Nhân nhanh cây bìm bịp (clinacanthus nutans (burm f ) lindau, 1894) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN *** PHÙNG THỊ THANH HẰNG NHÂN NHANH CÂY BÌM BỊP (CLINACANTHUS NUTANS (BURM F.) LINDAU, 1894) BẰNG KĨ THUẬT NI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Hà Nội, tháng 05 năm 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN *** PHÙNG THỊ THANH HẰNG NHÂN NHANH CÂY BÌM BỊP (CLINACANTHUS NUTANS (BURM F.) LINDAU, 1894) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chun ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học: TS LA VIỆT HỒNG Hà Nội, tháng 05 năm 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS La Việt Hồng tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình làm thực nghiệm hồn thành khóa luận Vì chưa có nhiều hội tham gia nghiên cứu khoa học nên tơi nhiều bỡ ngỡ kinh nghiệm nhiều hạn chế khơng tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận góp ý, xây dựng thầy bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệp tơi hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên PHÙNG THỊ THANH HẰNG LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài tơi thực Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận hồn tồn trung thực khơng trùng lặp với kết công bố Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên PHÙNG THỊ THANH HẰNG MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích đề tài: Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Bìm bịp 1.1.1 Phân loại phân bố 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Giá trị dược liệu 1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 11 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2 Vật liệu, dụng cụ thiết bị nghiên cứu 11 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 11 2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 11 2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 11 2.3 Môi trường nuôi cấy 11 2.4 Điều kiện nuôi cấy 11 2.5 Phương pháp nghiên cứu 12 2.5.1.Tạo vật liệu khởi đầu 12 2.5.2 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro 13 2.5.3 Tạo in vitro hoàn chỉnh 14 2.5.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Hoàn thiện giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu 19 3.2 Hoàn thiện giai đoạn tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp 20 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro) 20 3.2.2 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro) 22 3.3 Hoàn thiện giai đoạn rễ - tạo in vitro hoàn chỉnh 25 3.4 Hoàn thiện giai đoạn Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzyl amino purin Ca(OCl)2 Calcium hypochlorite HgCl2 Mercuric chloride H2O2 Hydro peroxid IAA Acid β – indol axetic IBA Indol butyric acid KTNN Kĩ Thuật Nông Nghiệp LSD0,05 Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 0,05 MS Murashige Skoog NAA NaClO -napthalene axetic acid Natri hypochlorite DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các công thức tạo vật liệu khởi đầu mẫu Bìm bịp 12 Bảng 2.2 Các cơng thức thí nghiệm ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro 13 Bảng 2.3 Các cơng thức thí nghiệm ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro 14 Bảng 2.4 Các cơng thức thí nghiệm tạo in