Nghiên cứu phát hiện một số đột biến gen ty thể trên bệnh nhân cơ não người Việt Nam

IH QU GI H N I TRƢ NG Đ I HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trƣơng Thị Huệ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ TRÊN BỆNH NHÂN CƠ NÃO NGƢ I VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH H C Hà Nội, 2013 IH QU GI H N I TRƢ NG Đ I HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trƣơng Thị Huệ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ TRÊN BỆNH NHÂN CƠ NÃO NGƢ I VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 30 15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH H C NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA H C: PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Hà Nội, 2013 I CAM ĐOAN T i xin a an y ng nh nghi n ứ i hực hướng dẫn PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa v PGS.TS Nguyễn Thị V n ố iệ ế n ng ấ ng nh n h ận n ng hự v hưa ng ng ố NCS Trương Thị Huệ i nh ng L I C M ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa, người thầy tâm huyết tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi định hướng cho tơi q trình thực luận án Người thầy hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất, dành cho kiến thức quý giá suốt trình làm nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi đến Thầy lời tri ân điều mà Thầy dành cho tơi i in ày tỏ lịng c ơn tới PGS Nguy n hị ân nh, ch ẫn giúp đỡ t i qu tr nh thực luận án i in chân thành c ơn đến GS.TS Nguy n hanh Liê , Gi đốc Bệnh viện Nhi rung ương c c B c sĩ Phạm Thị ân nh, B c sĩ rịnh Thúy Ngọc nhiệt t nh giúp đỡ, cung cấp chia thông tin bệnh nhân trình thu thập mẫu nghiên cứu Tơi xin chân thành c ơn đến tồn thể quý thầy, cô Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh, Khoa Sinh học, rường Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành c ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh –K NN, rường Đại học Quy Nhơn, c c thầy, cô giáo, anh chị bạn è đồng nghiệp Khoa Sinh học, thành viên nhóm nghiên cứu Phịng Protein tái tổ hợp, Phịng Thí nghiệm trọng điể ng nghệ n y Prot in, rường Đại học Khoa học ự nhiên i in gửi lời c ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng au Đại học, Ban hủ nhiệm Khoa Sinh học c c Phòng chức rường Đại học Khoa học ự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều iện cho t i học tập, hoàn thành c c thủ t c cần thiết nghiên cứu sinh Luận n thực với tài trợ kinh phí đề tài NAFOSTED 106.06.123.09 b n thân t i hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với tư cách nghiên cứu sinh đề tài Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới c c ậc ố, chồng con, gia đ nh, người lu n ên t i, cổ vũ, động viên tạo điều iện thuận lợi cho tơi có thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận n NCS Trương Thị Huệ ii MỤC LỤC Trang LỜI M O N i LỜI M N ii M L iii NH M K HI U V NH M H VIẾT TẮT vi NG NH M viii H NH V TH ix MỞ ẦU HƯ NG TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 CẤU TRÚC VÀ CHỨ NĂNG ỦA TY THỂ NGƯỜI .5 1.1.1 Cấu trúc ty thể .5 1.1.2 Chứ ty thể 1.2 H GEN TY THỂ VÀ SỰ DI TRUYỀN