Nghiên cứu enzyme

enzyme

4 Mục lục Trang Lời nói đầu Chương Mở đầu 1.1 Định nghĩa enzyme 1.2 Lược sử nghiên cứu enzyme 1.2.1 Giai đoạn 1.2.2 Giai đoạn 1.2.3 Giai đoạn 1.2.4 Giai đoạn 12 1.3 Phương hướng nghiên cứu enzyme 14 1.4 Những vấn đề cần đề cập nghiên cứu enzyme 16 1.5 Vấn đề nghiên cứu enzyme nước ta 17 Tài liệu tham khảo 18 Chương Phương pháp nghiên cứu enzyme 19 2.1 Những nguyên tắc chung nghiên cứu enzyme 19 2.2 Tách làm (tinh chế) enzyme 21 2.2.1 Chọn nguồn nguyên liệu 21 2.2.2 Chiết rút enzyme 26 2.2.3 Các phương pháp tách phần protein enzyme 28 2.2.4 Kết tinh protein enzyme 38 2.2.5 Đánh giá tính đồng thể protein enzyme 39 Hoạt độ enzyme 41 2.3.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 41 2.3.2 Đơn vị hoạt độ enzyme 41 2.3 Tài liệu tham khảo 43 Chương Cách gọi tên phân loại enzyme 44 3.1 Cách gọi tên enzyme 44 3.2 Phân loại enzyme 44 3.2.1 Các lớp enzyme 44 3.2.2 Các phản ứng enzyme 46 Tài liệu tham khảo 51 Chương Cấu trúc phân tử enzyme 52 4.1 Bản chất hóa học enzyme 52 4.2 Thành phần cấu tạo enzyme 53 4.3 Cấu trúc bậc enzyme 54 4.4 Trung tâm hoạt động enzyme 56 4.5 Phương pháp thăm dị phát nhóm chức trung tâm hoạt động enzyme 57 4.5.1 Phương pháp dùng chất ức chế 58 4.5.2 Phương pháp đánh dấu chất đặc hiệu coenzyme 59 4.5.3 Xác định trị số pK nhóm hoạt động 60 4.5.4 Nghiên cứu cấu trúc phân tử 60 4.6 Các dạng phân tử enzyme 61 4.7 Phức hợp multienzyme 62 Tài liệu tham khảo 63 Chương Tính đặc hiệu enzyme 64 5.1 Khái niệm chung 64 5.2 Các hình thức đặc hiệu 64 5.2.1 Đặc hiệu kiểu phản ứng 64 5.2.2 Đặc hiệu chất 64 Tài liệu tham khảo 68 Chương Cơ chế tác dụng enzyme 69 6.1 Cơ chế phản ứng có xúc tác nói chung 69 6.2 Cơ chế xúc tác enzyme 69 Tài liệu tham khảo 73 Chương Động học Enzyme 74 7.1 Ý nghĩa việc nghiên cứu động học enzyme 74 7.2 Động học phản ứng enzyme 74 74 7.2.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme Ảnh hưởng nồng độ chất [S] 7.2.3 Ảnh hưởng chất kìm hãm (inhibitior) 79 7.2.4 Ảnh hưởng chất hoạt hóa (activator) 7.2.5 87 7.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ Ảnh hưởng pH 7.2.7 Các yếu tố khác 89 Tài liệu tham khảo 91 Chương Sinh học enzyme 92 8.1 Sự phân bố enzyme tế bào 92 8.2 Điều hòa hoạt độ số lượng enzyme tế bào 94 8.2.1 Điều hòa hoạt độ enzyme 94 8.2.2 Điều hòa sinh tổng hợp enzyme 101 Tài liệu tham khảo 108 Chương Công nghệ enzyme ứng dụng 109 9.1 Công nghệ enzyme 109 9.1.1 Enzyme với công nghệ sinh học 109 9.1.2 Công nghệ sản xuất enzyme 109 Ứng dụng 111 9.2.1 Ứng dụng y dược 111 9.2.2 Ứng dụng hóa học 112 9.2.3 Ứng dụng công nghiệp 113 Tài liệu tham khảo 116 7.2.1 9.2 75 88 Chương Mở đầu 1.1 Định nghĩa enzyme Trong thể sống (các tế bào) ln xảy q trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng sống khơng cịn tồn Quá trình trao đổi chất tập hợp quy luật nhiều phản ứng hóa học khác Các phản ứng hóa học phức tạp có liên quan chặt chẽ với điều chỉnh lẫn Enzyme hợp chất protein xúc tác cho phản ứng hóa học Chúng có khả xúc tác đặc hiệu phản ứng hóa học định đảm bảo cho phản ứng xảy theo chiều hướng định với tốc độ nhịp nhàng thể sống Chúng có hầu hết loại tế bào thể sống