Enzyme Oxydase

Enzyme Oxydase

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINHVIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨMGVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Lớp: DHSH6LT SVTH: Nhóm 6Võ Thị Kim ChiNguyễn Thị HiếuĐoàn Thị Kim Hồng HiệpVõ Thị Mỹ Trang ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶMỤC LỤC1. TÍNH CHẤT CHUNG CỦA OXYDASE: 3 2. NGUỒN THU NHẬN 6 3. VAI TRÒ VÀ TÁC DỤNG 7 3.1. Sản xuất bánh nướng 7 3.2. Sản xuất bột trứng . 7 3.3. Bảo quản thực phẩm . 8 3.4. Sản xuất bia, rượu . 9 3.5. Chế biến sữa . 10 3.6. Công ngệ dệt . 11 3.7. Mỹ phẩm . 11 3.8. Xử lý môi trường 11 3.9. Định lượng thực phẩm 12 3.10. Y học, chuẩn đoán bệnh . 13 4. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN 14 4.1. Phân lập vi sinh vật bằng phương pháp cấy trên môi trường đặc . 14 4.2. Lên men sinh tổng hợp enzyme GOD 14 5.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH . 15 6. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 15 6.1. Xác định nồng độ protein hoà tan theo Lowry 15 a. Nguyên tắc . 15 b. Hoá chất cần dùng 16 c. Cách tiến hành . 16 d. Xây dựng đường đồ thị chuẩn . 16 7. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME GLUCOSE-OXIDASE 18 7.1. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp dựa vào đường cong chuẩn hydrogen peroxide . 18 7.1.1Nguyên tắc: 18 7.1.2 Dụng cụ - Hoá chất . 18 7.1.3. Cách tiến hành . 19 7.1.4. Xây dựng đồ thị đường chuẩn H2O2 19 7.1.5. Tính kết quả . 20 7.2. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp chuẩn độ 20 8. PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH ENZYME . 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 SVTH: Nhóm 6 Trang 2 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ1. TÍNH CHẤT CHUNG CỦA OXYDASE: Oxydase là enzyme thuộc lớp Oxydoreductase. Đây là enzyme xúc tác cho phản ứng oxi-hóa-khử.SVTH: Nhóm 6 Trang 3 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Là nhóm enzyme oxy hóa cơ chất, chuyển hóa electron đến oxy. Oxydase hoạt hóa oxy, làm cho chúng có khả năng kết hợp với proton có trong môi trường.  Lớp enzyme này tác dụng trực tiếp với oxy, tạo ra nước (H2O) hoặc hydrogen peroxide ( H2O2). Enzym tiêu biểu là xitocromoxydase, poly phenoloxydase, ascorbatoxydase, peroxydase, catalase, các oxydase flavin. Sơ đồ hoạt động của oxydase như sau:SVTH: Nhóm 6 Trang 4 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Hình1 Cấu trúc không gian của glucose oxidase Với trọng lượng phân tử 192.000 Dalton. Glucose oxidase là một protein lưỡng phân hình thành từ 2 tiểu đơn vị giống nhau. Mỗi tiểu đơn vị hoặc monomer, cuộn vào trong 2 domain: một domain gắn với cơ chất, a β-D-glucose, trong khi đó domain khác liên kết không đồng hóa trị với một nhân tố phụ, flavin adenine dinucleotide (FAD), mà nó sử dụng như một tác nhân oxy hóa mạnh. FAD là một thành phần phổ biến trong các phản ứng oxy hóa khử sinh học, nó nhận và cho các điện tử từ một phân tử. Trong glucose oxydase, FAD hoạt động như một chất nhận điện tử mà làm cho nó bị khử thành FADH2; FADH2 sau đó bị oxy hóa bởi chất nhận điện tử cuối cùng, phân tử oxy, oxy sẽ bị khử thành hydrogen peroxide (H2O2). Glucose oxidase được tiết ra bởi nấm mốc, chủ yếu là Aspergillus niger hay Penicillium amagaskinense. Nó được phân bố giữa dịch ngoại bào, vách tế bào, và trong chất dịch nhầy của nấm mốc. Quá