CỦA CÁC GEN TY THỂ 12 1.2.1 Hệ gen ty thể 12 1.2.2 Sự di truyền theo mẹ thuyế “nú ổ chai di truyền” 16 1.2.3 Tính chấ 1.2.4 Tố 13 h ng ồng nhấ v ngưỡng biểu ột biến 18 ộ ột biến DNA ty thể 20 T BIẾN TRONG H GEN TY THỂ NGƯỜI VÀ CÁC B NH LIÊN QUAN 21 131 ột biến iểm DNA ty thể 22 132 ột biến khác DNA ty thể 29 1.3.3 Các bệnh i n 14 141 an ến rối loạn ty thể d PHƯ NG PH P PH T HI N ặ ột biến gen nhân 33 T BIẾN GEN TY THỂ 35 iểm chung bệnh d ột biến gen ty thể 35 Ph n í h ột biến iểm DNA ty thể PCR kết h p với RFLP 38 Ph n í h ột biến iểm x ịnh trình tự gen 39 4 Ph n í h ột biến gen ty thể số phương ph p h iii 39 HƯ NG NGUYÊN LI U V PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU 43 2.1 NGUYÊN LI U 43 2.1.1 Mẫu máu 43 2.1.2 Các hoá chất, nguyên liệu khác .43 2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT B 43 PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU .44 T h hiế N số t mẫu máu 44 2.3.2 Tách chiết DNA plasmid 44 av 2.3.3 Kiể 2.3.4 Nhân b n ịnh ng DNA tách chiết 45 ạn gen ty thể chứa ột biến kỹ thuật PCR 46 2.3.5 Kỹ thuật PCR kết h p với kỹ thuậ a h nh hiề d i ạn cắt giới hạn (PCR-RFLP) 46 2.3.6 Nhân dòng trực tiếp Gi i nh ự ạn gen chứa ột biến vào vector pGEM- T 47 ạn g n hứa ột biến 48 238 iện di DNA gel agarose 50 239 iện di DNA gel polyacrylamide .51 10 ịnh ng ột biến A3243G kỹ thuật real-time PCR 52 11 ịnh ng acid lactic máu .56 HƯ NG KẾT QU VÀ TH O LUẬN 57 3.1 PHÂN TÍCH Ặ TRƯNG ỦA B NH NHÂN CH N NGHIÊN CỨU T BIẾN GEN TY THỂ .57 311 ặ iểm bệnh lý: 57 312 ặ iểm tuổi giới tính: 59 3.2 XÂY DỰNG CÁCH THỨC PHÁT HI N M T S T BIẾN IỂM TRONG H GEN TY THỂ 60 3.2.1 Tách chiết DNA t mẫ v nh gi ộ tinh 60 3.2.2 Thiết kế cặp mồi ặc hiệu lựa chọn enzyme cắt cho kỹ thuật PCRRFLP dùng ể phát 323 X ột biến iểm hệ gen ty thể 61 ịnh iều kiện thích h p cho phân tích PCR-RFLP 66 iv X y dựng 3.3 SÀNG L ch thức phát ột biến iểm DNA ty thể .72 S T BIẾN GEN TY THỂ Ở B NH NHÂN NÃO .73 3.3.1 Sàng lọ ột biến A3243G PCR-RFLP 73 3.3.2 Sàng lọ ột biến A8344G / mấ 3.3.3 Sàng lọ ột biến T14728C PCR-RFLP 82 3.4 SỰ BIỂU HI N CỦ 3.4.1 Nghiên ạn bp PCR-RFLP 77 T BIẾN GEN TY THỂ Ở MỨ GI NH 88 ột biến A3243G thuộc hội chứng MELAS 88 3.4.2 Sự di truyền phân tử ột biến mấ ạn bp (nucleotide 8272-8280) 101 3.4.3 Sự di truyền phân tử ột biến T14727C thuộc hội chứng n .105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH 111 M TS ÔNG TR NH Ã ÔNG LIÊN QU N ẾN LUẬN ÁN 112 TÀI LI U THAM KH O 113 v DANH MỤC C C HIỆU V CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulfate Amp Ampicillin ANT Adenine nucleotide translocase bp Base pair (cặp azơ) BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ hu nh quang) COII Cyt c oxidase II CoQ CPEO Coenzyme Q Chronic progressive external ophthalmoplegia (liệt mắ ng i iến triển kinh niên) Cyt c Cytochrome c Cyt b Cytochrome b D-loop Vòng chuyển vị dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate ddH2O Deionized distilled H2O (nước cất loại ion, khử trùng) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide FAD+ Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa) FADH2 Flavin adenine