Chính tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme gọi chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với chất xúc tác hóa học Enzyme học khoa học nghiên cứu chất xúc tác sinh học có chất protein Hay nói cách khác, enzyme học khoa học nghiên cứu tính chất chung, điều kiện, chế tác dụng tính đặc hiệu enzyme 1.2 Lược sử nghiên cứu enzyme Do enzyme học coi cột sống hóa sinh học nên phần lớn nghiên cứu hóa sinh từ trước đến liên quan nhiều đến enzyme Về phát triển học thuyết enzyme, chia thành giai đoạn: - Giai đoạn 1: trước kỷ thứ XVII - Giai đoạn 2: từ kỷ XVII đến nửa đầu kỷ XIX - Giai đoạn 3: từ kỷ XIX đến 30 năm đầu kỷ XX - Giai đoạn 4: từ năm 30 kỷ XX đến 1.2.1 Giai đoạn Trước kỷ XVII người ta biết sử dụng q trình enzyme đời sống song có tính chất kinh nghiệm thực tế thơng qua hoạt động vi sinh vật Đó q trình lên men rượu, muối dưa, làm tương nước chấm Ở thời kỳ người ta chưa hiểu chất enzyme trình lên men 1.2.2 Giai đoạn Ở giai đoạn nhà bác học tiến hành tìm hiểu chất trình lên men Thời kỳ khái quát tượng lên men tượng phổ biến sống enzyme yếu tố gây nên chuyển hóa chất q trình lên men Vào năm 1600 kỷ XVII, Van Helmont người cố gắng sâu tìm hiểu chất trình lên men Van Helmont nhận thấy thực chất tiêu hóa chuyển hóa hóa học thức ăn giải thích chế với so sánh với q trình lên men rượu Danh từ ferment (từ chữ Latinh fermentatio - lên men) Van Helmont dùng để tác nhân gây chuyển biến chất trình lên men rượu Vào nửa cuối kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp Réaumur nghiên cứu chất tiêu hóa Nhà tự nhiên học cho chim quạ đen nuốt miếng thịt đặt sẵn ống kim loại có thành đục sẵn buộc vào dây thép Sau vài không thấy ống Hiện tượng thúc đẩy nghiên cứu thành phần dịch tiêu hóa để tìm hiểu khả tiêu hóa dịch dày Sau thí nghiệm thời gian, vào năm 1783, nhà bác học người Ý Spalanzani lặp lại thí nghiệm cách lấy dịch dày trộn với thịt thấy có tượng hịa tan xảy Vào đầu kỷ XIX, nhà nghiên cứu tách chất gây trình lên men Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg phát nước chiết mầm đại mạch có khả chuyển hóa tinh bột thành đường nhiệt độ thường Đây cơng trình thu chế phẩm amylase dạng dung dịch lịch sử enzyme học thực xem Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp Payen Pessoz chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường tách dạng bột Thí nghiệm tiến hành cách cho etanol vào dịch chiết lúa đại mạch nảy mầm thấy xuất kết tủa Kết tủa hình thành có khả chuyển hóa tinh bột đun kết tủa tác dụng chuyển hóa Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) Payen Persoz dùng để gọi enzyme amylase lúc Tiếp người ta tìm tách nhiều enzyme khác enzyme phân giải protein dịch tiêu hóa dày Pepsin (Emberle Shwan) - nhà khoa học người Đức, năm 1836) Sau đó, lý thuyết xúc tác đời Năm 1835, nhà khoa học Berzelius có quan điểm cho tăng tốc độ phản ứng tượng xúc tác Đây quan điểm Song thật đáng tiếc nhà khoa học coi chất xúc tác hoạt động " lực sống" không theo điều khiển người Đây quan điểm tâm, siêu hình làm trì trệ phát triển khoa học ảnh hưởng sâu sắc đến sưh phát triển ngành enzyme học 1.2.3 Giai đoạn Giai đoạn