Nhân nhanh cây bìm bịp (clinacanthus nutans (burm f ) lindau, 1894) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô​

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN *** PHÙNG THỊ THANH HẰNG NHÂN NHANH CÂY BÌM BỊP (CLINACANTHUS NUTANS (BURM F.) LINDAU, 1894) BẰNG KĨ THUẬT NI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Hà Nội, tháng 05 năm 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN *** PHÙNG THỊ THANH HẰNG NHÂN NHANH CÂY BÌM BỊP (CLINACANTHUS NUTANS (BURM F.) LINDAU, 1894) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chun ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học: TS LA VIỆT HỒNG Hà Nội, tháng 05 năm 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS La Việt Hồng tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Phịng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình làm thực nghiệm hồn thành khóa luận Vì chưa có nhiều hội tham gia nghiên cứu khoa học nên tơi cịn nhiều bỡ ngỡ kinh nghiệm cịn nhiều hạn chế khơng tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận góp ý, xây dựng thầy bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệp tơi hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên PHÙNG THỊ THANH HẰNG LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài tơi thực Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận hồn tồn trung thực khơng trùng lặp với kết công bố Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên PHÙNG THỊ THANH HẰNG MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích đề tài: Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Bìm bịp 1.1.1 Phân loại phân bố 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Giá trị dược liệu 1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 11 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2 Vật liệu, dụng cụ thiết bị nghiên cứu 11 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 11 2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 11 2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 11 2.3 Môi trường nuôi cấy 11 2.4 Điều kiện nuôi cấy 11 2.5 Phương pháp nghiên cứu 12 2.5.1.Tạo vật liệu khởi đầu 12 2.5.2 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro 13 2.5.3 Tạo in vitro hoàn chỉnh 14 2.5.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Hoàn thiện giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu 19 3.2 Hoàn thiện giai đoạn tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp 20 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro) 20 3.2.2 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro) 22 3.3 Hoàn thiện giai đoạn rễ - tạo in vitro hoàn chỉnh 25 3.4 Hoàn thiện giai đoạn Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzyl amino purin Ca(OCl)2 Calcium hypochlorite HgCl2 Mercuric chloride H2O2 Hydro peroxid IAA Acid β – indol axetic IBA Indol butyric acid KTNN Kĩ Thuật Nông Nghiệp LSD0,05 Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 0,05 MS Murashige Skoog NAA NaClO -napthalene axetic acid Natri hypochlorite DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các công thức tạo vật liệu khởi đầu mẫu Bìm bịp 12 Bảng 2.2 Các cơng thức thí nghiệm ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro 13 Bảng 2.3 Các cơng thức thí nghiệm ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro 14 Bảng 2.4 Các cơng thức thí nghiệm tạo in vitro hồn chỉnh 15 Bảng 2.5 Các cơng thức thí nghiệm rèn luyện in vitro 15 Bảng 3.1 Hiệu tạo vật liệu khởi đầu mẫu Bìm bịp 17 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP (Benzyl Adenin Purin) đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp (sau tuần nuôi cấy) 20 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp (sau tuần ni cấy) 23 Bảng 3.4 Ảnh hưởng IAA đến rễ Bìm bịp in vitro (sau tuần) 25 Bảng 3.5 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống sót Bìm bịp in vitro 27 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây Bìm bịp bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894) Hình 3.1: Quy trình tạo vật liệu khởi đầu giống Bìm bịp phương pháp in vitro 19 Hình 3.2: Mẫu Bìm bịp in vitro sau tháng ni cấy trên19 môi trường MS0 19 Hình 3.3: Chồi in vitro Bìm bịp sau tuần ni cấy mơi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng 22 Hình 3.4: Chồi in vitro Bìm bịp sau tuần ni cấy mơi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng 24 Hình 3.5: Rễ Bìm bịp in vitro sau tuần ni cấy 26 Hình 3.6: Cây Bìm bịp in vitro sau tuần đưa môi trường tự nhiên 28 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cây cỏ thảo dược từ lâu ln loại thuốc có nhiều cơng dụng tốt sử dụng rộng rãi y học cổ truyền với thuốc dân gian tác dụng lồi dược liệu Họ Ơ rô (Acanthaceae) họ lớn thực vật hai mầm Lớp thực vật có hoa, chứa khoảng 214 250 chi (tùy hệ thống phân loại) khoảng 500 – 000 lồi Ở Việt Nam có khoảng 55 chi, khoảng 195 lồi Cây Bìm bịp tùy theo địa phương gọi Mảnh cộng hay Xương khỉ có tên khoa học Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894 cỏ thảo dược lâu năm có nhiều cơng dụng y học [1, 2, 6] Đơng y cho rằng, mảnh cộng có vị ngọt, tính bình, có tác dụng mát gan, lợi đảm (tăng tiết mật), tiêu thũng (giảm phù nề), chống đau, hạ sốt, chống viêm, điều kinh, thân tươi giã nát đắp vết thương, cầm máu, bong gân, gãy xương kín,… Được sử dụng để hỗ trợ điều trị viêm gan vàng da, giảm tiết mật, đau nhức phong thấp, gãy xương Bộ phận dùng làm thuốc toàn thu hái quanh năm, dùng tươi phơi khô để dành [6] Nghiên cứu y học đại thành phần chiết xuất Bìm bịp hoạt động chất chống oxy hóa Tám hợp chất 132 – hydroxyl - (132 - S) - chlorophyll B, 132 – hydroxyl - (132 - R) - chlorophyll B, 132 –hydroxy - (132 - S) - phaeophytin B, 132 - hydroxy- (132 - R) phaeophytin B, 132 - hydroxy - (132 - S) - phaeophytin A, 132 – hydroxyl (132 - R) - phaeophytin A, purpurin 18 phytyl ester phaeophorbide A phát chiết xuất từ thân [14] Thí nghiệm dược lý chứng minh loại chiết xuất hợp chất tinh khiết từ loài thể loạt đặc tính sinh học chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa chống bệnh tiểu đường Cây Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894) nhỏ, mọc tự nhiên, nguồn giống chủ yếu nhân giống phương pháp giâm cành từ mẹ hay gieo hạt, nhiên tần số gia tăng chồi hình thành thấp qua thời gian giống bị thối hóa nhiễm bệnh từ CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro Trong giai đoạn kĩ thuật nhân giống in vitro giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu đóng vai trị vơ quan trọng, định đến thành công đề tài nghiên cứu Nhiệm vụ giai đoạn phải đưa nguồn mẫu từ bên ngồi mơi trường vào ni cấy điều kiện vô trùng để thực nghiên cứu Để loại bỏ vi khuẩn có mẫu ngồi mơi trường sử dụng nhiều loại chất khử trùng khác NaClO, Ca(OCl)2, H2O2, HgCl2, thí nghiệm này, chất khử trùng Javel (NaClO) sử dụng chất khử trùng có hiệu cao với chế độ khử trùng thích hợp Mẫu Bìm bịp sau thu xử lý sơ + Javel với nồng độ thời gian khử trùng khác Theo dõi tiêu mẫu nhiễm, mẫu sau 15 ngày ni cấy ta thu kết trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Hiệu