trình tổng hợp gucose oxydase có thể được kích thích bởi các chất khác nhau, bao gồm phân tử oxy, mà nó kích thích sự dịch mã enzyme. Glucose Oxidase bản thân nó không hoạt động, nhưng với sự hiện diện của những cơ chất đặc trưng, enzyme được sử dụng để oxy hóa trực tiếp phân tử glucose hoặc oxygen. SVTH: Nhóm 6 Trang 5 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶNhóm ngoại của enzyme này là FAD. Các sản phẩm của phản ứng này là gluconic acid và hydrogenGlucose oxydase có thể oxi hóa β-D-glucose sử dụng các chất oxi hóa khác bên cạnh phân tuoxy,bao gồm các quinine và các chất nhận 1 electron. D-glucono-1,5-lactone sau đó tự động thủy phân để tạo ra gluconic acidC6H12O6 + H2O + 1/2O2 → C6H12O7 + H2O2 Glucose gluconic acidPhản ứng tối ưu ở điều kiện nhiệt độ giữa 30 đến 50oC tại pH giữa 4.5 đến 6.5.2. NGUỒN THU NHẬNEnzym Nguồn enzym Glucose oxidase (EC.1.1.3.4) Aspergillus niger.A. Oryzae Penicillium notatum. Catalase (EC.1.11.1.6) Gan bò, Aspergillus sp. Cholesterol oxydase (EC.1.1.3.6) Nocardiaerythr Ascorbat oxydase (EC.1.10.3.3) Cucurbita sp. Peroxidase (EC.1.11.1.7) Củ cải ngựa Pyruvate oxidase (EC.1.2.3.3) Pediococcus sp. Glycerol 3-phosphate oxidase (EC.1.1.3.21) Aerococcus viridans SVTH: Nhóm 6 Trang 6 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶNADH-peroxidase (EC.1.11.1.1) Streptococcus faccalis Sulfite oxidase (EC.1.8.3.1) Gan gà Urate oxidase (EC.1.7.3.3) Arthrobacter protophormiac Xanthine oxidas(EC.1.1.3.22) Sữa bò 3. VAI TRÒ VÀ TÁC DỤNG Oxydase là enzyme ứng dụng nhiều trong nhiều lĩnh vực.3.1. Sản xuất bánh nướng Các oxydase thường dùng là Glucose oxidase, Hexose oxidase, Peroxidase, Lipoxygenase, polyphenol oxidase với tác dụng là: Tăng lực của gluten, đảm bảo chất lượng bột làm bánh, cải thiện mùi vị và màu sắc của sản phẩm. 3.2. Sản xuất bột trứng SVTH: Nhóm 6 Trang 7 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Các oxydase thường dùng là Glucose oxidase, , catalase với tác dụng là: Loại glucose của lòng trắng trứng để tránh phản ứng mailard, tăng thời gian bảo quản sản phẩm trứng. Người ta thấy rằng nêu trong bột trứng có chứa glucose thì trong quá trình chế biến cũng như khi bảo quản, glucose sẽ tương tác với protein và sẽ bị oxy hóa dần để tạo nên những phẩm vật có màu sẫm và mùi khó chịu, làm cho chất lượng thành phẩm bị giảm sút. Trong albumin trứng thường có chứa 3% glucose còn trong lòng đỏ chứa 0,5% glucose (so với chất khô). Vì vậy, trong sản xuất bột trứng và albumin trứng, người ta dùng glucose oxydase để oxy hóa trước các glucose đó, khiến cho những quá trình trên không xảy ra, đồng thời cũng tăng được thời gian bảo quản các sản phẩm trứng. 3.3. Bảo quản thực phẩm SVTH: Nhóm 6 Trang 8 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶ Các oxydase thường dùng: Glucose oxidase, catalase nhằm tránh thực phẩm khỏi bị oxyhóa, như thịt, sữa, phomat…Glucose oxidase được sử dụng thành công đê cầu nối glucose và oxy trong thực phẩm và thức uống để kéo dài thời gian bảo quản cho thực phẩm và đồ uống. Hydrogen peroxide được sản sinh ra từ enzyme này hoạt động như một chất diệt vi khuẩn rất tốtGlucose oxidase có thể được sử dụng để loại bỏ oxy ở đầu chai nước đồ uống trước khi chúng được đóng chai. Để bảo quản các sản phẩm dạng lỏng, người ta có thể hòa tan vào đó Glucose oxidase cùng một ít glucose trước khi bao gói. Khi đó tất cả oxy dư