từ kỷ XIX đến 30 năm đầu kỷ XX Ở giai đoạn số lượng lớn enzyme dạng hòa tan tách chiết Trong thời kỳ này, có hai trường phái đấu tranh với nhau: trường phái Pasteur - nhà bác học vĩ đại người Pháp trường phái Liebig - nhà bác học tiếng người Đức * Trường phái Pasteur: Năm 1856 Pasteur đề cập đến chất trình lên men Ơng cho khơng thể tách enzyme khỏi tế bào Tác dụng tính chất enzyme gắn liền với sống tế bào trình lên men rượu kết hoạt động sống tế bào nấm men kết tác dụng enzyme Ông tiến hành thí nghiệm nhận thấy dung dịch hữu cơ, ví dụ dung dịch glucose để bình khử trùng khơng xảy q trình lên men rượu Chính suy nghĩ ấy, Pasteur chia enzyme thành loại: "enzyme có tổ chức" "enzyme khơng có tổ chức" Theo ơng, "enzyme có tổ chức" enzyme tách khỏi tế bào, tách chúng bị tác dụng xúc tác enzyme tế bào nấm men thực q trình lên men rượu; cịn "enzyme khơng có tổ chức" enzyme thực tính xúc tác ngồi thể enzyme có dịch tiêu hóa (ví dụ Pepsin dày, amylase tuyến nước bọt, mầm thóc ) Quan điểm sai lầm Pasteur thống trị ngành enzyme học thời gian dài Năm 1878 Kuhne đề nghị dùng danh từ "ferment" (từ tiếng Latinh: fermentatio = lên men) để gọi "enzyme cớ 10 tổ chức" gọi chất chiết có tác dụng xúc tác cho phản ứng hóa học enzyme (từ chữ Hy Lạp: en = bên trong, zyme = men rượu, tức "ở nấm men" để gọi enzyme "khơng có tổ chức" Danh từ enzyme xuất phát từ * Trường phái Liebig: Chống lại quan điểm Pasteur, Liebig (trước có Berzelius) cho khơng có hoạt động tế bào vi sinh vật có q trình lên men Điều có nghĩa ơng coi enzyme chất hóa học gây nên hiệu tương tự chất xúc tác, tác dụng tế bào, không phụ thuộc vào hoạt động sống cúa vi sinh vật Nhưng năm 1871 Liebig thất bại thực nghiệm không chứng minh quan điểm Các thí nghiệm tiến hành cách lấy dịch chiết từ tế bào nấm men nghiền nát khơng có tác dụng gây lên men rượu Cũng vào năm1871 Manatxein bác sĩ người Nga dùng cát thạch anh nghiền tế bào nấm men thu dịch chiết không chứa tế bào có khả biến đổi đường thành rượu Nhưng quan sát không ý tới Chính vậy, quan điểm siêu hình Pasteur hạn chế nhiều phát triển ngành enzyme học Đến năm 1897, H Büchner - nhà khoa học người Đức nhận dịch chiết nấm men cách phân huỷ tế bào hoàn thiện Trong thí nghiệm này, tế bào nấm men nghiền nát hồn tồn với bột thủy tinh, sau ép áp suất cao Dịch chiết thu khơng chứa tế bào có khả gây q trình lên men (chuyển hóa glucose thành rượu) Điều chứng tỏ q trình lên men rượu khơng phải kết hoạt động sống tế bào nấm men mà kết tác dụng enzyme vốn có tế bào Do đó, quan điểm sai lầm enzỵme "có tổ chức" enzyme "khơng có tổ chức" mà thực chất chất enzyme đến lúc hoàn toàn bị đánh đổ, mở thời kỳ phát triển ngành enzyme học Cũng từ khơng có phân biệt nội dung thuật ngữ "ferment" "enzyme" Có thể nói rằng, cơng trình Büchner đánh dấu bước ngoặt quan trọng lịch sử phát triển enzyme học Sau đó, nhiều loại enzyme thể sống tìm Vì việc phân loại gọi tên enzyme cách thống cần thiết Năm 1883, Duyclo, nhà bác học Pháp đề nguyên tắc phân loại enzyme theo chất (substrate) chúng biến đổi thêm tận "ase" vào Ví dụ enzyme phân giải tinh bột (amilun) amylase Tuy vậy, thực tế tồn nhiều ngoại lệ thuật ngữ, ví dụ tên gọi enzyme pepsin, trypsin, catalase trước dùng 11 Ở thời kỳ này, dựa vào thành tựu hóa học, đặc biệt hóa lý hóa keo, nhà khoa học hướng vào việc nghiên cứu tính chất hóa lý học enzyme hoàn thiện phương pháp làm khiết enzyme Giai đoạn quan trọng thời kỳ cơng trình nhà bác học vĩ đại người Đức E Fisher Ông đặt móng cho khái niệm đại tính đặc hiệu enzyme, tương tác khơng gian enzyme chất Giả thuyết tiếng ông enzyme chất kết hợp với "ổ khóa với chìa khóa" Rồi nghiên cứu Bach Palladin enzyme ôxy hóa khử tạo nên sở cho việc xây dựng học thuyết ơxy hóa khử sinh học Trong thời gian người ta phát tính tác dụng thuận nghịch enzyme (Đanilepski, 1894), coenzyme phát (Harden Young, 1906) Họ người khám phá rằng, dịch chiết tế bào nấm men chứa hai loại chất cần thiết cho trình lên men "zymase" "cozymase" Họ nhận thấy dịch chiết tế bào nấm men hoạt tính xúc tác bị thẩm tích bị đun lên đến 50 oC Nhưng dịch chiết bị thẩm tích khơng hoạt động hoạt động trộn với dịch bị đun nóng khơng hoạt động Như hoạt độ phụ thuộc vào có mặt hai loại chất: thành phần không bền với nhiệt (heat - labile); khơng thẩm tích (được gọi zymase) phân đoạn bền với nhiệt (heat - stable), thẩm tích (được gọi cozymase) Ngày biết "zymase" bao gồm tất enzyme, "cozymase" bao gồm ion kim loại, ATP, ADP coenzyme NAD+ Thời gian người ta hiểu biết tác dụng kìm hãm hoạt hóa số enzyme (Sorensen 1909) Vào đầu kỷ XX, phát sinh sở động học tác động enzyme dựa vào nghiên cứu nhà bác học Anh Brown nhà bác học Pháp Henri Đến năm 1913, Michaelis Menten phát triển công trình nêu lên thuyết động học xúc tác enzyme Sau đại chiến giới lần thứ nhà bác học tiếng người Đức Willstatter có nhiều cống hiến việc tìm hiểu chất hóa học enzyme Đó cơng trình khoa học năm ông cộng (1922) nhằm làm khiết enzyme phương pháp hấp thụ chọn lọc Qua từ nhận xét thấy giai đoạn cuối trình làm khiết enzyme, thường bị chất chưa biết do, enzyme bị tính xúc tác, cho phép Willstatter nêu lên lần giả thuyết enzyme hai cấu tử (enzyme hai thành phần) Nhóm hoạt động (coenzyme, coferment, agon) có khả xúc tác kết hợp với 12 phần protein đặc hiệu (apoferment, apoenzyme, feron = protein) xác định đặc tính enzyme đóng vai trị chủ đạo việc thể tác dụng xúc tác enzyme Willstatter coi feron (protein) chất trơ chả có tác dụng Agon chất hấp phụ chất Và vào năm 1926, dịp thuyết trình, ơng cho enzyme khơng thuộc hợp chất biết, tức enzyme protein, glucid, mà chúng "chất đặc biệt" Đó quan niệm sai lầm Willstatter Ơng người tìm nhiều phương pháp làm enzyme làm sáng tỏ nhiều tính chất đặc hiệu enzyme Nhưng mục đích làm sáng tỏ chất hóa học enzyme thi ông lại không đạt Ngày người ta quan niệm enzyme hai thành phần phần coenzyme quy định kiểu phản ứng chịu trách nhiệm làm bền Cịn apoenzyme quy định tính đặc hiệu enzyme tăng hiệu suất xúc tác Coenzyme + apoenzyme = (holo) enzyme = (enzyme hoàn chỉnh) Coferment + apoferment = (holo) ferment Coenzyme dùng để phần protein enzyme trường hợp dễ tách khỏi phần apoenzyme cho thẩm tích qua màng bán thấm tồn độc lập Phần protein enzyme gọi nhóm ngoại hay nhóm "prostetic" liên kết chặt chẽ với phần protein