Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm AH5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2019 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học PGS TS Chu Hồng Hà Viện Cơng nghệ sinh học Hà Nội, 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 kỹ thuật di truyền ngƣợc” cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận án trung thực, phần đƣợc tác giả công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Tôi xin chịu trách nhiệm tính xác trung thực luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Thu Hằng i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Trung Nam PGS.TS Chu Hoàng Hà - ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, cán Phòng Quản lý tổng hợp, phận Quản lý đào tạo Sau đại học Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Cơng nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi Với lòng tri ân biết ơn, xin cảm ơn Dr Robert G Webster, Dr Richard J Webby (St Jude Children's Research Hospital) cung cấp plasmid pHW2000 Luận án đƣợc thực kinh phí đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu tạo giống gốc để sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1” 2016 - 2018 (Mã số SPQG.05b.03) Trong thời gian thực đề tài, nhận đƣợc giúp đỡ tận tình ThS Lê Hùng Chí, TS Hồng Thị Thu Hằng tập thể cán Phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật PTN trọng điểm Công nghệ gen, Viê ̣n Công nghệ Sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện CNSH Lâm nghiệp, đồng nghiệp cơng tác Trƣờng Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn tới thành viên đại gia đình thân u tơi Nhờ động viên, khích lệ, đồng hành chia sẻ khó khăn ngƣời thân gia đình mà tơi ln có tâm nghị lực cao trình nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Hằng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG BIỂU xi DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ xiii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan virus cúm A/H5N 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Danh pháp 1.1.3 Hình thái cấu trúc 1.1.4 Chu trình nhân lên 13 1.1.5 Tiến hóa virus 15 1.1.6 Độc lực virus 18 1.2 Tình hình dịch bệnh di truyền clade virus cúm A/H5N1 19 1.2.1 Tình hình dịch cúm A/H5N1 độc lực cao 19 1.2.2 Di truyền clade virus cúm A/H5N1 20 1.3 Vaccine phòng chống cúm A/H5N1 23 1.3.1 Phân loại vaccine cúm A/H5N1 23 1.3.2 Nguyên tắc phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 25 1.3.3 Thành tựu nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1 26 iii 1.4 Áp dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc nghiên cứu tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A 30 1.4.1 Nguyên lý kỹ thuật 30 1.4.2 Lịch sử nghiên cứu 31 1.4.3 Các bƣớc trình phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A di truyền ngƣợc 34 1.4.4 Ƣu điểm việc ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc phát triển chủng virus vacine cúm A 35 1.5 Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm A 36 1.5.1 Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm vô hoạt 37 1.5.2 Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm sống giảm độc lực 38 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39 2.1.1 Chủng virus, vi sinh vật, plasmid, tế bào số vật liệu khác 39 2.1.2 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 40 2.1.3 Hóa chất thiết bị 42 2.