vitro hồn chỉnh 15 Bảng 2.5 Các cơng thức thí nghiệm rèn luyện in vitro 15 Bảng 3.1 Hiệu tạo vật liệu khởi đầu mẫu Bìm bịp 17 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP (Benzyl Adenin Purin) đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp (sau tuần nuôi cấy) 20 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bìm bịp (sau tuần ni cấy) 23 Bảng 3.4 Ảnh hưởng IAA đến rễ Bìm bịp in vitro (sau tuần) 25 Bảng 3.5 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống sót Bìm bịp in vitro 27 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây Bìm bịp bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894) Hình 3.1: Quy trình tạo vật liệu khởi đầu giống Bìm bịp phương pháp in vitro 19 Hình 3.2: Mẫu Bìm bịp in vitro sau tháng ni cấy trên19 môi trường MS0 19 Hình 3.3: Chồi in vitro Bìm bịp sau tuần ni cấy mơi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng 22 Hình 3.4: Chồi in vitro Bìm bịp sau tuần ni cấy mơi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng 24 Hình 3.5: Rễ Bìm bịp in vitro sau tuần ni cấy 26 Hình 3.6: Cây Bìm bịp in vitro sau tuần đưa môi trường tự nhiên 28 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cây cỏ thảo dược từ lâu ln loại thuốc có nhiều cơng dụng tốt sử dụng rộng rãi y học cổ truyền với thuốc dân gian tác dụng lồi dược liệu Họ Ơ rô (Acanthaceae) họ lớn thực vật hai mầm Lớp thực vật có hoa, chứa khoảng 214 250 chi (tùy hệ thống phân loại) khoảng 500 – 000 lồi Ở Việt Nam có khoảng 55 chi, khoảng 195 lồi Cây Bìm bịp tùy theo địa phương gọi Mảnh cộng hay Xương khỉ có tên khoa học Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894 cỏ thảo dược lâu năm có nhiều cơng dụng y học [1, 2, 6] Đơng y cho rằng, mảnh cộng có vị ngọt, tính bình, có tác dụng mát gan, lợi đảm (tăng tiết mật), tiêu thũng (giảm phù nề), chống đau, hạ sốt, chống viêm, điều kinh, thân tươi giã nát đắp vết thương, cầm máu, bong gân, gãy xương kín,… Được sử dụng để hỗ trợ điều trị viêm gan vàng da, giảm tiết mật, đau nhức phong thấp, gãy xương Bộ phận dùng làm thuốc toàn thu hái quanh năm, dùng tươi phơi khô để dành [6] Nghiên cứu y học đại thành phần chiết xuất Bìm bịp hoạt động chất chống oxy hóa Tám hợp chất 132 – hydroxyl - (132 - S) - chlorophyll B, 132 – hydroxyl - (132 - R) - chlorophyll B, 132 –hydroxy - (132 - S) - phaeophytin B, 132 - hydroxy- (132 - R) phaeophytin B, 132 - hydroxy - (132 - S) - phaeophytin A, 132 – hydroxyl (132 - R) - phaeophytin A, purpurin 18 phytyl ester phaeophorbide A phát chiết xuất từ thân [14] Thí nghiệm dược lý chứng minh loại chiết xuất hợp chất tinh khiết từ loài thể loạt đặc tính sinh học chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa chống bệnh tiểu đường Cây Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894) nhỏ, mọc tự nhiên, nguồn giống chủ yếu nhân giống phương pháp giâm cành từ mẹ hay gieo hạt, nhiên tần số gia tăng chồi hình thành thấp qua thời gian giống bị thối hóa nhiễm bệnh từ mẹ để lại, thân phát triển Bởi vậy, nguồn giống ngày khó tìm Nghiên cứu Gunasekaran năm 2014 nhân giống Bìm bịp, kết đưa thành công việc tạo mô sẹo khơng có kết tái sinh con, lý bao gồm khơng phù hợp điều kiện thí nghiệm, chẳng hạn nồng độ chất điều hòa tăng trưởng [15] Ở