Nghiên cứu 7 cây thuốc Việt Nam có tác dụng hỗ trợ miễn dịch ở động vật thực nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN VIỆT PHƢƠNG NGHIÊN CỨU CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT THỰC NGHỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN VIỆT PHƢƠNG NGHIÊN CỨU CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT THỰC NGHỆM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS VS TSKH Đái Duy Ban PGS TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, khách quan, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý, cho phép đồng tác giả Phần cịn lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS Nguyễn Việt Phƣơng i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập thực luận án tốt nghiệp nhận đƣợc dạy dỗ tận tình thầy cơ, giúp đỡ động viên đồng nghiệp, gia đình bạn bè Với tất kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn: - GS VS TSKH Đái Duy Ban PGS TS Nguyễn Quang Huy ngƣời Thầy hƣớng dẫn khoa học, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm để tơi hoàn thành luận án - PGS TS Hồ Bá Do - P Chủ tịch Hội Y Dƣợc học Cổ truyền Việt Nam PGS TS Nguyễn Văn Mùi - Giám đốc Trung tâm Cơng nghệ Hóa sinh Ứng dụng động viên, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành đƣợc luận án - Khoa Sinh học - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội nơi có thầy cơ, bạn bè, đồng nghiệp tận tâm hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án - Ban giám hiệu, phịng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ mơn Hóa sinh Sinh học Phân tử - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội - Ban giám đốc, cán bộ, nhân viên Khoa kiểm soát dịch bệnh, HIV/AIDS Trung tâm Y tế quận Tây Hồ - Hà Nội Xin chân thành cảm ơn BS Đặng Thị Bích Lan, BS Nguyễn Thị Phƣơng, BS Cao Thị Hoa Bằng, BS Lê Thị Hồng Loan, bệnh nhân, gia đình bệnh nhân tích cực hợp tác, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án - Xin chân thành cảm ơn chuyên gia Tổ chức thầy thuốc giới Pháp (MDM), Tổ chức PACT Việt Nam, Tổ chức phát triển quốc tế - Mỹ (USAID) có góp ý thiết thực giúp tơi hồn thành luận án - Xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp Viện Dƣợc liệu TW, Viện Thú y TW, Trung tâm Tiên tiến Hóa sinh Hữu - Viện Hóa sinh Biển - Viện Hàn lâm Khoa học & Cơng nghệ Việt Nam, Phịng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Cuối xin nhớ ơn cha mẹ, vợ, hai yêu quý, xin đƣợc cảm ơn ngƣời thân gia đình, bạn bè, đồng nghiệp ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập vừa qua Hà Nội, ngày tháng năm 2019 NCS Nguyễn Việt Phƣơng ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH MIỄN DỊCH 1.1.1 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh 1.1.2 Suy giảm miễn dịch mắc phải 1.2 HỆ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT 1.2.1 Các quan lympho tham gia đáp ứng miễn dịch 1.2.2 Đáp ứng miễn dịch gia cầm 1.2.3 Giới thiệu bệnh virus Gumboro 1.2.4 Giới thiệu Hội chứng loạn sinh sản hô hấp virus lợn 11 1.3 TÌNH HÌNH NHIỄM HIV TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 12 1.4 MỘT SỐ HỢP CHẤT THỰC VẬT THỨ SINH HỖ TRỢ MIỄN DỊCH ĐƢỢC BIẾT ĐẾN 12 1.4.1 Các Alkaloids 12 1.4.2 Các Flavonoids 13 1.4.3 Các hợp chất Phenol Tanin 13 1.4.4 Glycoside 14 1.4.5 Saponins 15 1.4.6 Adenosine cordycepin 16 1.5 Các thuốc đƣợc nghiên cứu 16 1.5.1 Gấc 17 1.5.2 Tam thất 18 1.5.3 Đẳng sâm 19 1.5.4 Trinh nữ hoàng cung 19 1.5.5 Linh chi 20 iii 1.5.6 Diệp hạ châu 21 1.5.7 Đông trùng hạ thảo 23 1.6 TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC MỚI TỪ NHIỀU CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 25 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 26 2.1.1 Động vật thực nghiệm 26 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn thỏ làm thí nghiệm 26 2.1.3 Tiêu chuẩn chọn chuột làm thí nghiệm 27 2.1.4 Virus cƣờng độc Gumboro 27 2.2 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Các thuốc đƣợc sử dụng nghiên cứu 28 2.2.2 Phân loại mẫu 29 2.3 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 30 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.4.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu thuốc 31 2.4.2 Phƣơng pháp xác định số hoạt chất thuốc 31 2.4.2.1 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng carbohydrate 31 2.4.2.2 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng phenolic tổng 33 2.4.2.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polisaccharide 34 2.4.2.4 Phƣơng pháp định lƣợng saponin toàn phần 34 2.4.2.5 Phƣơng pháp xác định adenosin tổng số 35 2.4.2.6 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng cordycepin 36 2.4.2.7 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng flavonoid 36 2.4.2.8 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng Rg1 Rg2 toàn phần 37 2.4.2.9 Phƣơng pháp định tính nhóm hợp chất phytosterol 38 2.4.2.10 Phƣơng pháp thử hoạt tính DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 38 2.4.2.11 Phƣơng pháp xác định kim loại nặng (Pb) ……………………… 39 2.4.3 Thiết kế nghiên cứu 40 2.4.4 Phƣơng pháp xử lý phân tích số liệu 47 iv 2.4.5 Phƣơng pháp kiểm soát kết xét nghiệm 47 2.4.6 Đạo đức nghiên cứu 49 2.4.7 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 50 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 LỰA CHỌN CÂY THUỐC THÔNG QUA ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC 51 3.1.1 Đánh giá hàm lƣợng adenosin cordycepin đông trùng hạ thảo Isaria cerambycidae Lưu et Đái 2009 51 3.1.2 Hàm lƣợng phenolic tổng trinh nữ hoàng cung 52 3.1.3 Đánh giá hàm lƣợng cacbohydrate tổng số có linh chi 53 3.1.4 Đánh giá hàm lƣợng Phenolic tổng số có diệp hạ châu 55 3.1.5 Hàm lƣợng -spinasterol 3-O--D-glycopylannosid polisaccharid tổng có đẳng sâm 56 3.1.6 Đánh giá hàm lƣợng ginsenosid Rg1, Rg2 toàn phần tam thất 58 3.1.7 Đánh giá hàm lƣợng lycopen β-Caoroten Gấc 59 3.2 BÀO CHẾ VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG CÓ TỶ LỆ PHÙ HỢP TỪ CÂY THUỐC VIỆT NAM 62 3.2.1 Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ đẳng sâm (ĐS) có Viên tăng sức đề kháng 63 3.2.2 Đánh giá, chọn lọc tỷ lệ diệp hạ châu có Viên tăng sức đề kháng 66 3.2.3 Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ linh chi có Viên tăng sức đề kháng 68 3.2.4 Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ gấc có Viên tăng sức đề kháng 69 3.2.5 Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ trinh nữ hồng cung có Viên tăng sức đề kháng 71 3.2.6 Đánh giá, chọn lọc tỷ lệ tam thất có Viên tăng sức đề kháng 72 3.2.7 Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ đơng trùng hạ thảo có Viên tăng sức đề kháng 75 3.3 QUY TRÌNH BÀO CHẾ VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG TỪ CÂY THUỐC ĐƢỢC CHỌN 76 v 3.3.1 Phƣơng pháp bào chế 77 3.3.2 Phƣơng pháp bào chế 79 3.3.3 Kết phân tích kiểm nghiệm Viên tăng đề kháng đƣợc chế tạo 82 3.4 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG 84 3.4.1 Nghiên cứu độc tính cấp 84 3.4.2 Nghiên cứu độc tính bán trƣờng diễn 86 3.5 Nghiên cứu mơ hình gây suy giảm miễn dịch mắc phải gà Lƣơng Phƣợng virus Gumboro thử tác dụng Viên tăng sức đề kháng 91 3.5.1 Các triệu chứng lâm sàng gà ăn Viên tăng sức đề kháng 92 3.5.2 Nghiên cứu tổn thƣơng đại thể gà 92 3.5.3 Xét nghiệm giải phẫu bệnh lý vi thể tuyến Fabricius lô gà 94 3.5.4 Đo hiệu giá kháng thể Gumboro qua phản ứng trung hoà huyết theo dõi biểu lô gà 94 3.6 Nghiên cứu tác động Viên tăng sức đề kháng lên gà bị gây suy giảm miễn dịch virus Gumboro thông qua số hóa sinh, huyết học 97 3.7 Đánh giá biểu virus PRRS (gây bệnh tai xanh lợn) cấp độ tế bào thử nghiệm với Viên tăng sức đề kháng 103 3.8 Đánh giá tác động Viên tăng sức đề kháng chức năng, hình thái gan thận thỏ thực nghiệm 106 KẾT LUẬN 114 KIẾN NGHỊ 115 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách số lƣợng mẫu thuốc thu nhận cho thí nghiệm 29 Bảng 2.2 Kết phân loại nhóm thuốc đƣợc thử nghiệm 30 Bảng 2.3 Dãy nồng độ xây dựng đƣờng chuẩn Glucose 32 Bảng 2.4 Dãy nồng độ xây dựng đƣờng chuẩn axit Galic 33 Bảng 2.5 Giá trị bình thƣờng hoạt độ amylase máu nƣớc tiểu 41 Bảng 2.6 Trị số bình thƣờng AST, ALT huyết số hãng phân tích 41 Bảng 3.1 Hàm lƣợng adenosin cordycepin đông trùng hạ thảo vùng 51 Bảng 3.2 Hàm lƣợng phenolic tổng số có mẫu trinh nữ hồng cung 52 Bảng 3.3 Hàm lƣợng cacbohydrat tồn phần có linh chi 54 Bảng 3.4 Hàm lƣợng phenolic tổng số diệp hạ châu mẫu 55 Bảng 3.3.5 Hàm lƣợng -spinasterols-O--D-glycopylannoside polysaccharide tổng mẫu đẳng sâm 57 Bảng 3.6 Hàm lƣợng toàn phần ginsenosid-Rg1 ginsenosid-Rg2 58 tam thất mẫu thu nhận 58 Bảng 3.7 Thành phần lycopen β-Caoroten tổng số mẫu gấc 60 Bảng 3.8 Bảng tổng kết thuốc đƣợc lựa chọn nghiên cứu 61 Bảng 3.11 Các tiêu phân tích lơ gà ăn khơng ăn bổ sung linh chi 68 Bảng 3.12 Các số phân tích lô gà ăn không ăn bổ sung gấc 69 Bảng 3.13 Chỉ số phân tích lơ gà ăn khơng ăn bổ sung trinh nữ hồng cung 71 Bảng 3.14 Các số phân tích lơ gà ăn khơng ăn bổ sung tam thất 73 Bảng 3.15 Các số phân tích cho gà ăn thức ăn có khơng có thành phần đông trùng hạ thảo 75 vii Bảng 3.16 Khả kháng vi sinh vật Viên tăng sức đề kháng đƣợc bào chế theo phƣơng pháp 79 Bảng 3.17 Khả thử hoạt tính chống xi hóa Viên tăng sức đề kháng đƣợc bào chế theo phƣơng pháp 79 Bảng 3.18 Khả kháng vi sinh vật Viên tăng sức đề kháng bào chế theo phƣơng pháp 81 Bảng 3.19 Khả thử hoạt tính chống xi hóa Viên tăng đề kháng đƣợc bào chế theo phƣơng pháp 81 Bảng 3.20 Thành phần hoạt chất sinh học có Viên tăng sức đề kháng 83 Bảng 3.21 Liều độc LD50 chuột uống bột Viên tăng sức đề kháng 84 Bảng 3.22 Chuột uống dung dịch hồ tinh bột (2%) × 3lần/ngày (đối chứng) 85 Bảng 3.23 Tác động Viên tăng sức đề kháng đến phát triển trọng lƣợng chuột 87 Bảng 3.24 Tác động Viên tăng sức đề kháng đến số huyết học chuột 88 Bảng 3.25 Tác động Viên Tăng sức đề kháng đến số hóa sinh thăm dị chức gan, thận chuột thí nghiệm 88 Bảng 3.26 Kết theo dõi triệu chứng lô gà thời gian ngày 92 Bảng 3.27 Kết mổ khám đại thể lô gà 93 Bảng 3.28 Kết xét nghiệm giải phẫu bệnh lý vi thể tuyến Fabricius gà 94 Bảng 3.29 Đo lƣờng hiệu giá kháng thể Gumboro qua phản ứng trung hoà huyết biểu lâm sàng gà 94 Bảng 3.30 Kết thử nghiệm lô gà (mỗ lô 30 gà) 95 Bảng 3.31 So sánh giá trị trung bình số liên quan đến hồng cầu lô gà A B 97 Bảng 3.32 Giá trị trung bình số liên quan đến hồng cầu lô gà C D 98 viii