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 43 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 44 2.2.1 Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 44 2.2.2 Thiết kế gen kháng nguyên HA NA virus cúm A/H5N1 clade 1.1 2.3.2.1c… 47 2.2.3 Khuếch đại chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang phân đoạn gen đích 49 2.2.4 Ghép nối phân đoạn gen virus cúm vào plasmid pHW2000 tạo hệ thống plasmid đơn gen 51 2.2.5 Hoạt hóa ni cấy tế bào 293T MDCK 52 iv 2.2.6 Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c 54 2.2.7 Nhân giống virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trứng gà có phơi 56 2.2.8 Phân lập bảo quản chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c 59 2.2.9 Ni cấy thích nghi chủng virus trứng gà có phơi xác định tính ổn định di truyền virus 60 2.2.10 Tạo vaccine phịng thí nghiệm từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c 61 2.2.11 Xác định khả kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu gà virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c 62 2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 63 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64 3.1 Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào plasmid pHW2000 64 3.1.1 Tách chiết RNA tổng số chủng NIBRG-14 mang sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 64 3.1.2 Khuếch đại, xác định trình tự chọn dịng sáu phân đoạn gen khung 64 3.1.3 Ghép nối sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 72 3.2 Thiết kế tách dòng gen HA virus cúm A/H5N1 clade 1.1 clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 79 3.2.1 Thiết kế gen kháng nguyên HA 79 3.2.2 Khuếch đại gen HA 82 3.2.3 Tạo dòng plasmid pHW2000 mang gen HA … 83 v 3.3 Thiết kế tách dòng gen NA virus cúm A/H5N1 clade 1.1 clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 … 84 3.3.1 Thiết kế gen kháng nguyên NA 84 3.3.2 Khuếch đại gen NA 87 3.3.3 Dịng hóa gen NA vào plasmid pHW2000 88 3.4 Tạo chủng virus tái tổ hợp di truyền ngƣợc 89 3.4.1 Tách chiết DNA plasmid nuôi cấy tế bào 293T 89 3.4.2 Tối ƣu điều kiện chuyển nhiễm cho tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1clade 2.3.2.1c tế bào 293T 92 3.4.3 Kết tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1clade 2.3.2.1c di truyền ngƣợc 95 3.5 Nhân giống virus trứng gà có phơi 98 3.6 Phân lập kiểm tra tính ổn định di truyền chủng virus………… 104 3.7 Sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm qui mô phịng thí nghiệm xác định khả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch vaccine 108 CHƢƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ 114 4.1 Ƣu điểm hệ thống plasmid pHW2000 di truyền ngƣợc tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A 114 4.2 Vai trò sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 việc nâng cao hiệu suất nhân giống chủng virus ứng viên vaccine cúm A 117 4.3 Tổng hợp nhân tạo phân đoạn gen HA mã hóa protein khơng chứa amino acid kiềm độc 120 vi 4.4 Ảnh hƣởng loại tế bào biến nạp đến tái tạo virus cúm A tái tổ hợp 123 4.5 Khả thích ứng nhân lên virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trứng gà có phơi tính ổn định di truyền gen kháng nguyên virus 125 4.6 Khả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c gia cầm 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 128 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 129 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO 135 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Chữ viết đầy đủ (tiếng Anh) Nghĩa tiếng Việt ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng Giống chuẩn