Trung Quốc, nghiên cứu Chen B cộng (2015) tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phương pháp nhân giống nhanh cho Bìm bịp Kết cho thấy mơi trường tăng sinh tối ưu cho Bìm bịp Murashige Skoog (MS) với 1,0 mg/l BAP + 0,02 mg/l NAA cung cấp hệ số nhân nhanh 3,9 Môi trường tạo rễ bao gồm ½ MS + 0,25 mg/l IBA cung cấp tỷ lệ rễ hình thành 100% Ở Việt Nam, có nghiên cứu tác dụng sinh học hóa học từ Bìm bịp, tiến hành phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất tinh khiết cho thấy chiết xuất từ thân Bìm bịp mọc Việt Nam có hoạt tính chống viêm Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nhân giống Bìm bịp Việt Nam Ngày nay, với phát triển khoa học kĩ thuật, cơng nghệ nhân giống vơ tính ni cấy mơ - tế bào thực vật có hiệu sản xuất trồng hạn chế trở ngại mà phương pháp khác gặp phải, từ tạo giống trồng trẻ hóa, bệnh đảm bảo chất lượng mặt di truyền Từ thực tế nêu trên, góp phần vào việc tạo nguồn giống chất lượng, chọn nghiên cứu đề tài: “Nhân nhanh Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894) kĩ thuật ni cấy mơ” Mục đích đề tài: Xây dựng quy trình nhân nhanh giống Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894), nhằm góp phần tạo nguồn giống sạch, chất lượng cao Nội dung nghiên cứu - Tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro - Tái sinh nhân nhanh Bìm bịp in vitro - Ra rễ - Tạo Bìm bịp in vitro hồn chỉnh - Rèn luyện in vitro thích nghi với mơi trường tự nhiên Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Bổ sung nguồn tài liệu hồn thiện quy trình nhân giống Bìm bịp - Ý nghĩa thực tiễn: Hồn thiện quy trình nhân giống Bìm bịp, ứng dụng vào sản xuất để cung cấp nguồn giống chất lượng cho người trồng dược liệu NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Bìm bịp 1.1.1 Phân loại phân bố Hình 1.1 Cây Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894) (Nguồn: trungtamduoclieu.vn) Thuộc: Giới: Thực vật (Plantea) Ngành: Hạt kín (Magnoliophyta) Lớp: Hai mầm (Magnoliopsida) Bộ: Hoa Mơi (bộ Bạc Hà) (Lamiales) Họ: Ơ rơ (Acanthaceae) Tên khoa học: Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894 Tên Việt Nam: Bìm bịp (Mảnh cộng hay Xương khỉ) Cây Bìm bịp (cây Mảnh cộng hay Xương khỉ) có tên khoa học Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894 thuộc họ Ơ rơ (Acanthaceae) Họ Ơ rơ (Acanthaceae) họ lớn chứa khoảng 214 - 250 chi (tùy hệ thống phân loại) khoảng 2500 – 4000 loài Trong họ Ơ rơ - Acanthaceae bao gồm bốn phân họ, cụ thể Nelsonioideae, Acanthoideae, Thunbergioideae Avicennioideae [14] Họ chủ yếu bao gồm loài bụi, nửa bụi gỗ Trong số loài từ họ này, có số phân bố vùng ơn đới hầu hết lồi phân bố khu vực Đơng Nam Á Cây Bìm bịp có nguồn gốc từ nước châu Á nhiệt đới cận nhiệt đới, bao gồm Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam Trung Quốc Ở Việt Nam, từ lâu Bìm bịp biết đến vị thuốc dân gian với nhiều công dụng khác y học cổ truyền, Bìm bịp tìm thấy giàu axit amin, nguyên tố vi lượng thành phần hóa học có hoạt tính sinh học cao [2, 12, 15] 1.1.2 Đặc điểm sinh học - Thân: Cây Bìm bịp thuộc dạng bụi trườn, nhỏ, mọc trườn, có chiều cao lên đến 3m, thân có cấu trúc rỗng [2, 13] - Lá: Lá nguyên, mọc đối, có cuống ngắn, phiến hình mác hay thn, mặt