trong sản phẩm sẽ được tách hết.Phomai được đóng gói trong một màng đặc biệt có tẩm Glucose oxidase, sẽ ngăn ngừa được sự xâm nhập của oxy, sự biến đổi do oxy hóa và sự tạo màu xẫm ở lớp bề mặt. Còn thịt nếu được bọc trong giấy trắng kính tẫm enzyme cũng sẽ bảo vệ được màu sắc tự nhiên của nó. Gần đây, có những sản phẩm dạng “túi khử oxy”, chúng gồm một ít glucose, chế phẩm Glucose oxidase-catalase và dung dịch đệm cần thiết cho vào trong 1 túi polyetylen (hay vật liệu khác) chỉ để cho oxy và không khí đi qua mà không cho nước đi qua. Đặt túi vào trong hộp, thùng kín có chứa các sản phẩm cần bảo quản. Túi đó sẽ hấp thu hoàn toàn oxy, làm cho vật liệu được bảo quản tốt. Sữa khô, các mặt hang kẹo, bơ có thể được bảo quản lâu nhờ túi khử này, ngoài ra còn dùng bảo vệ các chi tiết máy tinh vi và các thiết bị khỏi bị han gỉ và ăn mòn.3.4. Sản xuất bia, rượu SVTH: Nhóm 6 Trang 9 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS. LÂM KHẮC KỶGlucose oxidase , catalase, peroxydase, ascorbinatoxydase Kéo dài thời gian sử dụng bia, chống sự mất màu đỏ của rượu vang đỏ, và vang trắng chuyển màu. Glucose oxidase có khả năng sử dụng trong công ngiệp làm rượu, mà nó làm giảm độ cồn trong rượu thông qua việc loại bỏ một số glucose (chuyển nó thành dạng D-glucono-1,5-lactonea nếu không nó sẽ chuyển thành cồn. Hơn nữa glucose oxidase có thể ngăn chặn sự hư hỏng rượu thông qua tác động diệt vi khuẩn của nó lên vi khuẩn acetic acid và vi khuẩn lacitc acid trong suốt quá trình lên men. Enzyme này sẽ được bổ sung thêm vào rượu đê tăng hiệu quả diệt vi sinh vật. Trong sản xuất bia, người ta dùng Glucose oxidase để ổn định thành phần. ở nhiệt độ phòng bia chưa được thanh trùng sẽ bị đục sau 10-15 ngày bảo quản do nấm mốc và vi khuẩn phát triển. Nếu cho một ít chế phẩm Glucose oxidase vào bia (1g/200-250l) thì sẽ tách hết oxy có trong chất lỏng cũng như trong các khoảng không tự do, kết quả là tính cảm quan của sản phẩm sẽ được bảo đảm trong thời gian từ 50-100 ngày.3.5. Chế biến sữa Glucose oxidase, catalase Peroxidase,Lactoperoxidase dùng trong bảo quản sữa. SVTH: Nhóm 6 Trang 10 [...]... tính là lượng enzyme cần để tạo ra 1µ mol gluconic acid và H2O2 trong một phút ở điều kiện pH 5.1 và nhiệt độ 250C 7.1.2 Dụng cụ - Hoá chất a Dụng cụ − Ống nghiệm − Pipets − Quang phổ kế − Cuvettes b Hoá chất & enzyme −Dung dịch Hydrogen peroxide (H2O2) chuẩn SVTH: Nhóm 6 Trang 18 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS LÂM KHẮC KỶ −Acid sulfuric (H2SO4) −Thuốc thử α-dianisidine Enzyme Peroxidase (POD) Enzyme Glucose... tổng hợp enzyme GOD 5.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH 6 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 6.1 Xác định nồng độ protein hoà tan theo Lowry 7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME GLUCOSE-OXIDASE SVTH: Nhóm 6 Trang 23 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS LÂM KHẮC KỶ 7.1 Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp dựa vào đường cong chuẩn hydrogen peroxide 7.2 Xác định hoạt tính enzyme. .. trường Enzyme này xúc tác phản ứng đặc hiệu là phản ứng oxi hoá L-galactono-1,4lactone thành L-ascorbate Các enzyme polyphenol oxidase có khả năng xúc tác cho các phản ứng ôxy hoá các hợp chất phenol Các enzyme này được chia thành hai phân họ: tyrosinase và laccase Hoạt tính của cả hai họ đều cần sự có mặt của oxy phân