Hoa kỳ CPE Cytopathic Effect cRNA Complementary Ribonucleic Acid Axit ribonucleic bổ sung DNA Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleic Acid EID50 50% Eggs Infectious Dose FAO Food and Agriculture Organization FBS Fetal Bovine Serum FDA Food and Drug Administration Gal Galactose Galactose GMT Geometric Mean Titer Giá trị HI trung bình hình học HA Hemagglutinin Hemagglutinin HAU Hemagglutinin unit Đơn vị Hemagglutinin HI Hemagglutination Inhibition Ức chế ngƣng kết hồng cầu HPAI High Pathogenic Avian Influenza Virus cúm độc lực cao IIV Inactivated Influenza Vaccine Vaccine cúm bất hoạt tắt Hiệu ứng cytopathic (hiệu ứng hủy hoại tế bào) Liều lƣợng virus lây nhiễm 50% trứng Tổ chức Nông lƣơng Liên Hiệp Quốc Huyết bào thai bê Cơ quan Quản lý Thực phẩm Thuốc Hoa Kỳ viii 10-6 8/8 100 10-7 3/5 60 10-8 2/4 50 10-9 0/7 Tính tốn theo cơng thức Reed-Muench, hiệu giá EID50 chủng virus ứng viên rg-A/H5N1 clade 1.1 x 107 EID50/0,1 ml hay x 108 EID50/1 ml Kết xác định hiệu giá EID50 chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Nồng độ pha lỗng virus Số trứng có HA ≥ 1: 160 Tỷ lệ trứng có HA ≥ 1: 160 10-3 23/23 100 10 -4 17/17 100 10 -5 13/13 100 10-6 9/9 100 10-7 5/6 83 10-8 2/7 28 10-9 0/9 Tính tốn theo cơng thức Reed-Muench, hiệu giá EID50 chủng virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c x 107,6 EID50/0,1 ml hay x 108,6 EID50/1 ml PHỤ LỤC 05 PHƢƠNG PHÁP BIẾN NẠP PLASMID TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO KHẢ BIẾN E COLI DH5α Phƣơng pháp dựa phƣơng pháp biến nạp sốc nhiệt Cohen năm 1972 Tế bào sử dụng tế bào E coli DH5α đƣợc xử lý làm cho thành tế bào mỏng đi, yếu tạo điều kiện cho plasmid dễ chui vào nguyên sinh chất cách dễ dàng nhiệt độ đột ngột thay đổi Plasmid nguyên sinh chất nhân lên tế bào chủ đƣợc ni mơi trƣờng thích hợp - Lấy tế bào khả biến từ tủ -80ºC để tan từ từ đá 10 – 15 phút - Lấy 5µl sản phẩm phản ứng ghép nối gen đích vào plasmid bổ sung vào 50µl tế bào khả biến, để đá 10 phút ủ 42oC 90 giây sau đặt vào đá 10 phút - Bổ sung 300µl mơi trƣờng LB lỏng để nuôi phục hồi tế bào - Sử dụng que cấy trải, trải dịch khuẩn lên đĩa mơi trƣờng LB đặc có bổ sung 100 mg/l Cabemycine, 0,001% X- gal, 100µM IPTG Ủ đĩa 37ºC 16h PHỤ LỤC 06 PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA PLASMID TÁI TỔ HỢP BẰNG KIT HIGH PURE PLASMID ISOLATION Sử dụng kit High Pure Plasmid Isolation (Roche, Đức) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất, gồm bƣớc: - Hút ml dịch khuẩn E coli DH5α nuôi qua đêm môi trƣờng LB lỏng vào ống eppendorf ml, ly tâm 6000 vòng/ phút phút để thu tế bào - Hút 250 µl Suspension Buffer có bổ sung RNase, trộn pipet - Bổ sung 250 µl Lysis Buffer, đảo nhẹ ủ 15-25ºC phút Không để phản ứng phân giải phút - Bổ sung 350 µl Binding Buffer (đã đƣợc để đá lạnh), đảo nhẹ, sau để vào đá phút - Ly tâm 12000 vòng/ phút 15 phút Hút dịch vào cột Fitter - Ly tâm 13000 vòng/ phút phút, loại bỏ dịch chảy qua cột - Rửa cột bằng cách bổ sung 500 µl dung dịch Washing Buffer I ly tâm 13000 vòng/ phút phút Loại bỏ dịch chảy qua cột - Tiếp tục bổ sung 700 µl dung dịch Washing Buffer II, ly tâm 13000 vòng/ phút phút Loại bỏ dịch chảy qua cột ly tâm bổ sung 13000 vòng/ phút phút để loại bỏ hết Buffer rửa - Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml Hòa tan DNA cách bổ sung 40 µl dH2O, ly tâm 13000 vòng/ phút phút - Đo nanodrop điện di gel agrarose 1% để kiểm tra nồng độ độ tinh plasmid thu đƣợc PHỤ LỤC 07 CÁC PHẢN ỨNG CẮT PLASMID TÁI TỔ HỢP BẰNG