4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in
Việc nhân chồi in vitro có vai trò quan trọng trong việc tạo ra lượng lớn cây con in vitro làm nguyên liệu cho quá trình nhân giống tiếp theo. Để cây
có trạng thái sinh trưởng tốt thì cần phải xác định được môi trường có chứa chất điều hòa sinh trưởng và nồng độ thích hợp. Môi trường nhân nhanh chồi của đa số thực vật thường là chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin và auxin. Trong nghiên cứu này, BAP và NAA được sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở các ngưỡng nồng độ khác nhau nhằm tìm ra môi trường phù hợp nhất cho kết quả cao nhất.
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây Bìm bịp vitro cây Bìm bịp
BAP là chất điều hòa sinh trưởng trong nhóm xytokinin, đó là chất thường được sử dụng ở lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào trong giai đoạn tái sinh và nhân nhanh bởi chúng có vai trò thúc đẩy sự phân hóa chồi của mẫu nuôi cấy, quyết định số lượng chồi và chất lượng chồi hình thành. Việc xử lí BAP
ảnh hưởng đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro (bảng 3.2).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP (Benzyl Adenin Purin) đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây Bìm bịp (sau 8 tuần nuôi cấy)
Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi/ mẫu (cm) Số lá/ mẫu Trạng thái chồi in vitro CT1(ĐC) 0 1,00d 2,37b 3,50b Chồi nhỏ - Lá xanh CT2 0,25 1,83c 2,79b 4,16b Chồi nhỏ - Lá xanh CT3 0,5 4,33a 3,66a 5,83a Chồi mập – Xanh
21 Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi/ mẫu (cm) Số lá/ mẫu Trạng thái chồi in vitro CT4 0,75 3,16b 1,87c 4,50b Chồi gầy – Lá hơi vàng CT5 1,0 2,66b 1,45c 3,66b Kém – Lá vàng LSD0,05 0,76 0,44 1,01
Trong cùng 1 cột kí tự theo sau khác nhau a, b, c… thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP (0 - 1 mg/l) lên khả năng tái
sinh chồi in vitro của cây Bìm bịp được trình bày ở bảng 3.2. Cụ thể, các công
thức bổ sung BAP đều phát sinh chồi 100%, còn ở công thức đối chứng chịu sự ức chế ưu thế đỉnh. Trong đó, ở công thức 3 môi trường có bổ sung BAP nồng độ 0,5 mg/l cho ảnh hưởng tốt nhất đến khả năng nhân chồi (bảng 3.2), số chồi đạt từ 4-5 chồi/mẫu, số lá từ 4-6 lá, chiều cao khoảng 3,5cm (hình 3.3b). Khi tăng nồng độ của BAP lên 0,75 mg/l cũng thu được kết quả tốt về số lượng chồi nhưng chồi gầy hơn và lá trên chồi nhỏ hơn (hình 3.3c). Và khi nồng độ BAP tăng quá cao (1mg/l) số chồi hình thành giảm đi, kích thước chồi nhỏ, lá chồi vàng điều đó cho thấy nồng độ BAP cao đã ức chế đến sự hình thành chồi mới của cây. Kết quả này cũng tương đương với nghiên cứu của Chen B và cộng sự (2015) với hệ số nhân nhanh thu được là 3,9 0,06 nuôi cấy trong môi trường tối ưu MS cơ bản với 1,0 mg/l BAP + 0,02 mg/l NAA.
22
Hình 3.3. Chồi in vitro của cây Bìm bịp sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng
a) Môi trường cơ bản bổ sung BAP 0,25 mg/l b) Môi trường cơ bản bổ sung BAP 0,5 mg/l c) Môi trường cơ bản bổ sung BAP 0,75 mg/l d) Môi trường cơ bản bổ sung BAP 1mg/l
3.2.2. Ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây Bìm bịp
Chồi in vitro được cấy lên môi trường cơ bản MS có bổ sung tổ hợp
BAP (0 - 1mg/l) kết hợp với NAA nồng độ 0,05 mg/l để thăm dò khả năng tái
sinh chồi in vitro. NAA có độ bền vững hóa học cao, có tác dụng kích thích
23
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây Bìm bịp (sau 8 tuần nuôi cấy)
Công thức Nồng độ (mg/l) Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi Số lá trên chồi Trạng thái chồi in vitro BAP NAA CT1(ĐC) 0 0 1,00d 2,37c 3,50b Chồi nhỏ - Lá xanh CT2 0,25 0,05 2,67c 3,50b 3,33b Chồi nhỏ - Lá xanh CT3 0,5 0,05 4,16b 3,79b 3,67b Chồi mập - Lá xanh CT4 0,75 0,05 5,83a 4,91a 6,50a Chồi mập - Lá xanh CT5 1,0 0,05 3,67b 2,54c 3,50b Chồi nhỏ - Lá vàng LSD0,05 0,76 0,52 1,79
Trong cùng 1 cột kí tự theo sau khác nhau a,b,c… thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05.
24
Hình 3.4. Chồi in vitro của cây Bìm bịp sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng
a) Môi trường cơ bản bổ sung BAP 0,25 mg/l + NAA 0,05 mg/l b) Môi trường cơ bản bổ sung BAP 0,5 mg/l + NAA 0,05 mg/l c) Môi trường cơ bản bổ sung BAP 0,75 mg/l + NAA 0,05 mg/l d) Môi trường cơ bản bổ sung BAP 1mg/l + NAA 0,05 mg/l
Kết quả tại bảng 3.3 cho ta thấy rằng khi bổ sung NAA vào môi trường sự có mặt của auxin đã ảnh hưởng đến sự tích lũy cytokinin, làm giảm hoạt tính của BAP. Cụ thể, ở thí nghiệm 1 môi trường chỉ bổ sung BAP, chỉ cần nồng độ 0,5 mg/l đã cho hiệu quả tốt nhất còn ở thí nghiệm 2 cần nồng độ 0,75 mg/l BAP + 0,05 mg/l NAA. Tuy nhiên, ở công thức 4 nồng độ 0,75mg/l BAP + 0,05 mg/l NAA lại cho kết quả số chồi trên mẫu, chiều cao và số lá/ chồi cao hơn hẳn so với môi trường chỉ bổ sung BAP (hình 3.4c). Do đó, công
25
ở thí nghiệm 2 môi trường bổ sung BAP với nồng độ 0,75 mg/l kết hợp với NAA nồng độ 0,05 mg/l.
3.3. Ra rễ - Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Sau khi hoàn thành giai đoạn tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây
Bìm bịp, chúng tôi tiếp tục giai đoạn kích thích chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh để
cây con in vitro có thể sống và phát triển tốt khi chuyển ra trồng ở bầu đất hoặc trong vườn ươm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng IAA (Acid β – indol axetic) là một auxin được sử dụng phổ biến trong nhân giống in vitro,
IAA có vai trò chủ yếu đó là kích thích sự kéo dài rễ, tăng số lượng rễ phụ của cây. Dưới đây là kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IAA đến sự ra rễ của cây Bìm bịp in vitro (sau 4 tuần) Công thức Nồng độ IAA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ Số rễ/ mẫu Chiều dài rễ (cm) Chiều cao cây con (cm) ĐC 0 100 2,20bc 3,10c 2,35c CT1 0,1 100 2,60ab 3,65c 4,7a CT2 0,2 100 3,20a 5,05a 5,15a CT3 0,3 100 2,80ab 4,20b 5,25a CT4 0,4 100 1,80c 3,15c 4,35a CT5 0,5 0 - - - LSD0,05 0,61 0,53 0,72
26
Với mỗi thí nghiệm, trong cùng 1 cột kí tự theo sau khác nhau a,b,c… thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05.
Hình 3.5. Rễ cây Bìm bịp in vitro sau 4 tuần nuôi cấy a) Môi trường cơ bản bổ sung IAA 0,2 mg/ml b) Môi trường MS0 cơ bản
Trong nghiên cứu này, việc bổ sung IAA vào môi trường đã có tác động
tốt cho sự hình thành rễ từ chồi in vitro, sau 10 ngày nuôi cấy đã bắt đầu xuất
hiện rễ. Cụ thể, ở công thức 2 môi trường có bổ sung IAA với nồng độ 0,2 mg/l cho hiệu quả phát sinh rễ tốt nhất với số rễ chính trung bình đạt 3,2 và chiều dài rễ là 5,05 cm (hình 3.5a). Ngoài ra việc bổ sung IAA còn làm tăng số lượng rễ phụ, tăng chiều cao của cây, ở công thức 2 và 3 (môi trường bổ sung IAA 0,2-0,3 mg/l) cho kết quả chiều cao cây trung bình là 5,15 – 5,25 cm cao hơn so với công thức đối chứng trung bình 2,35 cm (bảng 3.4). Tuy nhiên, khi nồng độ IAA tăng lên cao thì số lượng rễ và chiều dài rễ lại có xu hướng giảm đi. Đặc biệt, ở công thức 5 nồng độ IAA quá cao ảnh hưởng đến sự phát triển của cây, mẫu cấy trong môi trường này có hiện tượng vàng lá, rụng lá và bị chết. Nghiên cứu của Chen B và cộng sự (2015) cũng đã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phương pháp nhân giống nhanh cho cây Bìm bịp.