tạo vật liệu khởi đầu mẫu Bìm bịp Cơng thức Nồng độ chất xử lí/ thời gian Tỷ lệ mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu chết (%) (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) CT1(ĐC) Xử lí sơ xà phịng, cồn nước cất 100,0 0,0 0,0 CT2 Cồn 70% phút , Javel 5% 10 phút 75,0 16,7 8,3 CT3 Cồn 70% phút, Javel 5% 15 phút 58,3 25,0 16,7 17 Công thức Nồng độ chất xử lí/ thời gian Tỷ lệ mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu chết (%) (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) CT4 Cồn 70% phút, Javel 10% 10 phút 29,6 23,1 47,3 CT5 Cồn 70% phút, Javel 10% 15 phút 25,0 50,0 25,0 CT6 Cồn 70% 10 phút, Javel 15% 10 phút 20,0 67,6 12,4 CT7 Cồn 70% 10 phút, Javel 15% 15 phút 8,5 86,9 4,6 Kết nghiên cứu cho thấy, công thức đối chứng xử lý sơ xà phịng cồn nước cất khơng thể gây chết vi khuẩn có mẫu nên mẫu nhiễm hoàn toàn Khi sử dụng chất khử trùng Javel, tỷ lệ mẫu tăng lên tỷ lệ mẫu nhiễm giảm Thời gian khử trùng ngắn nồng độ Javel thấp vi khuẩn, nấm cịn xót lại mẫu (CT2 - CT3) tỷ lệ mẫu sống thấp, mẫu nhiễm nhiều chưa đạt hiệu cao Ngược lại, thời gian khử trùng kéo dài Javel nồng độ cao tỷ lệ mẫu nhiễm lại làm tăng tỷ lệ mẫu bị chết mẫu bị tổn thương nhiều (CT5 - CT7) Ở CT4 (Cồn 70% phút, Javel 10% 10 phút) cho hiệu khử trùng cao đạt khoảng 47,3% Tồn mẫu sống ni cấy mơi trường MS0 sau chuyển sang tái sinh chồi 18 Hình 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu giống Bìm bịp từ đốt thân (a) Cành Bìm bịp thu ngồi thực địa (b) Xử lý mẫu hóa chất rửa lại với nước cất (c) Cắt mẫu thành đốt có chứa chồi nách (d) Nuôi cấy môi trường MS Hình 3.2 Mẫu Bìm bịp in vitro sau tháng nuôi cấy môi trường MS 19 3.2 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp Việc nhân chồi in vitro có vai trò quan trọng việc tạo lượng lớn in vitro làm nguyên liệu cho trình nhân giống Để có trạng thái sinh trưởng tốt cần phải xác định mơi trường có chứa chất điều hịa sinh trưởng nồng độ thích hợp Môi trường nhân nhanh chồi đa số thực vật thường chất điều hịa sinh trưởng nhóm cytokinin auxin Trong nghiên cứu này, BAP NAA sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy ngưỡng nồng độ khác nhằm tìm môi trường phù hợp cho kết cao 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp BAP chất điều hịa sinh trưởng nhóm xytokinin, chất thường sử dụng lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào giai đoạn tái sinh nhân nhanh chúng có vai trị thúc đẩy phân hóa chồi mẫu ni cấy, định số lượng chồi chất lượng chồi hình thành Việc xử lí BAP ảnh hưởng đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro (bảng 3.2) Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP (Benzyl Adenin Purin) đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ Công thức BAP Số Chiều cao Số lá/ mẫu Trạng thái chồi (mg/l) chồi/ mẫu chồi/ mẫu (cm) CT1(ĐC) 1,00d 2,37b 3,50b Chồi nhỏ - Lá xanh CT2 0,25 1,83c 2,79b 4,16b Chồi nhỏ - Lá xanh CT3 0,5 4,33a 3,66a 5,83a Chồi mập – Xanh 20 in vitro Nồng độ Công thức BAP Số Chiều cao chồi/ mẫu Số lá/ mẫu Trạng thái chồi (mg/l) chồi/ mẫu CT4 0,75 3,16b 1,87c 4,50b Chồi gầy – Lá vàng CT5 1,0 2,66b 1,45c 3,66b Kém – Lá vàng 0,76 0,44 1,01 LSD0,05 (cm) in vitro Trong cột kí tự theo sau khác a, b, c… thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP (0 - mg/l) lên khả tái sinh chồi in vitro Bìm bịp trình bày bảng 3.2 Cụ thể, công thức bổ sung BAP phát sinh chồi 100%, cịn cơng thức đối chứng chịu ức chế ưu đỉnh Trong đó, cơng thức mơi trường có bổ sung BAP nồng độ 0,5 mg/l cho