ENZYME GIỚI HẠN Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp BsmBI STT Thành phần Thể tích (µl) H2O 6,5 10x Buffer Tango Plasmid (30 ng/µl) 10 DTT 20mM BsmBI (1U/µl) 0,5 Tổng thể tích 20 Bổ sung lần lƣợt thành phần phản ứng cắt vào ống eppendorf 0,5ml, trộn đều, ủ ở 37ºC - Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp BsaI STT Thành phần Thể tích (µl) H2O 10x Buffer G Plasmid (30 ng/µl) 10 BsaI (1U/µl) 0,5 Tổng thể tích 6,5 20 Bổ sung lần lƣợt thành phần phản ứng cắt vào ống eppendorf 0,5ml, trộn đều, ủ ở 37ºC - Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp SacI STT Thành phần Thể tích (µl) H2O 10X Buffer SacI Plasmid (30 ng/µl) 10 SacI (1U/µl) 0,5 Tổng thể tích 6,5 20 Bổ sung lần lƣợt thành phần phản ứng cắt vào ống eppendorf 0,5ml, trộn đều, ủ ở 37ºC - Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp cặp enzyme NheI + SmaI STT Thành phần Thể tích (µl) H2O 10X Buffer Tango Plasmid (30 ng/µl) 14 NheI (1U/µl) 0,5 Bổ sung thành phần phản ứng cắt vào ống eppendorf 0,5ml, trộn đều, ủ ở 37ºC - SmaI (1U/µl) 0,5 Bổ sung SmaI vào phản ứng, trộn ủ 30ºC Tổng thể tích 20 PHỤ LỤC 08 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO 293T VÀ MDCK BẰNG BUỒNG ĐẾM TẾ BÀO Một buồng đếm tế bào đƣợc chia làm hai khu vực: A B, đƣợc sử dụng cho lần đếm tế bào riêng biệt nhƣ hình sau: Buồng đếm tế bào đƣợc chia thành mạng lƣới gồm hình vng nhỏ bên nhìn dƣới kính hiển vi, hình vng có diện tích mm2 Mỗi hình vng lớn có diện tích bề mặt 1,0 mm2, độ dày buồng đếm 0.1 mm, thể tích hình vng 0,0001 ml nhƣ hình dƣới đây: Những tế bào có kích thƣớc lớn đƣợc đếm hình vng lớn bốn góc buồng đếm tế bào Trong đó, dịch ni cấy tế bào có mật độ tế bào cao kích thƣớc tế bào nhỏ đƣợc đếm hình vng 1/25 mm2 hình vng trung tâm Cơng thức tính số lƣợng tế bào: Số lƣợng tế bào/ml = Lƣợng tế bào trung bình vng x độ pha lỗng PHỤ LỤC 09 CHUẨN BỊ HỒNG CẦU GÀ 0,5% LÀM NGUYÊN VẬT LIỆU ĐỂ THỰC HIỆN THÍ NGHIỆM XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ HA VÀ HIỆU GIÁ HI Chuẩn bị loại dung dịch: - Dung dịch PBS (0,01 M, pH 7,2): + Chuẩn bị 100ml dung dịch stock PBS 25X: Cân 2,74 g Na2HPO4 + 0,79 g NaH2PO4 H2O, dẫn H2O đến 100 ml + Cân 8,5 g NaCl, hòa tan 40 ml dung dịch stock PBS 25X dẫn H2O đến thể tích lít đƣợc dung dịch PBS 0,01 M + Điều chỉnh pH dung dịch PBS 0,01 M đến pH 7,2 dung dịch NaOH 1N HCl 1N + Khử trùng dung dịch PBS (0,01 M, pH 7,2) lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ lọc 0,22 µm + Bảo quản dung dịch PBS (0,01 M, pH 7,2) 4ºC không tuần trình sử dụng - Dung dịch Alsever (chống đơng máu): + Chuẩn bị lít dung dịch gồm chất: 20,5 g dextrose + g sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7 2H2O) + 4,2 NaCl + 0,55 g citric acid (C6H8O7) Trộn để hòa tan chất + Điều chỉnh pH dung dịch 6,1 ± 0,1 NaOH 1N HCl 1N + Khử trùng dung dịch lọc dung dịch qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,22 µm Lấy máu gà trố ng trƣởng thành , khỏe ma ̣nh, chƣa tiêm phòng vaccine cúm A/H5N1: Sát trùng vị trí lấy máu (tĩnh mạch cánh hoă ̣c tim ) bằ ng cồ n 70% Dùng bơm tiêm ch ứa sẵn dung dịch chống đông Alsever hút thể tích tƣơng đƣơng máu gà vị trí tĩnh mạch Bơm máu đƣợc chống đơng vào ống ly tâm 50 ml Rƣ̉a hồ ng cầ u : Ly tâm dung dịch máu chống đơng 1200 vịng/phút 10 phút Loại bỏ huyết tƣơng B (NaCl 0,85%) vào ống lấy máu , mô ̣t lƣơ ̣ng gấ p đôi lƣơ ̣ng máu ố ng, lắ c đề u Ly tâm 1200 vòng/phút phút để loại bỏ đệm PBS pha thu nhận hồng cầu đáy ống ly tâm Lặp lại lần bƣớc rửa hồng cầu đệm PBS Pha lỗng hờ ng cầ u đến nồng độ 0,5% Ví dụ: 0,5 ml hờ ng cầ u và 99,5 ml đệm PBS pH 7,2 (Dung dịch hồng cầu bảo quản nhiệt độ từ 4ºC đế n 8ºC mô ̣t tuầ n) PHỤ LỤC 10 XÁC ĐỊNH LOẠI HĨA CHẤT THÍCH HỢP CHO CHUYỂN NHIỄM HỆ THỐNG + PLASMID ĐƠN GEN VÀO TẾ BÀO 293T Chuyển nhiễm Lipofectamine-2000 - Pha loãng Lipofectamine-2000 Opti-MEM I để chuẩn bị dung dịch Lipo-OM theo công thức: 22 l Lipofectamine-2000 440 l thể tích cuối hỗn hợp Lipo-OM Ủ hỗn hợp nhiệt độ phòng phút - Bổ sung 440 l hỗn hợp Lipo-OM vào 440 l hỗn hợp DNA Plasmid-OM, trộn hỗn hợp ủ nhiệt độ phòng 30 phút - Loại bỏ dịch nuôi cấy đĩa tế bào giếng, bổ sung 880 l hỗn hợp LipoOM từ từ vào đĩa giếng Khẽ lắc nhẹ để trộn hỗn hợp ủ đĩa nhiệt độ phòng 60 phút thí nghiệm tối ƣu loại hóa chất chuyển nhiễm; ủ khoảng thời gian khác (10 phút, 20 phút, 30 phút 60 phút) thí nghiệm tối ƣu thời gian ủ; ủ 30 phút thí nghiệm tối ƣu nồng độ plasmid Chuyển nhiễm TransIT-LT - TransIT-LT đƣợc giữ nhiệt độ phòng 10 phút để hoà tan thành phần - Bổ sung 18-20 l TransIT-LT vào hỗn hợp DNA-OM, ủ nhiệt độ phòng 30 phút - Loại bỏ dịch nuôi cấy đĩa tế bào giếng, bổ sung 800 l OM vào 200 l hỗn hợp DNA-LT, trộn hỗn hợp chuyển nhiễm từ từ vào đĩa nuôi cấy - Ủ đĩa tế bào 293T lây nhiễm virus tủ ấm 37C, 5% CO2 - Loại bỏ dịch nuôi cấy, bổ sung 1,4 ml môi trƣờng nuôi cấy virus (OptiMEM I với 0,3% BSA) Tại thời điểm đƣợc tính mốc thời gian 0h sau chuyển nhiễm (hpt-hour post transfection) - Tiếp tục ủ đĩa tế bào 293T chuyển nhiễm plasmid 37C, 5% CO2 48h - Thu nhận dịch nuôi cấy tế bào có khả chứa virus tái tổ hợp, cấy truyền vào trứng gà có phơi - 11 ngày tuổi, ủ trứng 35ºC, 5% CO2 36h, thu hoạch dịch niệu để xác định hiệu giá HA virus PHỤ LỤC 11 VÔ HOẠT VIRUS VÀ SẢN XUẤT VACCINE CÚM A/H5N1 TỪ CHỦNG rgA/H5N1 clade 1.1 VÀ rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c DÙNG CHO GIA CẦM Vô hoạt virus Phƣơng pháp vô hoạt virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c để sản xuất vaccine cúm A.H5N1 dùng cho gia cầm đƣợc thực theo hƣớng dẫn WHO - Thu nhận dịch niệu trứng chứa virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1/rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c - Loại bỏ cặn thô li tâm 6000v/phút 10 phút - Kiểm tra hiệu giá HA virus dịch niệu pha loãng để đồng hiệu giá HA mẫu dịch niệu đến HA = 1: 1024 - Vô hoạt virus: Bổ sung formalin (37% formaldehyde) vào dung dịch virus để có nồng độ cuối 1/2000 (1 ml dung dịch 37% formaldehyde cho lít dịch virus) Điều kiện vô hoạt nhiệt độ 4oC có khuấy nhẹ thời gian ngày - Kiểm tra vô hoạt: Bƣớc kiểm tra nhằm đảm bảo chắn khơng cịn virus sống dung dịch virus sau bất hoạt Tiến hành: Lấy mẫu dịch virus vơ hoạt, trung hồ formaline mẫu dung dịch 8,8% NaHSO3 (5 µl cho 1ml vaccine vơ hoạt) Sau trung hoà, cấy 0,2 ml dung dịch virus nồng độ khơng pha lỗng, pha lỗng 10-1 lần 102 lần vào khoang niệu trứng gà có phôi 11 ngày tuổi, nồng độ virus cấy 10 trứng Ủ trứng 33oC ngày Sau ủ, phải có 8/10 trứng cịn sống tƣơng ứng với nồng độ virus Thu hoạch 0,5 ml dịch niệu từ trứng sống hòa trộn tƣơng ứng với nồng độ virus Tiếp tục cấy 0,2 ml dịch niệu trứng tƣơng ứng với nồng độ virus vào 10 trứng có phơi (30 trứng cho nồng độ gốc), 0,2 ml từ dung dịch trộn chung (khơng pha lỗng) Ủ trứng 33oC ngày Thu hoạch riêng rẽ dịch niệu trứng xác định hiệu giá gây ngƣng kết hồng cầu (hiệu giá HA) Kết kiểm tra phải không phát thấy phản ứng gây ngƣng kết hồng cầu tất trứng trứng đƣợc vơ hoạt hồn tồn Tạo vaccine vô hoạt nhũ dầu Trộn kháng nguyên virus vô hoạt với dầu Montanide với tỷ lệ 1/1 Dùng máy nhũ dầu chuyên dụng tạo dạng nhũ dầu vaccine PHỤ LỤC 12 KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA VI SINH VẬT NGOẠI LAI TRONG DỊCH NIỆU TRỨNG VÀ CHẾ PHẨM VACCINE ĐÃ TẠO RA TRONG PHÕNG THÍ NGHIỆM Chuẩn bị môi trƣờng kiểm tra vi sinh vật ngoại lai Mơi trƣờng kiểm tra TT có mặt vi sinh Thành phần vật ngoại lai thuộc Hàm lƣợng (g/L) pH nhóm Vi khuẩn hiếu khí Cao thịt bị (Beef extract) 10 (mơi trƣờng thạch- Yeast extract thịt-dịch chiết nấm NaCl men) Agar 15 Peptone Glucose 10 MgSO4 Sodium thioglycollate 0,5 L-Cystine 0,5 NaCl 2,5 Glucose 40 (môi trƣờng Peptone 10 Sabauroud) Agar 15 Vi khuẩn kỵ khí Nấm mốc, nấm men 7,0 – 7,2 7,0 – 7,2 5,6 – 5,8 Ghi chú: Mơi trƣờng kiểm tra có mặt vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc nấm men phân phối vào đĩa petri Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí phân phối vào ống nghiệm, sau cấy vật liệu cần kiểm tra có mặt vi khuẩn kỵ khí vào mơi trƣờng tráng bề mặt mơi trƣờng lớp agar lỏng (45ºC) lên bề mặt mơi trƣờng Kiểm tra có mặt vi sinh vật ngoại lai Sự có mặt vi sinh vật ngoại lai dịch niệu trứng chứa virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c hệ P1 tƣơng ứng với mẫu virus đƣợc gộp lại để cấy truyền lên môi trƣờng kiểm tra vi sinh vật ngoại lai (vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí, nấm) chuẩn bị Bên cạnh đó, hai chế phẩm vaccine từ hai chủng virus ứng viên tƣơng ứng với hai clade virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp (clade 1.1 clade 2.3.2.1c) đƣợc xác định có mặt vi sinh vật ngoại lai Bố trí cơng thức mơi trƣờng đối chứng cấy nƣớc cất vô trùng - Đặt đĩa petri chứa môi trƣờng kiểm tra vi khuẩn hiếu khí ống nghiệm chứa mơi trƣờng kiểm tra vi khuẩn kỵ khí vào tủ ấm 37ºC; môi trƣờng kiểm tra nấm đặt 25ºC - Xác định kết quả: Dịch niệu trứng chế phẩm vaccine làm đảm bảo độ voo trùng đĩa/ống nghiệm cấy mẫu không xuất vi sinh vật ngoại lai Kết kiểm tra có mặt vi sinh vật ngoại lai mẫu dịch niệu trứng hệ P1 virus rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Mẫu Ký hiệu mẫu virus Xác định có mặt loại vi sinh vật ngoại lai Vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn kỵ khí Nấm - - - P1.1.1 - - - P1.1.2 - - - P1.1.3 - - - Dịch niệu trứng P1.2.1 - - - chứa virus rg- P1.2.2 - - - A/H5N1 clade 1.1 P1.2.3 - - - P1.3.1 - - - P1.3.2 - - - P1.3.3 - - - Đối chứng (cấy nƣớc vô trùng) Dịch niệu trứng chứa virus rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c P1.1.1 - - - P1.1.2 - - - P1.1.3 - - - P1.2.1 - - - P1.2.2 - - - P1.2.3 - - - P1.3.1 - - - P1.3.2 - - - P1.3.3 - - - Ghi chú: (-) không xuất vi sinh vật ngoại lai Kết kiểm tra có mặt vi sinh vật ngoại lai vaccine đƣợc sản xuất từ hai chủng ứng viên rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Mẫu Đối chứng (cấy nƣớc vô trùng) Vaccine từ virus rgA/H5N1 clade 1.1 Vaccine từ virus rgA/H5N1 clade 1.1 Xác định có mặt loại vi sinh vật ngoại lai Vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn kỵ khí Nấm - - - - - - - - - Ghi chú: (-) không xuất vi sinh vật ngoại lai ... ? ?Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 kỹ thuật di truyền ngược? ?? Mục tiêu nghiên cứu Tạo đƣợc chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng. .. Luận án ? ?Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 kỹ thuật di truyền ngƣợc” cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết nghiên cứu đƣợc... CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN