (U/mg) 14,16 43,92 33,42 49,59 26,78 Hiệu suất thu hồi (%) 70,51 78,36 89,43 43,54 Việc sử dụng dung môi ethanol tỏ hiệu việc kết tủa sơ enzyme, thể hoạt tính riêng gia tăng khác biệt so sánh với loại hóa chất kết tủa khác sử dụng hiệu suất thu hồi tương đồng với việc sử dụng NaCl (89,43% 78,36%) Đồng thời, việc sử dụng ethanol giúp giảm bớt cơng đoạn thẩm tích sau q trình kết tủa với muối Dựa kết khảo sát, ethanol sử dụng làm dung môi kết tủa cellulase với tỷ lệ ethanol:enzyme thô 3,5:1 4.4 Nghiên cứu q trình thủy phân cellulose có vỏ cà phê hệ enzyme cellulase 4.4.1 Ảnh hưởng chủng loại enzyme đến hiệu trình thủy phân Kết phân tích cho thấy, lượng đường khử glucose tạo sau q trình thủy phân có khác sử dụng loại enzyme thủy phân khác Cụ thể, cellulase thu nhận tạo 12,15 g/L đường khử 8,35 g/L glucose; Viscozyme tạo 24,43 g/L đường khử 17,46 g/L glucose; Celluclast 1.5L tạo 27,39 g/L đường khử 18,65 g/L glucose Đường khử glucose tạo khác hoạt tính enzyme endo exo ban đầu enzyme khác Bên cạnh đó, thêm vào trình thủy phân enzyme Glucosidase đường khử glucose mẫu tăng đáng kể Để đánh giá hiệu trình thủy phân loại enzyme cần xem xét đến hiệu kinh tế trình thủy phân mà trước tiên xem xét chi phí thủy phân tính gam ethanol tạo Bảng 4.6: Chi phí thủy phân loại enzyme khác Chủng loại enzyme Thể tích enzyme (mL) Chi phí (đồng) Ethanol (g/L) Cellulase* Chi phí/1 mL (đồng) 1.200 8,72 10.464 5,08±0,07f Chi phí/1g ethanol (đồng) 2.060e Viscozyme 4.000 4,75 19.000 8,45±0,09e 2.249c 9,08±0,05d 2.506a Celluclast 1.5L Glucosidase Cellulase* + Glucosidase Viscozyme + Glucosidase Celluclast 1.5L + Glucosidase 35.000 0,65 22.750 6.800 0,83 5.644 8,72 + 0,83 16.108 10,06±0,13c 1.601f 4,75 + 0,83 24.644 11,67±0,15b 2.112d 0,65 + 0,83 28.394 12,02±0,12a 2.362b Chi phí/1 mL enzyme chi phí/1 g ethanol mang tính chất tham khảo tính tốn sơ điều kiện phịng thí nghiệm 20 Hàm lượng ethanol tính theo g/L dịch lên men enzyme cellulase thu nhận tạo thấp so với loại enzyme thương mại chí có kết hợp với Glucosidase Tuy nhiên, xem xét chi phí gam ethanol tạo việc sử dụng enzyme cellulase thu nhận (Cellulase*) cho thấy hiệu tương đương so với enzyme thương mại Do đó, enzyme cellulase* chọn lựa kết hợp với Glucosidase để thực thí nghiệm 4.4.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến trình thủy phân Trong điều kiện chất định, hiệu thủy phân enzyme cellulase tăng tuyến tính giới hạn tỷ lệ enzyme định (5÷25 FPU/g 5÷30 CBU/g) Hầu tất nghiên cứu phịng thí nghiệm thường sử dụng với tỷ lệ từ ÷ 33 FPU/g chất phụ thuộc vào loại nồng độ chất (Sun and Cheng, 2002) Qua đó, 25 FPU/g (đối với cellulase*) 30 CBU/g (đối với glucosidase) nồng độ lựa chọn để thủy phân vỏ cà phê tồn thí nghiệm sau 4.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến trình thủy phân Khi tăng nhiệt độ thủy phân, tốc độ phản ứng ban đầu tăng tăng rõ rệt khoảng nhiệt độ từ 35÷50oC Thủy phân nhiệt độ 50oC cho hàm lượng đường khử cao đạt 26,1 g/L Tuy nhiên tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân lên 50÷60oC tốc độ phản ứng đầu giảm đồng nghĩa với việc giảm hàm lượng đường khử tạo thành sau thủy phân giảm cách rõ rệt nhiệt độ 60oC Dù enzyme có khả phản ứng nhiệt độ cao hiệu suất thủy phân bị chi phối thời gian phản ứng, nồng độ glucose cellobiose tích lũy tăng dần theo thời gian phản ứng Đường khử tạo thành phản ứng thủy phân enzyme tăng mạnh thời than đầu thủy phân từ 1÷4 ngày, từ ngày đến ngày thứ đường khử tăng không đáng kể đạt cực đại 26,95 g/L ngày thứ Kết khảo sát cho thấy nhiệt độ hoạt động tốt enzyme Cellulase* + Glucosidase 50oC thời gian thủy phân ngày 4.4.4 Tối ưu hóa thơng số q trình thủy phân enzyme cellulase thu nhận từ nấm mốc T asperellum QT5 kết hợp với glucosidase Mơ hình thực theo phương trình hồi quy sau: 𝑛 𝑌 = 𝑎0 + ∑𝑛𝑖=1 𝑎𝑖 𝑥𝑖 + ∑𝑛𝑖=1 𝑎𝑖𝑖 𝑥𝑖2 + ∑𝑛−1 𝑖=1 ∑𝑗=2 𝑎𝑖𝑗 𝑥𝑖 𝑥𝑗 21 Bảng 4.7: Mức thay đổi nhân tố tối ưu Các nhân tố tối ưu Các mức độ thay đổi -1 Ký hiệu Nồng độ enzyme (FPU/g) X1 20 25 30 o Nhiệt độ thủy phân ( C) X2 45 50 55 Thời gian thủy phân (giờ) X3 72 96 120 Phương trình hồi quy thu nhận sau: Y= 27,18+0,79X2–2,64X12–2,1X22–1,13X32+0,78X2X3 Phương trình hồi quy có p0,8) hệ số đánh giá khả dự đốn mơ hình Q2 0,787 (>0,5) chứng tỏ mơ hình đạt độ tin cậy cao Bảng 4.8: Các thông số tối ưu mô hình quy hoạch thực nghiệm Nhân tố X1 X2 X3 Y Giá trị dự đoán tối ưu 24,77 51,19 92,3 27,35 Giá trị thực nghiệm 26,22±0,39 Kết tối ưu đạt từ mơ hình chọn lựa ban đầu là: Hàm lượng đường khử đạt 27,35 g/L điều kiện nồng độ enzyme 24,77 FPU/g, nhiệt độ thủy phân 51,19oC thời gian thủy phân 92,3 4.4.5 Nghiên cứu trình khử độc dịch thủy phân Quá trình tiền xử lý acid-kiềm-vi sóng tạo số chất có khả gây độc cho nấm men HMF Furfural với hàm lượng 2,11 g/L HMF 3,37 g/L furfural Phương pháp để loại bỏ số chất sử dụng phương pháp vơi hóa phát triển Millati (Millati et al., 2002) kết hợp với lọc than hoạt tính Trọng lượng kết tủa (mg) pH 0.5 10 0.4 pH 0.3 0.2 0.1 0 Thể tích Ca(OH)2 (mL) Khối lượng kết tủa (g) 11 Hình 4.7: Ảnh hưởng thể tích Ca(OH)2 đến tạo thành kết tủa 22 Ở pH 10,2, lượng kết tủa hình thành đạt cực đại có xu hướng giảm dần tăng pH Tuy nhiên nhận thấy gốc sulphate kết tủa nhiều giá trị pH = 9,8 4.5 Nghiên cứu trình lên men dịch thủy phân vỏ cà phê 4.5.1 Ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men ban đầu bổ sung vào trình lên men Khi tăng mật độ tế bào nấm men từ 3x106 đến 5x108 cfu/mL hàm lượng ethanol thu tăng theo Tuy nhiên mức tăng không đáng kể Nếu tiếp tục tăng lượng nấm men hàm lượng ethanol có xu hướng giảm Lý với mật độ tế bào nấm men lớn, nấm men sử dụng đường tạo thành sau trình thủy phân để tăng sinh khối, hàm lượng ethanol thu không tăng mà bị giảm theo thời gian Theo đó, mật độ tế bào nấm men bổ sung 5x107÷3x108 cfu/mL chọn lựa cho thí nghiệm sau 4.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu Nấm men S cereviciae có khả chịu nhiệt lên men 42oC Tuy nhiên, theo nghiên cứu nấm men lên men tốt nhiệt độ 30÷40oC Nếu nhiệt độ tăng đến 45oC hiệu suất lên men giảm mạnh nhiệt độ 50oC nấm men gần không sinh trưởng lên men Hàm lượng ethanol (g/L) 12 10.1 9.91 9.05 8.66 9.16 10 8.11 8.57 6.22 3.71 24 5.02 7.11 5.79 4.44 6.02 48 4.12 4.25 1.8 3.12 45 50 72 25 30 35 40 Nhiệt độ lên men (độ C) Hình 4.8: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu Mặc dù nhiệt độ 35oC chứng minh tốt cho trình lên men xét đến yếu tố khác chi phí, thiết bị nhiệt độ lên men lựa chọn 30oC 23 Hàm lượng ethanol (g/L) 4.5.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu Kết phân tích cho thấy, hàm lượng ethanol tạo trình lên men tăng dần theo thời gian lên men đạt cực đại 72 lên men với hiệu suất lên men đạt 72,55% Sau thời gian 72 hàm lượng ethanol không tăng mà có xu hướng giảm nhẹ 13 12 11 10 10.74 11.28 10.05 7.11 9.02 11.13 10.95 9.46 9.25 Viscozyme Cellulase* 6.71 24 48 72 96 Thời gian lên men (giờ) 120 Hình 4.9: Ảnh hưởng thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu Sau 72 lên men, hiệu suất lên men đạt 75,96% có nghĩa 75,96% lượng glucose chuyển hóa thành ethanol nhờ vai trị nấm men Kết phân tích Hình 4.9, cho thấy điều kiện lên men 30oC, với mật độ tế bào ban đầu 3x108 cfu/mL lên men 72 phù hợp hàm lượng ethanol hiệu suất lên men đạt cao 4.5.4 Ảnh hưởng phương pháp lên men đến hàm lượng ethanol thu Bảng 4.9: So sánh hiệu lên men SHF, SSF SHF+SSF Thời gian thủy phân (ngày) Thời gian lên men (ngày) Nhiệt độ thủy phân/lên men (oC) 50/37 50/37 50/37 50/37 50/37 50/37 Ethanol (g/L) SHF SSF 5,34±0,18a 4,76±0,14a 9,02±0,1a 11,28±0,19a 11,38±0,21a 10,29±0,13ab 7,1±0,12b 8,13±0,14b 10,09±0,08b 10,79±0,15b 10,72±0,11a 10,44±0,13a SHF+SSF 8,96±0,09a 9,43±0,16c 10,08±0,13c 10,23±0,16b 10,26±0,06a Các giá trị hàng có ký tự in thường khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê p