Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ, thành phần loài sán lá gan nhỏ, sán lá ruột nhỏ tại hai huyện kim sơn và yên khánh, tỉnh ninh bình (2016 2019) tt

1 KHÁI QUÁT CHUNG CỦA LUẬN ÁN Tính cấp thiết Sán gan nhỏ (SLGN), sán ruột nhỏ (SLRN) hai loại sán quan trọng gây bệnh người vấn đề sức khỏe cộng đồng Ước tính có tỷ người có nguy bị nhiễm sán khoảng 50-60 triệu người bị bệnh sán Tuy nhiên, số cho thấp so với số người nhiễm thực triệu chứng lâm sàng khơng đặc trưng, trứng loài SLGN, SLRN lại giống nên số nơi thời gian dài, SLRN không phát trứng bị nhầm lẫn với SLGN Tính đến nay, Việt Nam phát loài SLN nhiễm người.Tại nhiều địa phương, tỷ lệ tái nhiễm giun sán nói chung sán nhỏ nói riêng cao có Ninh Bình với huyện Kim Sơn, n Khánh, nơi người dân có thói quen ăn gỏi cá cịn phổ biến có nhiều bệnh nhân nhiễm SLGN, SLRN Các nghiên cứu trước chủ yếu sử dụng kỹ thuật xét nghiệm phân, xác định loài phương pháp hình thái để phát tình trạng nhiễm sán mà chưa nhiều nghiên cứu xác định xác tỷ lệ nhiễm loài SLGN, SLRN cộng đồng Để tiếp tục bổ sung liệu khoa học giúp cho việc phòng chống sán nhỏ Việt Nam có hiệu quả, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ, thành phần loài sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ huyện Kim Sơn yên Khánh, tỉnh tỉnh Ninh Bình năm 20162019” Mục tiêu 2.1 Xác định số đặc điểm dịch tễ sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ huyện Kim Sơn Yên Khánh tỉnh Ninh Bình, năm 2016 2.2 Xác định thành phần loài sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ hình thái kỹ thuật sinh học phân tử điểm nghiên cứu Tính khoa học, tính tính thực tiễn luận án 3.1 Cơng bố số liệu vào đồ dịch tễ nhiễm sán nhỏ Việt Nam thực trạng nhiễm, yếu tố liên quan, phân loại sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ xã thuộc huyện Kim Sơn, n Khánh, tỉnh Ninh Bình, góp phần xây dựng chiến lược phòng chống bệnh sán nhỏ khu vực có thói quen ăn gỏi cá 02 huyện có hiệu 3.2 Xác định thành phần lồi sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ người áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử từ trứng sán phân lần Việt nam 3.3 Đánh giá phần thực trạng nhiễm ấu trùng SLGN, SLRN cá điểm nghiên cứu Tập trung vào khảo sát loài cá hay sử dụng ăn gỏi cá chép, cá trắm, cá mè đặc biệt cá mịi (là lồi cá nước lợ sử dụng ăn gỏi) có ý nghĩa quan trọng tuyên truyền hạn chế ăn gỏi cá hay áp dụng biện pháp an tồn thực phẩm phịng chống sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ cộng đồng CẤU TRÚC LUẬN ÁN Luận án gồm 125 trang chia thành phần sau: Đặt vấn đề (2 trang), tổng quan tài liệu (35 trang); Đối tượng phương pháp nghiên cứu (24 trang); Kết nghiên cứu (34 trang); Bàn luận (27 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (0,5 trang) Luận án có 43 bảng, 24 hình 176 tài liệu tham khảo (42 tài liệu tiếng Việt 137 tài liệu tiếng Anh) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm dịch tễ sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ Ngày nay, 100 loài sán ghi nhận gây nhiễm cho người tập trung vào nhóm gây bệnh tương ứng là: bệnh sán máng (schistosomiasis), bệnh sán gan lớn (fascioliasis), bệnh sán phổi (paragonimiasis), bệnh SLGN (opisthorchiasis, clonorchiasis), bệnh SLRN (intestinal trematodes) Các loài SLGN, SLRN lây truyền qua cá phân bố chúng người liên quan chặt chẽ tới thói quen ăn cá sống, cá nấu chưa chín kỹ người dân Chúng rải rác khắp giới khu vực lưu hành nằm Đơng Nam, Châu Á vùng Viễn Đơng Nơi có tỷ lệ lưu hành cao Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Hàn Quốc, Malaysia, Philippines Thái Lan, Lào Hiện có khoảng 45 triệu người giới nhiễm SLGN, Châu Á có 35 triệu người mắc, 200 triệu người có nguy lây nhiễm, chủ yếu C sinensis, O viverrini SLRN có khoảng triệu người nhiễm giới có tỉ lệ nhiễm song hành với SLGN tính chất lây truyền dịch tễ tương đối giống Tại Việt Nam SLGN C sinensis O viverrini lưu hành nhiều nơi Chưa có báo cáo thống kê cụ thể số người nhiễm sán ruột nhỏ phát người nhiễm H pumilio, H taichui, C formosanus số lồi khác Đồng sơng Hồng Khoảng 26 lồi sán thuộc họ Heterophyidae thơng báo nhiễm người SLRN Heterophyidae phân bố khắp giới Một số loài SLRN Heterophyidae ký sinh người phân bố chúng có nhiều điểm khác Tại Việt Nam: Những nghiên cứu gần cho thấy nhiễm SLRN chủ yếu loài thuộc họ Heterophyidae Do có nhiều vật chủ nên SLN hồn thiện vịng đời khơng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển thể người Vì vậy, mầm bệnh SLGN, SLRN tồn tự nhiên Người dân khơng bỏ thói quen ăn gỏi cá ngun nhân làm cho cơng tác phịng chống nhiễm SLN gặp nhiều khó khăn, thách thức Các yếu tố liên quan tới nhiễm sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ Yếu tố nguy lớn nhiễm SLGN, SLRN ăn gỏi cá, ăn cá nấu chưa chín Có nhiều yếu tố liên quan đến hành vi - Tuổi: Nói chung nhiễm sán lây truyền qua cá thường gặp người lớn, với tỷ lệ cường độ nhiễm tăng theo tuổi - Giới: Đa số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ cường độ nhiễm nam cao nữ Tại Việt Nam đa số kết ghi nhận tỷ lệ nhiễm SLGN, SLRN nam giới cao so với nữ giới - Kiến thức: Nghiên cứu Trung Quốc thấy kiến thức phòng chống có liên quan đến tình trạng nhiễm SLGN/ SLRN Nhiều tác giả khuyến cáo cần thiết nâng cao nhận thức người dân Nghiên cứu Nga Sơn, Thanh Hóa thấy có mối liên quan kiến thức, thái độ, thực hành sử dụng nhà tiêu hợp vệ sinh với tình trạng nhiễm SLGN Nghiên cứu Nguyễn Văn Chương cộng kết hợp điều trị đặc hiệu, can thiệp truyền thông giáo dục làm tăng hiểu biết người dân SLGN xã can thiệp tỷ lệ nhiễm sán O viverrini giảm 74,1%; cường độ nhiễm giảm 76,75% so với trước can thiệp - Thái độ: Mặc dù phịng chống SLGN, SLRN đơn giản cách ăn cá nấu chín, nhiên khó khăn để hàng triệu người thay đổi thói quen ăn uống qua nhiều kỷ - Ăn gỏi cá: Tất nghiên cứu hành vi, thới quen, tập quán nuôi cá, ăn rau sống giới Việt Nam đề thống ăn gỏi cá yếu tố nguy nhiễm SLGN/ SLRN Một số cơng trình nghiên cứu Hàn Quốc, Trung Quốc… thấy liên quan ăn gỏi cá với nhiễm sán gan nhỏ nói riêng sán truyền qua cá nói chung Tại Trung Quốc thấy ăn cá nước tôm sống nấu chưa chín yếu tố nguy truyền C sinensis [89] Một số nghiên cứu Việt Nam cho thấy ăn gỏi cá yếu tố nguy nhiễm sán gan nhỏ Nghiên cứu Tân Thành Yên Lộc, huyện Kim Sơn Một số yếu tố liên quan đến hành vi ăn gỏi cá địa điểm, chủng loại cá… có ảnh hưởng đến nguy nhiễm sán Ăn cá nhà hàng coi có nguy bị nhiễm sán gan nhỏ cao phần lớn gỏi cá chế