nhăn, mép quăn có màu xanh thẫm, kích thước bề mặt trung bình 1,5 cm x cm [2, 15] - Hoa: Hoa mọc thành chùm đỉnh chồi gần đỉnh chồi, rủ xuống Mỗi bơng hoa có đài hoa với kích thước 0,9 - 1,3 cm, tràng hoa dài ~ 3,5 cm đường kính ~ mm, mở rộng đến ~ mm nở Tràng hoa có mơi, mơi có hướng lên Lá bắc hẹp Hoa đỏ hay hồng, bên có chứa lơng tuyến (hình 1.1) [2, 13] - Quả: Quả Bìm bịp thuộc nang dài ~ cm, có chứa hạt, hạt có đường kính ~ mm [13] 1.1.3 Giá trị dược liệu Việc sử dụng thực vật làm thảo dược phổ biến thành thị xã hội nông thôn Khoảng 80% dân số khu vực châu Á châu Phi quốc gia sử dụng rộng rãi thuốc thảo dược cho số khía cạnh chăm sóc sức khỏe theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) (Edgar, Elias Adnan 2002) Cây Bìm bịp loại thảo mộc địa số nước Đông Nam Á đặc biệt Thái Lan, phần phía nam Trung Quốc, Indonesia, Malaysia Việt Nam Đông y cho rằng, mảnh cộng có vị ngọt, tính bình, có giá trị sử dụng trạng tươi hay trạng thái khô Y học dân gian nước ghi nhận, Bìm bịp có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, độc tế bào, trị côn trùng cắn, sốt, ban da, lỵ, đái tháo đường [9, 16] Ở nước ta, nhiều người tìm kiếm điều trị bệnh xương khớp, dày, viêm gan, vàng da giúp hỗ trợ điều trị bệnh ung thư [5] Ở Trung Quốc (Hải Nam), người ta dùng thân, làm thuốc trị thương tích chữa thiếu máu, hồng đản, phong thấp Thường dùng cành khô sắc uống Dùng lấy tươi giã đắp [2] Ở Thái Lan, chiết xuất cồn tươi dùng trị bỏng, sâu bọ đốt, côn trùng cắn, kháng khuẩn, chống viêm giảm đau, số bệnh da dị ứng mụn rộp [5] Trong y học đại ngày nay, nhiều nghiên cứu chiết xuất Bìm bịp chứa nhiều sinh tố, khống chất hoạt động chất chống oxy hóa [18] Theo nghiên cứu Ruhaiyem Yahaya cộng sự, Bìm bịp chứa hợp chất terpenoids, flavonoid, flavon C-glycosyl, lưu huỳnh- có chứa glucosides glycoglycerolipids góp phần vào hoạt động dược lý Nghiên cứu dược lý Cây Bìm bịp sở hữu thuốc kháng virus, chống ung thư, chống oxy hóa, trị đái tháo đường, điều hòa miễn dịch, chữa lành vết thương, hoạt động chống viêm giảm đau [16] Chiết xuất thơ từ Bìm bịp chứa hoạt chất có hoạt động gây độc tế bào chống lại tế bào u ác tính D24, chiết xuất có hoạt tính sinh học cho phenolics flaconoid [14] 1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới Chiết xuất Bìm bịp nhiều nhà nghiên cứu giới đánh giá giá trị hóa sinh, cơng dụng chất có thân Nghiên cứu Alam cộng (2016) cho loài sử dụng làm thuốc thảo dược quan trọng châu Á nhiệt đới, thành phần khác hợp chất hoạt tính sinh học từ loại flavonoid, glycoside, glycolycerolipids, cerebroside monoacylmonogalatosylglycerol Trong thí nghiệm dược lý chứng minh loại chiết xuất hợp chất tinh khiết từ loài thể loạt đặc tính sinh học chống viêm, chống virus, chống oxy hóa chống tiểu đường [11] Theo nghiên cứu Sakdarat S cộng năm 2006 thành phần Bìm bịp từ lâu sử dụng truyền thống Thái Lan loại thuốc chống viêm, để điều trị côn trùng cắn, nhiễm herpes phản ứng dị ứng [17] Bộ Y tế công cộng Thái Lan coi phương thuốc để điều trị viêm da tổn thương virus [17] Các chiết xuất Bìm bịp có vai trò chống ung thư phát Trung Quốc (Wang cộng sự, 2013) Lá Bìm bịp tìm thấy giàu axit amin, nguyên tố vi lượng thành phần hóa học có hoạt tính sinh