dinucleotide (dạng khử) IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase KSS Kearns-Sayre syndrome (hội chứng KSS) LB Luria Bertani LHON L ’ h di a y p i n pa hy (liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber) LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa) MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes vi (não giậ ăng a id a i MERRF v gi tai biến mạch) Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres ( ộng kinh giậ với s i ỏ xé rách) MIDD Maternally inherited diabetes and deafness (bệnh tiể MRI ường v iếc di truyền theo mẹ) Magnetic resonance image (hình nh chụp cộng hưởng t ) mtDNA Mitochondrial DNA (DNA ty thể) nDNA Nuclear DNA (DNA nhân) NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa) NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng khử) NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos (hội chứng gây liệt, iều hòa viêm võng mạc ộ quang học) OD Optical density (mậ PCR Polymerase chain reaction (ph n ứng chuỗi polymerase) PEO Progressive external ophthalmoplegia (liệ RFLP Restriction fragment length polymorphism (sự a h nh tiến triển) ạn phân cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (dạng oxy ph n ứng) SDS Sodium dodecylsulphate TAE Tris -Acetate-EDTA TBE Tris -Borate-EDTA TEMED N N N’ N’- Tetramethyl-Ethylenediamine Tm Melting temperature (nhiệ X-gal 5-Bromo-4 chloro-3-indolyl--D galactopyranoside vii ộ nóng ch y) DANH MỤC CÁC B NG B ng 1.1 Các gen hệ gen ty thể 14 ng Thành phần b n gel polyacrylamide 51 B ng 2.2 Trình tự mồi mẫu dò dùng cho real-time PCR 54 B ng 3.1 ặ iểm lâm sàng tỷ lệ bệnh nhân bị ộng .57 B ng 3.2 Trình tự mồi chế ộ nhiệt cho PCR 63 B ng 3.3 Enzyme giới hạn dùng ng ph n í h ột biến 69 B ng 3.4 Một số ột biến hệ gen ty thể c phát bệnh nh n n 86 B ng 3.5 Tỷ lệ ột biến A3243G bệnh nh n v người thân gia nh 94 B ng 3.6 Triệu chứng lâm sàng tỷ lệ ột biến A3243G gia người nh 98 viii 58 Nguyễn Văn 11 t BN58 59 Trần Văn H 13 t BN59 60 Phan Thị Thanh H 1t BN60 61 Lê Doãn Xuân Tr 17 th BN61 62 Nguyễn Qu nh Tr th BN62 63 Nguyễn Mạnh D 15 t BN63 64 Vũ Thị Qu nh Ch 65 Nguyễn Thị Phương Kh 66 Trần 67 BN64 8t BN65 th BN66 Trần Quế Ph 53 ng BN67 68 Bùi Minh A 9t BN68 69 Nguyễn Thị Lan A 10 th BN69 th BN70 5t BN71 7,5 th BN72 nh Việt D Th i S 70 71 Nguyễn Hồng Quốc A 72 Cao Xuân H 73 Nguyễn Thị Thùy D th BN73 74 Cao Th o D 3t BN74 75 Lâm Thị Ch th BN75 76 Hồ Hữu N 6t BN76 77 Nguyễn 1t BN77 78 Lư 3,5 t BN78 79 Vũ Gia H 1t BN79 80 Nguyễn Anh D 9t BN80 81 Hoàng Thị Phương Th th BN81 82 Trần Tuệ Ng ng BN82 83 Nguyễn Văn 2t BN83 84 Chử Hoàng A th BN84 85 Nguyễn Thị Anh Th 2t BN85 86 Nguyễn Thị Kim Ng 40 ng BN86 87 Nguyễn Hoàng A 12 t BN87 nh H nh T 129 88 Trần Thị Thanh H 3t BN88 89 Trần Thị Thu H th BN89 90 Nguyễn Kim H 91 Nguyễn Minh Th th BN91 92 Nguyễn Danh H 75 ng BN92 93 Nguyễn Thị Lan A 2t BN93 94 Nguyễn Danh Tr 5t BN94 95 Trịnh Mai L 15 th BN95 96 Nguyễn Hoàng A 3t BN96 97 Nguyễn Thị Y 14 t BN97 98 Vũ Ngọc L 4t BN98 BN90 99 ương Minh H th BN99 100 inh Thị H 5t BN100 101 Phan văn M 12 t BN101 102 Phan Qu nh A th BN102 103 Phan Văn Th 8t BN103 104 Bùi Thị Minh Ng 10 t BN104 105 Nguyễn Văn Ph 106 Lê Thị Thúy Th BN105 5t 130 BN106 PHỤ LỤC ặ iểm lâm sàng bệnh nh n c nghiên cứu phát ột biến gen ty thể Đặc điểm lâm sàng STT Ký hiệu mẫu Tuổi Giới Tổn tính thƣơng não Bệnh Co giật Chậm Đau Mất Mất phát đầu, điều khả triển giảm hòa tinh thần nhận vận nghe vận động thức động nhìn Thiếu Nơn máu mửa Sụp Chứng mi rậm mắt lông Acid lacic (mmol/ l) BN1 th Nam - - ++ - - - - - - - - 2,6 BN2* 10 t Nam - - +++ - - - - ++ - - - 3,0 BN3 2t Nam + - ++ ++ - - - - - - - 3,4 BN4 15 t Nam ++ +++ + - + ++ - - - - - X BN5* 3t Nam + ++ ++ - - - - - +++ - - X BN6 th Nam - - +++ + - - - ++ - - - 2,0 BN7 2t Nam ++ + +++ ++ - + - - - - - 4,3 BN8 3t Nam BN9* th Nam ++ - ++ - + - - + ++ - - 6,3 10 BN10* 2t Nam + - +++ ++ - - - + - - - 3,3 11 BN11 th Nam ++ - ++ - - - - ++ - - - 3,2 12 BN12 1t Nam - ++ +++ ++ + - - +++ - - - 3,0 64 13 5t 12 t Nam Nữ ++ - +++ +++ - - + - - - ++ - - - 14 BN13 BN14 - - 2,7 X 15 BN15* 1t Nữ +++ - +++ - - - - - - - - 9,0 16 BN16* th Nữ ++ +++ ++ - - ++ - ++ - - - 4,0 17 BN17 th Nam - - +++ - - - - - - - - 2,9 18 BN18 12 t Nam +++ +++ - + - - - - - - - X 19 BN19 3t Nữ + + ++ + + - - - - - - 3,4 20 BN20 th Nam +++ ++ +++ - - - - - ++ - - 5,0 21 BN21 1t Nam ++ + + ++ - - - - - - - 3,2 22 BN22 th Nữ +++ + ++ +++ - - - - +++ - - 12,3 23 BN23 15 t Nữ - +++ ++ ++ + - - - - - - 3,5 24 BN24 5t Nữ - - - - - - +++ - ++ ++ - 4,5 25 BN25* 3t Nữ - +++ +++ - - - - - - - - 3,0 26 BN26 12 t Nữ +++ ++ ++ - - - - - - - - X 27 BN27 2t Nam - - ++ - - - - - - - - X 28 BN28* 10 t Nữ ++ +++ ++ - - + + - + - - 2,7 29 BN29 7,5 th Nam ++ - +++ - + - - +++ - - - 5,1 30 BN30 3t Nữ + - - - - - - ++ - - - 4,0 31 BN31 16 th Nam +++ - ++ - - - - ++ - - - X 65 32 BN32 3t Nữ - - +++ - - - - - - - - X 33 BN33 15 t Nữ - - ++ - - - - - + - - 7,4 34 BN34* th Nữ +++ + ++ - + - - - - - - 5,4 35 BN35 2t Nữ - - +++ - - - - - - - - X 36 BN36* 11 th Nam - + - ++ - - - + - - - X 37 BN37 5t Nam ++ - +++ - - - +++ - - - - 3,3 38 BN38 4t Nữ +++ - - - + - - + - 39 BN39* 3t Nam ++ - +++ +++ - - - - - - - 2,4 40 BN40 8t Nữ - +++ + - - - - - - - - 2,9 41 BN41 10 th Nữ - - ++ +++ - - - - - - - 2,8 42 BN42 12 t Nữ +++ +++ ++ ++ + +++ +++ - - +++ + 5,8 43 BN43 30 th Nữ - ++ - - - - - + - - - 4,4 44 BN44* 2t Nữ - +++ - ++ - ++ - - - - - 2,2 45 BN45 th Nữ - - +++ - + - - ++ + - - X 46 BN46* 2t Nam - - ++ - - - - - + - - X 47 BN47 7t Nam - + - +++ - - + - ++ - - X 48 BN48 12 t Nam +++ - +++ - + + - ++ - - - 7,5 49 BN49 3t Nam ++ - ++ + - - - - - - - 3,8 50 BN50 th Nam - + +++ + - - - - - - - 4,5 66 X 51 BN51* th Nam ++ - +++ ++ - +++ - - - - - 3,1 52 BN52 th Nam ++ - +++ - - - - ++ - - - 4,0 53 BN53* 4t Nữ + + ++ - - ++ - - - - - X 54 BN54 th Nữ - ++ - - - - - +++ - - - 4,7 55 BN55 th Nữ - - ++ - - - - - - - - 3,3 56 BN56* 2t Nam + - +++ - + - - - - - - 5,5 57 BN57 1t Nữ ++ + ++ ++ - - - - - - - 4,9 58 BN58* 11 t Nam +++ +++ +++ +++ - +++ - - - - + 9,2 59 BN59* 13 t Nam +++ - +++ + - - - - - - - 4,3 60 BN60 1t Nữ + - + - - - - - - - - 2,8 61 BN61* 17 th Nam +++ + ++ - + - + + - - - 3,4 62 BN62 th Nữ + - +++ - - - - - ++ - - 3,4 63 BN63* 