enzyme 1.2.4 Giai đoạn Bản chất hóa học enzyme xác định đắn từ sau kết tinh enzyme Năm 1926 nhà hóa sinh Mỹ trẻ tuổi Sumner (39 tuổi) thành công việc chứng minh protein kết tinh từ hạt đậu tương chất giống enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân urê Đây enzyme kết tinh Bốn năm sau (1930) Mỹ Northrop tách pepsin dạng tinh thể, vào năm 1931 Northrop Kunitz tách trypsin dạng tinh thể Trong thời kỳ J.B.S Hardane viết "Enzymes" Mặc dù lúc chất phân tử Enzyme cịn bí mật, tác giả đưa dự đốn tuyệt vời vai trị tương tác liên kết yếu enzyme chất chế hoạt động enzyme Điều giữ nguyên tính thời thời đại 13 Các cơng trình Sumner Northrop mở chương lịch sử phát triển enzyme học đại Những kết đạt cho phép xác định cách dứt khốt chất hóa học enzyme protein Phải nói chất hóa học phần lớn enzyme protein định nghĩa có tính chất kinh điển Enzyme phải xem lại từ sau phát T R Cech năm 1981 Cech phát RNA có hoạt tính xúc tác enzyme gọi ribozyme (xuất phát từ tên ribose enzyme) Ribozyme xúc tác cho q trình chuyển hóa tiền chất RNA thông tin (pre - m RNA) thành m-RNA Do enzyme khơng thiết phải protein! Đây phát minh có ý nghĩa lớn Tác giả phát minh giải Nobel năm 1989 Cho đến khoảng 100 ribozyme biết Có thể nói rằng, cơng trình nói mở cho giai đoạn thứ tư lịch sử phát triển enzyme học kéo dài Từ kỷ thứ XX, thời gian gần enzyme học phát triển mạnh Nhờ ứng dụng phương pháp mới, đại như: điện di, sắc ký, quang phổ, đồng vị phóng xạ cho phép nghiên cứu cấu trúc chế tác dụng nhiều enzyme, chế trình sinh tổng hợp enzyme điều hịa hoạt động enzyme tế bào Người ta xác định cấu tạo coenzyme Đã xác định mối liên hệ enzyme vitamin (nhiều vitamin thành phần cấu tạo coenzyme phần lớn vitamin tan nước thành phần cấu tạo coenzyme) Người ta xác định enzyme xúc tác cho trình trao đổi chất như: hệ thống enzyme đường phân, Embden Meyerhof - Parnas năm 1933, hệ thống enzyme chu trình Kreps Szent Gyorgy năm 1937 (chu trình citric acid), chu trình ornithrin trao đổi chất protein năm 1932 (Krebs - Henseleit) Nhờ phương pháp việc tách làm enzyme, người ta xác định vai trò quan trọng kim loại xúc tác enzyme tác dụng hoạt hóa chúng Đã xác định phân bố enzyme tế bào Đã nghiên cứu chế tác dụng cấu tạo protein enzyme Bằng phương pháp Rhengen, người ta nghiên cứu cấu trúc của phân tử enzyme, cấu trúc ribonuclease (1960, Stein) Trong vòng 40 năm trở lại nghiên cứu enzyme sinh tổng hợp nucleotide phosphorylase (Greenberg Marago, 1955), DNA - polymesase ( Kornberg,1956), RNA - polymesase (Spieglman, Hurwist, ... enzyme: tính chất động học enzyme 3) Tính chất sinh học enzyme Đó phân bố enzyme tế bào, sinh tổng hợp protein enzyme ảnh hưởng thiếu hụt enzyme thể sống Ngoài cần ý đến ,mối liên hệ enzyme nghiên. .. nghiên cứu enzyme sở để phát triển nghiên cứu ứng dụng enzyme thực tế Trong chục năm cuối kỷ XX đầu thé kỷ XXI, người ta ý nghiên cứu việc ứng dụng enzyme Người ta tận dụng nguyên liệu giàu enzyme. .. suất xúc tác Coenzyme + apoenzyme = (holo) enzyme = (enzyme hoàn chỉnh) Coferment + apoferment = (holo) ferment Coenzyme dùng để phần protein enzyme trường hợp dễ tách khỏi phần apoenzyme cho thẩm