27
Môi trường tạo rễ tốt nhất bao gồm ½ MS + 0,25 mg/l IBA cung cấp tỷ lệ rễ cây hình thành 100% với số rễ trung bình đạt ~ 2,47, chiều dài rễ trung bình 4,64 cm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng IAA kích thích sự ra rễ của cây, ở môi trường có bổ sung IAA với nồng độ 0,2 mg/l cho số lượng rễ hình thành cao hơn (3,2 rễ/ mẫu), chiều dài rễ trung bình đạt 5,05 cm.
3.4. Rèn luyện cây con in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên
Trong phòng thí nghiệm, cây Bìm bịp in vitro được nuôi dưỡng trong
môi trường ổn định (dinh dưỡng đầy đủ, nhiệt độ từ 25 – 27°C, ánh sáng phù hợp). Chính vì vậy, khi cây phát triển ổn định, đủ điều kiện (ít nhất 3 - 4 rễ, cao 4 - 5 cm) mới tiến hành rèn luyện, đưa cây ra môi trường ngoài tự nhiên. Ngày nay con người sử dụng giá thể cát, sơ dừa, trấu hun, … Đây là những giá thể tốt cho cây trồng, đồng thời có thể nghiên cứu được về khả năng sống sót, chống chịu của cây ngoài điều kiện tự nhiên [7]. Các công thức giá thể được lựa chọn là: 100% giá thể cát sạch, giá thể cát sạch và đất (tỷ lệ 1:1), giá thể trấu hun và đất (tỷ lệ 1:1), 100% giá thể đất.
Dưới đây là kết quả thu nhận được sau 2 tuần rèn luyện:
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống sót của cây Bìm bịp in vitro
Công thức Giá thể Tỷ lệ sống sót CT1 100% cát sạch Chết hoàn toàn CT2 cát sạch : đất (tỷ lệ 1:1) 33% CT3 trấu hun : đất (tỷ lệ 1:1) 100% CT4 100% đất. 80%
Sau 2 tuần chăm sóc và theo dõi, các cây con in vitro bắt đầu thích
nghi. Ở giá thể 100% cát sạch cây con sau 2 ngày lá bắt đầu vàng đi và rụng sau đó chết hoàn toàn. Ba giá thể còn lại (công thức 2,3,4) có cây con sống sót và có sự thay đổi về số lá. Cụ thể, giá thể đất : cát sạch (1:1) có tỷ lệ sống sót là 33% cây con hình thành 1 - 2 lá, lá hơi vàng và chưa có sự thay đổi về chiều cao cây (hình 3.6a), giá thể 100% đất dinh dưỡng cây con có sự hình
28
thành chồi nách mới, chiều cao cây con tăng ~ 1 cm, tỷ lệ sống sót là 80%. Còn lại là giá thể đất : trấu hun (1:1), ở giá thể này cây con có tỷ lệ sống sót là 100%, phát triển mạnh về chiều cao, lá xanh, to, thân mập (hình 3.6b). Do đó
giá thể tốt nhất để rèn luyện cây Bìm bịp in vitro là đất : trấu hun (1:1).
Hình 3.6. Cây Bìm bịp in vitro sau 2 tuần đưa ra môi trường tự nhiên a) Giá thể đất : cát sạch (1:1)
b) Giá thể đất : trấu hun (1:1) c) Giá thể đất 100%
29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Nồng độ khử trùng thích hợp cho giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu của cây Bìm bịp là: Cồn 70% trong 5 phút, Javel 10% trong 10 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất đạt khoảng 47,3%.
- Môi trường MS + 30 g/l đường sacharose + 7 g/l agar bổ sung BAP 0,75 mg/l kết hợp với NAA 0,05 mg/l cho hiệu quả tái sinh và nhân nhanh đạt kết quả tốt nhất.
- Môi trường MS + 30 g/l đường sacharose + 7 g/l agar bổ sung IAA nồng độ 0,2 mg/l cho hiệu quả phát sinh rễ tốt nhất với số rễ chính trung bình đạt 3,2 và chiều dài rễ trung bình là 5,05 cm.
- Giá thể phù hợp nhất để rèn luyện cây Bìm bịp in vitro là đất : trấu hun
tỷ lệ 1:1. Ở giá thể này cây con có tỷ lệ sống sót là 100%, cây phát triển tốt.
2. Kiến nghị
- Nghiên cứu thành phần chiết xuất lá cây Bìm bịp in vitro đã hoàn toàn
sạch bệnh so sánh, đánh giá với chiết xuất cây Bìm bịp được trồng ngoài môi trường tự nhiên.
- Đưa vào sản xuất số lượng lớn cây giống Bìm bịp sạch bệnh, nâng cao chất lượng, số lượng phục vụ cho y học cổ truyền và y học hiện đại.
30
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, tr. 721, Nxb Khoa học và
Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học Tp. Hồ Chí
Minh.
3. Nguyễn Thị Trang Đài, Huỳnh Ngọc Thụy, Huỳnh Kỳ (2017), “Nghiên
cứu thực vật học và đa dạng di truyền của Clinacanthus nutans tại Việt Nam”, Tạp chí Dược học, 57(7), 40 - 45.
4. Nguyễn Thị Trang Đài, Huỳnh Ngọc Thụy (2017), “Nghiên cứu hoạt tính
kháng viêm từ thân cây Bìm bịp Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau, Acanthaceae) tại Việt Nam”, Tạp chí Dược học, 57(11), 76 -79.
5. Huỳnh T (2014), “Tính đồng nhất di truyền của các loại thực vật được
nhân giống thực vật (Acanthaceae)”, Tạp chí nghiên cứu Cây thuốc, 8,
903 – 914.
6. Đỗ Tất Lợi (1995), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 63 - 64, Nxb
KH & KT, Hà Nội.
7. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội.
8. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (2002), Chất điều hòa sinh trưởng đối với cây trồng, Nxb Nông nghiệp.
9. Huỳnh Ngọc Thụy, Nguyễn Thị Trang Đài (2017), “Bốn hợp chất
isoflavonoid G phân lập từ thân cây Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm.
f.) Lindau, Acanthaceae, Tạp chí Dược học, 57(498), 16 - 20.
10.Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2005), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục Việt Nam.
31
Tài liệu tiếng nước ngoài
11. Alam, Ariful; Ferdosh, Sahena; Ghafoor, Kashif, Hakim, Abdul, Juraimi,
Abdul Shukor, Khatib, Alfi, Sarker, Zaidul I (2016), “Clinacanthus
nutans: A review of the medicinal uses, pharmacology and
phytochemistry”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 9 (4), 402.
12. Chen B, Zhang J, Zhang W, Zhang C & Xiao Y (2015), “The rapid
propagation technique of the medicinal plant Clinacanthus nutans by tissue culture”, New York Sciens Journal, 8, 23 - 27.
13. Fong S Y, Piva T, Urban, S & Huynh (2014), “Genetic homogeneity of
vegetatively propagated Clinacanthus nutans (Acanthaceae)”, Journal Med Plants Res, 8, 903 - 914.
14. Fong S Y, Piva T, Urban, S & Huynh (2015), Genetic, phytochemical and
bioactivity studies of Clinacanthus nutans Burm. f.) Lindau (Acanthaceae
College of Science, Engineering and Health, 1, 44 – 56.
15. Gunasekaran U (2014), Callus Induction and Plant Regeneration Studies
of Clinacanthus nutans (Sabah Snake Grass), Tunku Abdul Rahman University, 3, 21 – 28.
16. Ruhaiyem Y, Gouri K D, Mohd S A, Allan M (2015), “Clinacanthus nutans (Burm. F.) Lindau: An Useful Medicinal Plant of South-East Asia”, International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research, 7(6),1244 - 1250.
17. Sakdarat S, Shuyprom A, Dechatiwongse T, Waterman P G, Karagianis
G (2006) “Chemical composition investigation of Clinacanthus nutans Lindau leaves”, Thai Journal Phytopharmacol, 13(2),13 - 24.
Tài liệu Internet