ảnh hưởng tốt đến khả nhân chồi (bảng 3.2), số chồi đạt từ 4-5 chồi/mẫu, số từ 4-6 lá, chiều cao khoảng 3,5cm (hình 3.3b) Khi tăng nồng độ BAP lên 0,75 mg/l thu kết tốt số lượng chồi chồi gầy chồi nhỏ (hình 3.3c) Và nồng độ BAP tăng cao (1mg/l) số chồi hình thành giảm đi, kích thước chồi nhỏ, chồi vàng điều cho thấy nồng độ BAP cao ức chế đến hình thành chồi Kết tương đương với nghiên cứu Chen B cộng (2015) với hệ số nhân nhanh thu 3,9  0,06 nuôi cấy môi trường tối ưu MS với 1,0 mg/l BAP + 0,02 mg/l NAA 21 Hình 3.3 Chồi in vitro Bìm bịp sau tuần ni cấy mơi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng a) b) c) d) Mơi trường bổ sung BAP 0,25 mg/l Môi trường bổ sung BAP 0,5 mg/l Môi trường bổ sung BAP 0,75 mg/l Môi trường bổ sung BAP 1mg/l 3.2.2 Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp Chồi in vitro cấy lên mơi trường MS có bổ sung tổ hợp BAP (0 - 1mg/l) kết hợp với NAA nồng độ 0,05 mg/l để thăm dò khả tái sinh chồi in vitro NAA có độ bền vững hóa học cao, có tác dụng kích thích sinh trưởng mạnh [9] Dưới kết thu sau tuần nuôi cấy 22 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp (sau tuần nuôi cấy) Nồng độ Công thức Số chồi/ mẫu (mg/l) Chiều cao chồi Số chồi Trạng thái chồi in vitro 2,37c 3,50b Chồi nhỏ Lá xanh BAP NAA CT1(ĐC) 0 CT2 0,25 0,05 2,67c 3,50b 3,33b Chồi nhỏ Lá xanh CT3 0,5 0,05 4,16b 3,79b 3,67b Chồi mập Lá xanh CT4 0,75 0,05 5,83a 6,50a Chồi mập Lá xanh CT5 1,0 0,05 3,67b 2,54c 3,50b Chồi nhỏ Lá vàng 0,76 0,52 1,79 LSD0,05 1,00d 4,91a Trong cột kí tự theo sau khác a,b,c… thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05 23 Hình 3.4 Chồi in vitro Bìm bịp sau tuần ni cấy mơi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng a) Môi trường bổ sung BAP 0,25 mg/l + NAA 0,05 mg/l b) Môi trường bổ sung BAP 0,5 mg/l + NAA 0,05 mg/l c) Môi trường bổ sung BAP 0,75 mg/l + NAA 0,05 mg/l d) Môi trường bổ sung BAP 1mg/l + NAA 0,05 mg/l Kết bảng 3.3 cho ta thấy bổ sung NAA vào mơi trường có mặt auxin ảnh hưởng đến tích lũy cytokinin, làm giảm hoạt tính BAP Cụ thể, thí nghiệm mơi trường bổ sung BAP, cần nồng độ 0,5 mg/l cho hiệu tốt cịn thí nghiệm cần nồng độ 0,75 mg/l BAP + 0,05 mg/l NAA Tuy nhiên, công thức nồng độ 0,75mg/l BAP + 0,05 mg/l NAA lại cho kết số chồi mẫu, chiều cao số lá/ chồi cao hẳn so với môi trường bổ sung BAP (hình 3.4c) Do đó, cơng thức tốt cho q trình tái sinh nhân nhanh chồi in vitro cơng thức 24 thí nghiệm mơi trường bổ sung BAP với nồng độ 0,75 mg/l kết hợp với NAA nồng độ 0,05 mg/l 3.3 Ra rễ - Tạo in vitro hoàn chỉnh Sau hoàn thành giai đoạn tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp, chúng tơi tiếp tục giai đoạn kích thích chồi rễ tạo hồn chỉnh để in vitro sống phát triển tốt chuyển trồng bầu đất vườn ươm Trong nghiên cứu này, sử dụng IAA (Acid β – indol axetic) auxin sử dụng phổ biến nhân giống in vitro, IAA có vai trị chủ yếu kích thích kéo dài rễ, tăng số lượng rễ phụ Dưới kết thu sau tuần nuôi cấy Bảng 3.4 Ảnh hưởng IAA đến rễ Bìm bịp in vitro (sau tuần) Công thức Nồng độ IAA (mg/l) Tỷ lệ rễ Số rễ/ mẫu Chiều dài rễ (cm) Chiều cao (cm) ĐC 100 2,20bc 3,10c 2,35c CT1 0,1 100 2,60ab 3,65c 4,7a CT2 0,2 100 3,20a 5,05a 5,15a CT3 0,3 100 2,80ab 4,20b 5,25a CT4 0,4 100 1,80c 3,15c 4,35a CT5 0,5 - - - 0,61 0,53 0,72 LSD0,05 25 Với thí nghiệm, cột kí tự theo sau khác a,b,c… thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05 Hình 3.5 Rễ Bìm bịp in vitro sau tuần nuôi cấy a) Môi trường bổ sung IAA 0,2 mg/ml b) Môi trường MS0 Trong nghiên cứu này, việc bổ sung IAA vào mơi trường có tác động tốt cho hình thành rễ từ chồi in vitro, sau 10 ngày nuôi cấy bắt đầu xuất rễ Cụ thể, cơng thức mơi trường có bổ sung IAA với nồng độ 0,2 mg/l cho hiệu phát sinh rễ tốt với số rễ trung bình đạt 3,2 chiều dài rễ 5,05 cm (hình 3.5a) Ngồi việc bổ sung IAA cịn làm tăng số lượng rễ phụ, tăng chiều cao cây, công thức (môi trường bổ sung IAA 0,2-0,3 mg/l) cho kết chiều cao trung bình 5,15 – 5,25 cm cao so với công thức đối chứng trung bình 2,35 cm (bảng 3.4) Tuy nhiên, nồng độ IAA tăng lên cao số lượng rễ chiều dài rễ lại có xu hướng giảm Đặc biệt, công thức nồng độ IAA cao ảnh hưởng đến phát triển cây, mẫu cấy mơi trường có tượng vàng lá, rụng bị chết Nghiên cứu Chen B cộng (2015) tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phương pháp nhân giống nhanh cho Bìm bịp 26 Mơi trường tạo rễ tốt bao gồm ½ MS + 0,25 mg/l IBA cung cấp tỷ lệ rễ hình thành 100% với số rễ trung bình đạt ~ 2,47, chiều dài rễ trung bình 4,64 cm Trong nghiên cứu này, sử dụng IAA kích thích rễ cây, mơi trường có bổ sung IAA với nồng độ 0,2 mg/l cho số lượng rễ hình thành cao (3,2 rễ/ mẫu), chiều dài rễ trung bình đạt 5,05 cm 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên Trong phịng thí nghiệm, Bìm bịp in vitro nuôi dưỡng môi trường ổn định (dinh dưỡng đầy đủ, nhiệt độ từ 25 – 27°C, ánh sáng phù hợp) Chính vậy, phát triển ổn định, đủ điều kiện (ít - rễ, cao - cm) tiến hành rèn luyện, đưa mơi trường ngồi tự nhiên Ngày người sử dụng giá thể cát, sơ dừa, trấu hun, … Đây giá thể tốt cho trồng, đồng thời nghiên cứu khả sống sót, chống chịu ngồi điều kiện tự nhiên [7] Các công thức giá thể lựa chọn là: 100% giá thể cát sạch, giá thể cát đất (tỷ lệ 1:1), giá thể trấu hun đất (tỷ lệ 1:1), 100% giá thể đất Dưới kết thu nhận sau tuần rèn luyện: Bảng 3.5 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống sót Bìm bịp in vitro Cơng thức Giá thể Tỷ lệ sống sót CT1 100% cát Chết hoàn toàn CT2 cát : đất (tỷ lệ 1:1) 33% CT3 trấu hun : đất (tỷ lệ 1:1) 100% CT4 100% đất 80% Sau tuần chăm sóc theo dõi, in vitro bắt đầu thích nghi Ở giá thể 100% cát sau ngày bắt đầu vàng rụng sau chết hồn tồn Ba giá thể cịn lại (cơng thức 2,3,4) có sống sót có thay đổi số Cụ thể, giá thể đất : cát (1:1) có tỷ lệ sống sót 33% hình thành - lá, vàng chưa có thay đổi chiều cao (hình 3.6a), giá thể 100% đất dinh dưỡng có hình 27 thành chồi nách mới, chiều cao tăng ~ cm, tỷ lệ sống sót 80% Cịn lại giá thể đất : trấu hun (1:1), giá thể có tỷ lệ sống sót 100%, phát triển mạnh chiều cao, xanh, to, thân mập (hình 3.6b) Do giá thể tốt để rèn luyện Bìm bịp in vitro đất : trấu hun (1:1) Hình 3.6 Cây Bìm bịp in vitro sau tuần đưa môi trường tự nhiên a) Giá thể đất : cát (1:1) b) Giá thể đất : trấu hun (1:1) c) Giá thể đất 100% 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Nồng độ khử trùng thích hợp cho giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu Bìm bịp là: Cồn 70% phút, Javel 10% 10 phút cho hiệu khử trùng cao đạt khoảng 47,3% - Môi trường MS + 30 g/l đường sacharose + g/l agar bổ sung BAP 0,75 mg/l kết hợp với NAA 0,05 mg/l cho hiệu tái sinh nhân nhanh đạt kết tốt - Môi trường MS + 30 g/l đường sacharose + g/l agar bổ sung IAA nồng độ 0,2 mg/l cho hiệu phát sinh rễ tốt với số rễ trung bình đạt 3,2 chiều dài rễ trung bình 5,05 cm - Giá thể phù hợp để rèn luyện Bìm bịp in vitro đất : trấu hun tỷ lệ 1:1 Ở giá thể có tỷ lệ sống sót 100%, phát triển tốt Kiến nghị - Nghiên cứu thành phần chiết xuất Bìm bịp in vitro hồn tồn bệnh so sánh, đánh giá với chiết