tử nhưng không cần có mặt các coenzyme Tyrosinase (EC 1.14.18.1) hay polyphenol oxydase, ... Nhóm 6 Trang 19 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS LÂM KHẮC KỶ Đo mật độ quang OD 530nm (OD530) và xây dựng đường chuẩn H2O2 7.1.5 Tính kết quả Từ phương trình đồ thị đường chuẩn tính được lượng H2O2 tạo thành trong phản ứng enzyme 7.2 Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp chuẩn độ Đây là được sử dụng phương pháp phổ biến để xác định hoạt tính của GOD Trong phương pháp này, 1 ml dung dịch enzyme được... D-gluconic và H2O2 trong 1 phút ở pH 5.6 và nhiệt độ 300C SVTH: Nhóm 6 Trang 20 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS LÂM KHẮC KỶ 8 PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH ENZYME Mẫu ban đầu (phá vỡ tế bào, ly tâm) Thu dịch ly tâm (NH4)2SO4 Kết tủa Loại muối Chạy sắc ký trao đổi iôn (trao đổi iôn âm) Loại muối Sấy khô (nhiệt độ thấp) SVTH: Nhóm 6 Trang 21 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS LÂM KHẮC KỶ Sắc ký lọc gel Sấy khô (nhiệt độ thấp) Sản phẩm... thị chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu SVTH: Nhóm 6 Trang 17 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS LÂM KHẮC KỶ 7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME GLUCOSE-OXIDASE 7.1 Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp dựa vào đường cong chuẩn hydrogen peroxide 7.1.1Nguyên tắc: Hoạt tính enzyme Glucose oxidase được đo bằng cách xác định hàm lượng hydrogen peroxide (H2O2) tạo thành... H2O2 + HBA + 4-AAP————> thuốc nhuộm Quinoneimine + H2O Phương trình 1: Glucose bị oxy hóa bởi glucose oxydase tạo ra gluconic acid và hydrogen peroxide SVTH: Nhóm 6 Trang 13 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS LÂM KHẮC KỶ Phương trình 2: Hydrogen peroxide phản ứng với HBA và 4-aminoantipyrine với sự hiện diện của enzyme Peroxidase hình thành nên 1 quinoneimine bắt màu đỏ Cường độ màu tạo thành thì tương ứng với.. .ENZYME OXYDASE GVHD: ThS LÂM KHẮC KỶ 3.6 Công ngệ dệt Glucose oxidase, catalase, Lacase dùng để làm trắng, loại peroxide thừa trên sợi trước khi nhuộm màu, phân giải và oxy hóa chất màu 3.7 Mỹ phẩm Trong thuốc nhuộm tóc, enzyme peroxydase tạo H2O2 tại chỗ nồng độ thấp, không làm hại tóc 3.8 Xử lý môi trường Loại bỏ... Aspergillus niger D G Hatziuikolaou và B J Macris (1995), Elsevier Science Inc, 17, (6/1995), tr.530-34 8 Characterization and quantitative analysis glucose oxydase SVTH: Nhóm 6 Trang 22 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS LÂM KHẮC KỶ MỤC LỤC 1 TÍNH CHẤT CHUNG CỦA OXYDASE: 2 NGUỒN THU NHẬN 3 VAI TRÒ VÀ TÁC DỤNG 3.1 Sản xuất bánh nướng 3.2 Sản xuất bột trứng ... tích cực trong việc xử l dịch lỏng sau quá tr.nh tẩy nói trên và dạng cố định của các loại enzyme này trong mọi trường hợp đều hiệu quả hơn so với dạng tự do 3.9 Định lượng thực phẩm Phân tích thành phần cholesterol, sulfite trong thực phẩm SVTH: Nhóm 6 Trang 12 ENZYME OXYDASE GVHD: ThS LÂM KHẮC KỶ Dùng cholesterol oxydase, sau đó dùng catalase để chuyển hóa tiếp H2O2 được tạo thành, và xác định formaldehyde . phenoloxydase, ascorbatoxydase, peroxydase, catalase, các oxydase flavin. Sơ đồ hoạt động của oxydase như sau:SVTH: Nhóm 6 Trang 4 ENZYME OXYDASE. CHẤT CHUNG CỦA OXYDASE:  Oxydase là enzyme thuộc lớp Oxydoreductase. Đây là enzyme xúc tác cho phản ứng oxi-hóa-khử.SVTH: Nhóm 6 Trang 3 ENZYME OXYDASE