15 t Nam - - ++ - - - - - - - - X 64 BN64 1t Nữ 65 BN65* 8t Nữ + ++ + - - - - + - - - X 66 BN66* th Nam + ++ ++ - + - - +++ - - - 5,1 67 BN67 53 ng Nữ - - +++ - - - - - - - - 4,1 68 BN68 9t Nam - ++ - - - +++ - - - - - 3,1 69 BN69 10 th Nữ +++ ++ ++ + - - - - - - - 2,8 67 70 BN70* th Nam - - +++ - - - - - - - - X 71 BN71 5t Nam +++ - ++ - - - - - - - - 3,6 72 BN72 7,5 th Nam - - +++ ++ - - - + - - - 4,8 73 BN73 th Nữ - + +++ ++ + - - - - - - 3,4 74 BN74 3t Nam ++ - +++ - - - - - - - - 4,0 75 BN75 th Nữ ++ - +++ - - - - - - - - 2,9 76 BN76 6t Nam +++ - +++ ++ - - - - - - - 4,0 77 BN77 1t Nam - + +++ - - - - - - - - 4,0 78 BN78 3,5 t Nam - ++ - - - - - +++ - - - X 79 BN79 1t Nam ++ - ++ ++ - - - - - - + 3,5 80 BN80 9t Nam +++ + + ++ - +++ ++ - - + + 7,7 81 BN81 th Nữ - + ++ - - - - - - - - X 82 BN82 ng Nam - - +++ - - - - - - - - 5,4 83 BN83 2t Nam - + +++ - - - - - - - - 2,0 84 BN84 th Nữ + - +++ ++ + - - ++ - - 4,1 85 BN85 2t Nữ - + ++ - - - - - - - - X 86 BN86 40 ng Nữ - - +++ - - - - - - - - 5,4 87 BN87 12 t Nữ - ++ ++ - - - - - - - - X 88 BN88 3t Nữ ++ - ++ - - - - - - - - 3,2 68 89 BN89 th Nữ 90 BN90 th Nữ 91 BN91 th 92 BN92 93 - - +++ - - - - - - - - 4,1 Nữ + + - + - - - - - - - 4,1 75 ng Nam +++ - - - - - - ++ - - - 4,1 BN93 2t Nữ - - +++ - - - - - - - - X 94 BN94 5t Nam ++ ++ +++ - - +++ - - - - - X 95 BN95 15 th Nữ ++ - ++ - - - - +++ + - - 5,8 96 BN96 3t Nữ + - + - - - - - +++ - - X 97 BN97 14 t Nữ - ++ + - - - - - - - - X 98 BN98 4t Nữ +++ - ++ ++ - - - + + - - 4,7 99 BN99 th Nam - ++ +++ - - - - +++ - - - 2,8 100 BN100 5t Nữ +++ ++ - + - - - - - ++ - 3,6 101 BN101 12 t Nam +++ +++ +++ + ++ + + + + - + 8,5 102 BN102 th Nữ ++ - +++ ++ - - - ++ - - - 2,4 103 BN103 8t Nam - + - - ++ - - - - - - X 104 BN104 10 t Nữ +++ - ++ - + - - - + - - X 105 BN105 2t Nam 106 BN106 5t Nữ - +++ - + - - ++ - - - - 6,4 Ghi chú: BN*: mấ ạn bp, +: nhẹ; ++: trung bình; +++: nghiêm trọng; - : khơng có triệu chứng; X : hưa x 69 ịnh; t: tuổi; th: tháng; ng: ngày PHỤ LỤC H ng N v hỉ ố A260 /A280 ẫ ệnh nh n nghi n ứ Ghi chú: Số thứ tự (STT) ph l c tương ứng với số thứ tự tên bệnh nhân ph l c 118 PHỤ LỤC Điện di sản phẩm PCR-RFLP nhuộm bạc đoạn gen mang đột biến A3243G thành viên ba gia đình ệnh nhân mang đột biến Thang chuẩn DNA (1, 11, 18); s n phẩm PCR không cắt HaeIII (2, 12, 19); ối chứng dương (3 13 20); gia nh BN4 (4-10) gia nh N89 (14-17) gia nh N101 (21-25), bệnh nhân (4, 14, 21), em bệnh nhân (5), mẹ bệnh nhân (6, 15, 22), bà ngoại/dì/cậu (8, 9, 10, 17, 24, 25) bố bệnh nhân (7, 16, 23) Điện di sản phẩm PCR-RFLP nhuộm bạc đoạn gen mang đột biến T14727C thành viên hai gia đình ệnh nhân mang đột biến Thang chuẩn DNA (1, 8); s n phẩm PCR không cắt DraI (2, 9); gia gia nh N7 (3-7), nh N50 (10-13), bệnh nhân (3, 10), anh/chị bệnh nhân (4, 5, 11), mẹ bệnh nhân (6, 12), bố bệnh nhân (7, 13) 119 PHỤ LỤC Kế ph n í h ịnh ng ố n py 3243G ộ iQ5 cycler (Biorad) Gia đình ệnh nhân I Lần Lần Lần 120 iến n hệ hống Gia đình ệnh nhân II Lần Lần Lần 121 Gia đình ệnh nhân III Lần Lần Lần 122 Gia đình ệnh nhân IV Lần Lần Lần 123 Gia đình ệnh nhân V Lần Lần Lần 124