xuất Bìm bịp trồng ngồi mơi trường tự nhiên - Đưa vào sản xuất số lượng lớn giống Bìm bịp bệnh, nâng cao chất lượng, số lượng phục vụ cho y học cổ truyền y học đại 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tr 721, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Trang Đài, Huỳnh Ngọc Thụy, Huỳnh Kỳ (2017), “Nghiên cứu thực vật học đa dạng di truyền Clinacanthus nutans Việt Nam”, Tạp chí Dược học, 57(7), 40 - 45 Nguyễn Thị Trang Đài, Huỳnh Ngọc Thụy (2017), “Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm từ thân Bìm bịp Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, Acanthaceae) Việt Nam”, Tạp chí Dược học, 57(11), 76 -79 Huỳnh T (2014), “Tính đồng di truyền loại thực vật nhân giống thực vật (Acanthaceae)”, Tạp chí nghiên cứu Cây thuốc, 8, 903 – 914 Đỗ Tất Lợi (1995), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, 63 - 64, Nxb KH & KT, Hà Nội Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Hồng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (2002), Chất điều hịa sinh trưởng trồng, Nxb Nông nghiệp Huỳnh Ngọc Thụy, Nguyễn Thị Trang Đài (2017), “Bốn hợp chất isoflavonoid G phân lập từ thân Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, Acanthaceae, Tạp chí Dược học, 57(498), 16 - 20 10 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2005), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục Việt Nam 30 Tài liệu tiếng nước 11 Alam, Ariful; Ferdosh, Sahena; Ghafoor, Kashif, Hakim, Abdul, Juraimi, Abdul Shukor, Khatib, Alfi, Sarker, Zaidul I (2016), “Clinacanthus nutans: A review of the medicinal uses, pharmacology and phytochemistry”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, (4), 402 12 Chen B, Zhang J, Zhang W, Zhang C & Xiao Y (2015), “The rapid propagation technique of the medicinal plant Clinacanthus nutans by tissue culture”, New York Sciens Journal, 8, 23 - 27 13 Fong S Y, Piva T, Urban, S & Huynh (2014), “Genetic homogeneity of vegetatively propagated Clinacanthus nutans (Acanthaceae)”, Journal Med Plants Res, 8, 903 - 914 14 Fong S Y, Piva T, Urban, S & Huynh (2015), Genetic, phytochemical and bioactivity studies of Clinacanthus nutans Burm f.) Lindau (Acanthaceae College of Science, Engineering and Health, 1, 44 – 56 15 Gunasekaran U (2014), Callus Induction and Plant Regeneration Studies of Clinacanthus nutans (Sabah Snake Grass), Tunku Abdul Rahman University, 3, 21 – 28 16 Ruhaiyem Y, Gouri K D, Mohd S A, Allan M (2015), “Clinacanthus nutans (Burm F.) Lindau: An Useful Medicinal Plant of South-East Asia”, International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research, 7(6),1244 - 1250 17 Sakdarat S, Shuyprom A, Dechatiwongse T, Waterman P G, Karagianis G (2006) “Chemical composition investigation of Clinacanthus nutans Lindau leaves”, Thai Journal Phytopharmacol, 13(2),13 - 24 Tài liệu Internet 18 https://trungtamduoclieu.vn/cay-bim-bip-id1031.html 31 ... ? ?Nhân nhanh Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f. ) Lindau, 189 4) kĩ thuật nuôi cấy mơ” Mục đích đề tài: Xây dựng quy trình nhân nhanh giống Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f. ) Lindau, 189 4), ... KHOA SINH – KTNN *** PHÙNG THỊ THANH HẰNG NHÂN NHANH CÂY BÌM BỊP (CLINACANTHUS NUTANS (BURM F. ) LINDAU, 189 4) BẰNG KĨ THUẬT NI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh... Hình 1.1: Cây Bìm bịp bịp (Clinacanthus nutans (Burm f. ) Lindau, 189 4) Hình 3.1: Quy trình tạo vật liệu khởi đầu giống Bìm bịp phương pháp in vitro 19 Hình 3.2: Mẫu Bìm bịp in