biến từ cá nuôi trồng, đánh bắt địa phương - Điều kiện vệ sinh môi trường: Blanton R (2007) nghiên cứu nhà có ao ni cá coi yếu tố nguy [91] Những người sống gần nguồn nước tỷ lệ nhiễm cao gấp 2,15 lần Chuồng lợn, nhà vệ sinh gần ao, hệ thống cống rãnh dẫn nước xuống ao, hồ làm cho ao hồ ô nhiễm phân Việc sử dụng phân người động vật tươi nuôi cá liên quan tới nhiễm sán Vật dự trữ mầm bệnh sán gan nhỏ gồm người, chó, mèo, lợn, chuột nhiều loại động vật ăn cá khác Kiểm soát nhiễm sán động vật đóng vai trị phịng nhiễm người [93] 1.2 Các phương pháp phát xác định loài Sán gan nhỏ sán ruột nhỏ Có thể áp dụng nhiều phương pháp khác để chẩn đoán nhiễm SLN tìm trứng phân, xét nghiệm miễn dịch hay sinh học phân tử Xác định nhiễm sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ dựa vào đặc điểm hình thái học trứng sán nhỏ kính hiển vi quang học Các đặc điểm cần phải xác định hình dạng trứng sán, kích thức trứng, đặc điểm lớp vỏ, đặc điểm đặc trưng có nắp, có vai nho cao, có mấu có phơi phát triển trứng - Kỹ thuật định danh sán trưởng thành: Chẩn đốn định danh lồi sán thực sau tẩy sán thu sán trưởng thành [109] Các đặc điểm giúp phân loại sán theo hình thái hình dáng, kích thước, đặc điểm giác bụng, giác miệng, quan nội tạng chủ yếu quan sinh dục - Kỹ thuật định danh ấu trùng sán: Ấu trùng sán định danh nhờ vào đặc điểm hình thái Các đặc điểm thường ứng dụng định danh giác bụng giác miệng, xung quanh giác, hầu, thực quản ruột, tế bào lửa, tuyến tiết lỗ tiết, mầm sinh dục: tinh hoàn, buồng trứng, chất nỗn hồng, gonotyl, ống sinh dục quan tiếp nhận, gai miệng, vỏ gai - Kỹ thuật sinh học phân tử: Do phân bố trùng giống hình thái SLGN, SLRN định danh xác hình thái khó khăn Sinh học phân tử có tiềm lớn ứng dụng định dan SLGN, SLRN Các kỹ thuật sinh học phân tử thường hay sử dụng để xác định thành phần loài sán nhỏ như: Kỹ thuật PCR với mồi đặc hiệu lồi; PCR đa mồi; PCR-RFLP Giải trình trình tự gen Các đoạn gen nhân ITS1, ITS2…và gen ti thể COX1 gen thường hay sử dụng để thẩm định thành phần loài, xác định phả hệ (cây chủng loại phát sinh) loài sán gan nhỏ sán ruột nhỏ 1.3 Triệu chứng, chẩn đoán điều trị SLGN, SLRN Triệu chứng lâm sàng nhiễm SLGN phụ thuộc vào số lượng sán nhiễm đường dẫn mật Những bệnh nhân nhiễm nhẹ thường khơng có triệu chứng Những trường hợp nhiễm nặng biểu lâm sàng thường rõ với triệu chứng khác Chẩn đoán nhiễm SLGN người cần dựa vào yếu tố như: tiền sử ăn gỏi cá sống vùng dịch tễ nhiễm sán, triệu chứng lâm sàng xét nghiệm phân dịch tá tràng Các kỹ thuật chẩn đốn nhiễm SLGN bao gồm tìm trứng phân, xét nghiệm miễn dịch sinh học phân tử Praziquantel thuốc có hiệu lựa chọn điều trị Nhiễm Heterophyidae nhẹ thường khơng biểu lâm sàng đặc biệt Bệnh thường có diễn biến nhẹ nhanh Trường hợp nhiễm nặng gặp triệu chứng tiêu chảy, phân nhầy, đau bụng, chán ăn, khó tiêu, buồn nôn nôn Các triệu chứng thường tự giảm dần sau tháng kéo dài tới năm Chẩn đoán nhiễm Heterophyidae dễ dàng nhờ phát trứng phân Praziquantel thuốc có hiệu lựa chọn cho tất lồi sán Heterophyidae 1.4 Phịng chống sán gan nhỏ sán ruột nhỏ Đối với SLN, việc phòng chống nên tập trung vào biện pháp nhằm giảm loại bỏ yếu tố làm tăng khả lây truyền bệnh: Chủ động phát điều trị người nhiễm; Bảo vệ ao nuôi cá hệ thống nuôi trồng thủy sản khác trước nguy nhiễm bẩn từ nguồn đào thải trứng; Quản lý, xử lý cách phân người, chó mèo động vật nhiễm khác giảm nguy nhiễm trứng vào nguồn nước qua giúp phịng chống nhiễm SLGN; Kiểm soát ốc ao hồ; Tăng cường hoạt động giáo dục truyền thông để loại bỏ thói quen ăn cá sống, chế biến sử dụng cá cách CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Đối trượng nghiên cứu cho nghiên cứu đặc điểm dịch tễ : + Người dân sống huyện Kim Sơn Yên Khánh tỉnh Ninh Bình Người dân từ 15 tuổi trở lên không phân biệt nam, nữ, nghề nghiệp, dân tộc sống điểm nghiên cứu, tự nguyện tham gia nghiên cứu Có khả trả lời vấn Đồng ý tham gia nghiên cứu cung cấp mẫu phân + Năm loài cá nước loài cá nước nợ điểm nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu cho nghiên cứu xác định thành phần loài sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ: + Trứng sán từ người nhiễm sán + Sán trưởng thành thu từ người nhiễm + Ấu trùng sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ thu từ cá 2.2 Thời gian thực hiện: Nghiên cứu triển khai từ năm 2016 đến năm 2018 2.3 Địa điểm nghiên cứu - Thực địa: Nghiên cứu tiến hành xã Kim Đông, xã Kim Tân thuộc huyện Kim Sơn xã Khánh Thành, Khánh Thủy thuộc huyện Yên Khánh, tỉnh Ninh Bình - Phịng thí nghiệm: Khoa Ký sinh trùng, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương; Labo giun sán môn Ký sinh trùng, Học viện Quân y: Labo phòng Vi sinh mầm bệnh sinh học, Viện Nghiên cứu Y dược học, Học viện Quân Y 2.4 Thiết kế nghiên cứu - Nghiên cứu mô tả điều tra cắt ngang xác định tình hình nhiễm sán số yếu tố liên quan đến nhiễm sán gan nhỏ sán ruột nhỏ người cá - Nghiên cứu mơ tả xác định thành phần lồi sán gan nhỏ sán ruột nhỏ hình thái sinh học phân tử 2.5 Cỡ mẫu nghiên cứu 2.5.1 Nghiên cứu dịch tễ học - Mẫu nghiên cứu tỷ lệ nhiễm SLGN, SLRN người vấn KAP Trong đó, n: cỡ mẫu tối thiểu huyện cần đạt nghiên cứu Z1-α/2 = 1,96; p = 0,145 ε = 0,35 Tính n = 184,9 làm tròn 185 người/huyện Thực tế điều tra huyện xã nghiên cứu 400 người, người tham gia nghiên cứu vừa xét nghiệm phân đồng thời vừa vấn KAP 2.5.2 Mẫu nghiên cứu tỷ lệ nhiễm SLGN, SLRN cá nước Cỡ mẫu theo công thức (1) Trong đó, Z1-α/2 = 1,96; p = 0,66 ε=0,25 Tính tốn n = 31,6 làm trịn 32 cá thể/loài cá Thực tế xét nghiệm 345 cá thuộc loại cá người dân địa phương hay dùng ăn gỏi gồm lồi cá nước ( Mè, Trơi, Trắm, Chép, Rô phi) cá nước lợ (Cá mịi) 2.5.3 Nghiên cứu xác định lồi sán nhỏ điểm nghiên cứu sinh học phân tử - Xét nghiệm phân 400 trường hợp cho cho 78 mẫu phân dương tính có 70 mẫu đủ phân để tách chiết DNA xét nghiệm PCR Tỷ lệ mẫu cho sản phẩm PCR 42,85% - Tẩy đãi phân thu sán trưởng thành cặn phân cho 10 trường hợp có cường độ nhiễm SLGN, SLRN cao nhất: - Mẫu sán trưởng thành: mẫu sán gan nhỏ phân tích đồng thời kỹ thuật PCR giải trình tự để thẩm định kết - Xét nghiệm 345 mẫu cá loài cá cho 152 mẫu cá nhiễm nang ấu trùng SLGN, SLRN.Thu 18.323 nang ấu trùng loài sán có 2426 nang ấu trùng H Pumilio, nang ấu trùng H Taichui, nang ấu trùng C sinensis 2.6 Nội dung nghiên cứu: + Xác định tỷ lệ, cường độ nhiễm SLGN, SLRN người điểm nghiên cứu: xét nghiệm tìm trứng sán trưởng thành phân + Một số đặc điểm dịch tễ học SLGN, SLRN: kiến thức, thái độ, thực hành phòng chống SLGN, SLRN người dân địa điểm nghiên cứu, yếu tố liên quan nhiễm SLGN, SLRN + Xác định tỷ lệ, cường độ nhiễm nang sán vật chủ trung gian (cá) + Xác định thành phần loài trứng sán thu phân; xác định thành phần loài sán trưởng thành thu từ người nhiễm xác định loài nang ấu trùng thu từ cá dựa vào đặc điểm hình thái học + Xác định loài nang ấu trùng thu từ cá, trứng sán sán trưởng thành thu từ người sinh học phân tử sử dụng cặp mồi cho vùng gen nhân ITS2 gen ti thể COX1 2.7 Các số đánh giá: + Đặc điểm nhân chủng học đối tượng nghiên cứu: tuổi, giới, trình độ học vấn, nghề nghiệp + Tỷ lệ nhiễm sán: số người xét nghiệm có trứng sán nhỏ tổng số người xét nghiệm, tính tỷ lệ phần trăm (%) + Cường độ nhiễm sán: tính số trứng gam phân (EPG), phân loại thành mức nhiễm nhẹ (< 1.000), trung bình (1.000 - 10.000 EPG) nặng (>10.000 EPG) + Kiến thức thái độ thực hành phòng chống SLGN, SLRN người dân địa phương + Yếu tố liên quan nhiễm SLGN, SLRN người điểm nghiên cứu + Tỷ lệ cá nhiễm nang ấu trùng: (số cá nhiễm nangấu trùng)/(tổng số cá xét nghiệm) x100 + Tỷ lệ loài cá nhiễm nang ấu trùng: (số cá loài nhiễm nang ấu trùng)/(tổng số cá loài xét nghiệm) x 100 + Cường độ nhiễm: (số nang ấu trùng thu được)/(tổng số gam cá xét nghiệm) + Một số dặc điểm hình thái học trứng, trưởng thành nang ấu trùng sán gan nhỏ sán ruột nhỏ + Một số đặc điểm sinh học phân tử trứng, trưởng thành nang ấu trùng sán gan nhỏ dựa gen nhân ITS2 gen ti thể COX1 So sánh tỉ lệ tương đồng gen nghiên cứu với số liệu gen bank 10 2.8 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu - Kỹ thuật xét nghiêm phân Formaline Ether - Kỹ thuật vấn người tham gia nghiên cứu câu hỏi (KAP) - Kỹ thuật tiêu cá để thu ấu trùng sán Kỹ thuật thu hồi sán trưởng thành kỹ thuật nhuộm sán carmin - Kỹ thuật tách DNA trứng sán phân, trưởng thành ấu trùng metacercaria thu từ cá - Kỹ thuật PCR xác định loài sán sử dụng đặc điểm phân tử gen ITS2 - COX1 - Kỹ thuật giải trình tự thẩm định loài 2.9 Sai số biện pháp hạn chế sai số Sai số gặp vấn tha tác kỹ thuật Để hạn chế sai số, chọn điều tra viên tập huấn thành thạo, áp dụng quy trình chun mơn chuẩn phịng thí nghiệm đạt chuẩn ISO 2.10 Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiêm túc quy định đạo đức Hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xác định tỷ lệ, kiến thức, thái độ thực hành số yếu tố liên quan nhiễm sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ hai huyện Kim Sơn n Khánh, Ninh Bình 2016-2017 Đã có 400 người dân tham gia nghiên cứu, nam giới 244 người (61,0%), nữ giới 156 người (39,0%) Tỷ lệ người dân 25 tuổi chiếm tỷ lệ thấp nhất, nhóm tuổi 45 – 55 tuổi chiếm tỷ lệ cao Tuổi trung bình đối tượng nghiên cứu 46,8 ± 11,57 tuổi Đa số đối tượng nghiên cứu nông dân 316 trường hợp (79%); trình độ học vấn hạn chế, hầu hết trung học sở 195 trường hợp (48,8%); Trung học phổ thông 169 trường hợp (42,3%); Trung học, đại học chiếm trường hợp (1%) 14 Nam giới có xu hướng ăn nhiều lần so với nữ (p 0,05; p2-4 < 0,05 P3-4 < 0,05 p1;2;3;4 < 0,05 Nhận xét: Tần suất ăn gỏi cá có liên quan đến tỷ lệ nhiễm sán Tỷ lệ nhiễm sán người ăn gỏi cá nhiều lần (≥ lần/tháng; 45,00%) cao có ý nghĩa so với người ăn lần (p 0,05 (1-3;4) < 0,001 (1-5) < 0,01 (2-3; 4) < 0,001 (2-5) > 0,05 Tổng 295 1,2406 5,4208 Loài cá (3-4;5) < 0,01 (4;5) < 0,01 Nhận xét: Mật độ nang ấu trùng sán nhỏ 1,24 nang ấu trùng/gam cá; Cao cá trắm 6,38 nang ấu trùng/gam cá, thấp cá trôi 0,56 nang ấu trùng/gam cá 17 3.2 Xác định thành phần loài sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ hình thái kỹ thuật sinh học phân tử Hình 3.1 Hình ảnh trứng sán nhỏ phân Nhận xét: Quan sát hình dạng trứng sán nhỏ phân thấy: + Trứng có hình bầu dục, nhỏ đầu, giống hình hạt vừng; + Vỏ trứng mỏng, bề mặt vỏ trứng nhìn khơng rõ thơ ráp hay trơn nhẵn; + Đầu thóp nhỏ có nắp có vai nhơ cao rõ ràng bao quanh nắp; + Có núm nhỏ (gai, knob) hình dấu phẩy đầu to bên kia; + Trong trứng có hình ảnh phơi + Kích thước trung bình 28,6 (D) x 16,3 (R) phù hợp với trứng sán C sinensis trứng sán ruột nhỏ Giác miệng Tuyến nỗn hồn Giác bụng Tử cung Buồng trứng A Tinh hồn B Hình 2: Hình ảnh sán trưởng thành (Hình A sán tươi chưa nhuộm, Hình B sán nhuộm carmine) 18 Hình 3.3 Hinh ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu phân Band 1: 50 bp DNA marker), band 2: chứng âm, band 3-5: mẫu Nhận xét: Hình ảnh điện di cho sản phẩm có kích thước khoảng 400 bp Hình 4: Cây phả hệ trứng sán nhỏ người dựa vào ITS2 Nhận xét: Cây phả hệ sán nhỏ xây dựng dựa vào chuỗi ITS2 luận án số chuỗi từ GenBank (KJ137228, JQ048601, AY584735, DQ513407, JX532156, AY245706, KP165440, EF6124489) tất mẫu cho kết tách chiết DNA người sán C sinensis 19 Bảng 3.18 Một số chuỗi gen ITS 2đã đăng ký ngân hàng gen Mã mẫu 59-NB 102-NB 119-NB TX1-NB Loài Clonorchis sinensis Clonorchis sinensis Clonorchis sinensis Clonorchis sinensis Mã ngân hàng gen MN128615 MN128616 MN128617 MN128618 Nhận xét: Kết cho thấy tất mẫu sán cho kết tách chiết DNA người sán gan nhỏ C sinensis Bảng 19: Mức độ tương đồng mẫu 115 với số chuỗi gen Số TT 10 Tên chuỗi Nguồn EU652407 MN116478 MN116477 MN116476 MN116475 KY564177 KJ204622 KJ204600 KJ204582 KJ204590 Việt Nam Nga Nga Nga Nga Korea Việt Nam Việt Nam Nga Nga Mức độ tương đồng (%) 99,52 99,01 99,01 99,01 99,01 99,01 99,01 99,01 99,01 99,01 Tên loài C sinensis C sinensis C sinensis C sinensis C sinensis C sinensis C sinensis C sinensis C sinensis C sinensis Nhận xét: Chuỗi gen cox1 mẫu 115 trùng hợp > 99,0% với số chuỗi sán gan nhỏ C sinensis Hình 3.5 Cây phả hệ trứng sán nhỏ người dựa vào CoxI Nhận xét: Tất mẫu trứng sán người SLGN C sinensis 20 3.2.2 Thành phần loài sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ cá Hình 3.6 Nang ấu trùng sán ruột nhỏ cá A H pumilio; B H taichui; C-D C sinensis Nhận xét: Nang ấu trùng H pumilio (A), ấu trùng nang H taichui (B) có gai nhỏ hình chữ I xếp bên giác bụng Nang ấu trùng C sinenis (C-D) giác bụng khơng có gai bám Hình 3.7 Hình ảnh sản phẩm PCR nang ấu trùng sán M Marker 50 bp, Đối chứng âm, H taichui, H pumilio, C Senisis Nhận xét: Sau tách chiết DNA, mẫu PCR cặp mồi ITS2 với kích thước mong đợi 530 bp (H taichui), 380 bp (H pumilio), 390 bp (C sinensis) 21 Bảng 20: Các chuỗi gen ấu trùng sán đăng ký ngân hàng gen Mã ngân hàng gen Loài Mã mẫu MK453254 Haplorchis pumilio 2T43 MK453255 Haplorchis pumilio 218 MK780187 Clonorchis sinensis 30T1C MK790157 Haplorchis taichui 33T1 Nhận xét: Kết cá phát loại nang ấu trùng SLGN: C Sinensis SLRN: H pumilio, H taichui Hình 3.8 Cây phả hệ nang ấu trùng SLGN, SLRN dựa vào ITS2 Nhận xét: Một số chuỗi gen từ nang ấu trùng nghiên cứu với số chuỗi khác ngân hàng gen (JX532156, AY245706, AY584735, DQ513407, KJ137228, JQ048601, KP165440, KX815126, EF612489) sử dụng để xây dựng phả hệ, phần mềm MEGA theo phương pháp Neighbor joining Kết phát nang ấu trùng SLGN: C Sinensis SLRN: H pumilio, H taichui 22 KẾT LUẬN Xác định số đặc điểm dịch tễ sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ huyện Kim Sơn Yên Khánh tỉnh Ninh Bình, năm 2016 1.1 Đặc điểm dịch tễ nhiễm sán gan nhỏ, sán ruột người: Qua nghiên cứu 400 người từ 15 tuổi trở lên, sinh sống lâu dài địa phương, nghiên cứu có số kết luận sau: - Tỷ lệ cường độ nhiễm + Tỷ lệ nhiễm sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ 19,5%; Huyện Kim Sơn tỉ lệ nhiễm 20,1%; Huyện n Khánh 18,9% Khơng có khác biệt tỷ lệ nhiễm hai huyện Tỷ lệ nhiễm nam giới (26,6%) cao nữ (8,3%) (p< 0,001) + Cường độ nhiễm sán trung bình 517,06 trứng/g phân; đa số (87,2%) đối tượng nhiễm nhẹ, khơng có đối tượng nhiễm mức độ nặng Cường độ nhiễm sán trung bình nam cao nữ - Kiến thức, thái độ, thực hành người dân phòng chống sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ địa điểm nghiên cứu + Tỉ lệ dân nghe thông tin sán tương đối cao (72,5%) đó: 68,8% biết sán lây truyền qua ăn gỏi cá, 69,3% biết ăn cá chín phịng bệnh, tỷ lệ biết tác hại sán thấp 74,3% đối tượng không ăn gỏi cá biết ăn nhiễm bệnh nguy hiểm + 73,3% đối tượng ăn gỏi cá, tỷ lệ nam giới ăn gỏi cao nữ giới Các loài cá thường sử dụng để ăn gỏi cá mòi (62,25%), cá mè (52,75%), cá chép (34,75%), cá trắm (32%) Người dân ăn gỏi cá nhiều lý do, nhiều địa điểm cá nhiều nguồn khác - Yếu tố liên quan nhiễm sán gan nhỏ, sán ruột người + Người ăn gỏi cá có nguy nhiễm sán cao gấp 6,8 lần không ăn gỏi cá + Chưa thấy liên quan nhóm tuổi, nghề nghiệp, trình độ học vấn, điều kiện sống (sống gần ao hồ, sơng; có hố xí hợp vệ sinh, ni chó mèo); hành vi ăn rau sống; uống nước lã, chân đất; vệ sinh xuống ao với 23 nhiễm sán 1.2 Đặc điểm dịch tễ nhiễm nang ấu trùng sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ cá hai huyện Kim Sơn Yên Khánh, Ninh Bình - Nghiên cứu 345 cá thuộc lồi (cá chép, mè, trắm, trơi, rơ phi, mịi), kết cho thấy: Tỷ lệ nhiễm nang ấu trùng chung 44,1% Cá chép (86,5%): Cá Trắm (78,4%): Cá mè (66,7%) lồi cá có tỷ lệ nhiễm cao loài cá nước nhiễm nang ấu trùng Cá mịi khơng nhiễm ấu trùng sán - Cường độ nhiễm sán cá 1,24 nang ấu trùng/gam cá; Cao cá trắm: 6,4 nang ấu trùng/gam, thấp cá trôi: 0,0004 nang ấu trùng/gam Thành phần sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ hai huyện Kim Sơn Yên Khánh, Ninh Bình 2.1 Thành phần SLGN, SLRN người - Kết định danh dựa vào đặc điểm hình thái sinh học phân tử (42,85% mẫu phân cho sản phẩm PCR, phân tích hai thị ITS2 cox1) tất trứng sán thu Clonorchis sinensis - Kết định danh hình thái sinh học phân tử (phân tích gen vùng ITS2) sán trưởng thành thu sán gan nhỏ Clonorchis sinensis 2.2 Thành phần SLGN, SLRN cá Thu thập 18.323 nang ấu trùng loài cá nước định danh phát lồi sán, nang ấu trùng SLRN Haplorchis pumilio chiếm 99,84%, SLRN Haplorchis taichui 0,14% SLGN Clonorchis sinensis 0,02% Nang ấu trùng SLRN Haplorchis pumilio xuất loài cá nước ngọt; Riêng cá trắm xuất nang ấu trùng ba loài sán Haplorchis pumilio, Haplorchis taichui, Clonorchis sinensis Cường độ nhiễm cao Haplorchis pumilio (1,0591 nang ấu trùng/gam cá), thấp Clonorchis sinensis (0,0002 nang ấu trùng/gam cá) 24 KIẾN NGHỊ - Cần tăng cường truyền thông giáo dục sức khỏe nguy nhiễm bệnh, cách phòng chống sán để nâng cao kiến thức người dân, giảm hành vi liên quan đến lây truyền sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ cộng đồng, đặc biệt an tồn vệ sinh thực phẩm ‘ăn chin, uống chin, khơng ăn cá chưa nấu chín’ góp phần nâng cao sức khỏe cho người dân - Tăng cường ứng dụng kỹ thuật có khả định danh xác sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ giai đoạn khác kỹ thuật sinh học phân tử để có hiểu biết xác, khoa học tình hình dịch tễ loại sán Việt Nam 25 Cơng trình hồn thành VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Trần Anh PGS.TS Lê Thị Hồng Hanh Phản biện 1: …………………………… Cơ quan: ……………………………… Phản biện 2: …………………………… Cơ quan: ……………………………… Phản biện 3: …………………………… Cơ quan: ……………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương vào hồi Hà Nội, ngày … tháng … năm 2020 Có thể tìm đọc luận án tại: - Thư viện quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương 26 DANH SÁCH CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN LUẬN ÁN Đoàn Thúy Hòa, Lê Trần Anh, Đỗ Ngọc Ánh, Phạm Văn Minh (2017), “Đặc điểm kiến thức, thái độ, thực hành ăn gỏi cá người dân hai huyện Kim Sơn, Yên Khánh, tỉnh Ninh Bình (Năm 2016)”, Tạp chí Phịng chống bệnh Sốt rét bệnh Ký sinh trùng, 1(97), 95-98 Đồn Thúy Hịa, Lê Trần Anh, Đỗ Ngọc Ánh (2017), “Một số hiểu biết nhiễm sán nhỏ người dân hai huyện Kim Sơn, Yên Khánh, tỉnh Ninh Bình (2016)”, Tạp chí Phịng chống bệnh Sốt rét bệnh Ký sinh trùng, 3(99), 75-82 Đồn Thúy Hịa, Lê Trần Anh, Đỗ Ngọc Ánh, Phạm Văn Minh, Nguyễn Khắc Lực (2018), “Đặc điểm nhiễm nang ấu trùng sán nhỏ số loài cá thường sử dụng ăn gỏi huyện Yên Khánh Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình (2016-2017)”, Tạp chí Phịng chống bệnh Sốt rét bệnh Ký sinh trùng, 3(105), 57-61 27 28 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CƠN TRÙNG TRUNG ƯƠNG ĐỒN TH HỒ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ GAN NHỎ, SÁN LÁ RUỘT NHỎ TẠI HUYỆN KIM SƠN, YÊN KHÁNH, TỈNH NINH BÌNH (2016-2018) Chuyên ngành: Dịch tễ học Mã số: 972 01 17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Hà Nội, 2020 ... VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CƠN TRÙNG TRUNG ƯƠNG ĐỒN TH HỒ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ GAN NHỎ, SÁN LÁ RUỘT NHỎ TẠI HUYỆN KIM SƠN, YÊN KHÁNH,... nghiên cứu cho nghiên cứu xác định thành phần loài sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ: + Trứng sán từ người nhiễm sán + Sán trưởng thành thu từ người nhiễm + Ấu trùng sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ thu từ cá... trôi: 0,0004 nang ấu trùng/gam Thành phần sán gan nhỏ, sán ruột nhỏ hai huyện Kim Sơn Yên Khánh, Ninh Bình 2.1 Thành phần SLGN, SLRN người - Kết định danh dựa vào đặc điểm hình thái sinh học phân