học Chiết xuất chloroform thơ tách phương pháp sắc ký hướng dẫn sinh học kỹ thuật phân đoạn để đưa tám hợp chất tinh khiết Cấu trúc làm sáng tỏ hợp chất lập thực sở phân tích quang phổ, bao gồm DEPT, COZY, NOESY, HMQC HMBC Tám hợp chất có liên quan đến chất diệp lục a chất diệp lục b, tám hợp chất 132 – hydroxyl -(132 - S) - chlorophyll B (1), 132 – hydroxyl - (132 - R) chlorophyll B (2), 132 – hydroxyl - (132 - S) - phaeophytin B (3), 132 – hydroxyl - (132 - R) –phaeophytin B (4), 132 – hydroxyl - (132 - S) phaeophytin A (5), 132 –hydroxy - (132 - R) - phaeophytin A (6), purpurin 18 phytyl ester (7) phaeophorbide A (8) Năm số (hợp chất 1, 2, 4, 5, 6) xác định hợp chất Các hợp chất chưa báo cáo trước [12, 17] Tạp chí quốc tế nghiên cứu Dược lí Thực vật học, nghiên cứu Ruhaiyem Y cộng (2015) cho Bìm bịp thuốc hữu ích Đơng Nam Á Các chiết xuất thực vật báo cáo sở hữu khả chống ung thư, chống oxy hóa, chống đái tháo đường, điều hòa miễn dịch, chữa lành vết thương, chống viêm hoạt động giảm đau Ngoài nghiên cứu độc tính cho thấy Bìm bịp không độc hại sử dụng với liều lượng khuyến cáo [16] Cơng trình nghiên cứu Fong S năm 2015, Trường Đại học RMIT thực số nghiên cứu thành phần Bìm bịp Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng vị trí thu gom với đặc điểm mơi trường khác thành phần hóa học hoạt tính chống ung thư có Bìm bịp thu ba địa điểm khác Thái Lan, Malaysia Việt Nam Kết cho thấy rằng, thành phần hóa học hoạt tính chống ung thư Bìm bịp mọc độ cao cao với nhiệt độ khơng khí thấp - chiết xuất Bìm bịp trồng Chiang Dao, Chiang Mai, Thái Lan - có hoạt động cao (24 EC50: 0,95 mg/ml 72 EC50: 0,77 mg/ml) Nghiên cứu thứ hai ảnh hưởng trình sau thu hoạch đến thành phần hóa học chất chống ung thư có Bìm bịp Kết thúc thí nghiệm cho thấy rằng, chiết lạnh nhiệt độ 22°C phương pháp tốt cho hàm lượng phenolics flavonoid tối đa [13, 14] Ở Malaysia, loài có tên địa phương cỏ rắn Sabah, nghiên cứu Gunasekaran (2014) nhân giống Bìm bịp Trong nghiên cứu này, hai thí nghiệm thực hiện, tạo mơ sẹo (callus) tái sinh Thí nghiệm tạo mơ sẹo nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện ánh sáng bóng tối, ảnh hưởng loại cytokinin khác đến khả cảm ứng callus Bìm bịp từ Kết đưa cho thấy rằng, khơng có khác biệt kết cảm ứng callus điều kiện bóng tối so với điều kiện chiếu sáng, mơ sẹo hình thành môi trường chứa Dicamba nồng độ mg/l có hiệu tốt so với chất điều hòa sinh trưởng lại Ở điều kiện ánh sáng, môi trường chứa mg/ l Dicamba cho hiệu cảm ứng callus tốt 8,3 ± 0,58%, điều kiện tối mơi trường chứa Dicamba 3mg/ l cho hiệu cảm ứng callus tốt với giá trị trung bình 8,0 ± 1,00% Nghiên cứu thành công việc tạo mô sẹo lại khơng có kết tái sinh con, lý bao gồm khơng phù hợp điều kiện thí nghiệm, chẳng hạn nồng độ chất điều hòa tăng trưởng [15] Ở Trung Quốc, Chen B cộng (2015) tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phương pháp nhân giống nhanh cho Bìm bịp Kết cho thấy môi trường tăng sinh tối ưu cho Bìm bịp Murashige Skoog (MS) với 1,0 mg/l BAP + 0,02 mg/l NAA cung cấp hệ số nhân nhanh 3,9 Môi trường tạo rễ bao gồm ½ MS + 0,25 mg/l IBA cung cấp tỷ lệ rễ hình thành 100% [12] Ngồi nhiều nghiên cứu hợp chất có thân Bìm bịp cơng dụng nó, nhiên nghiên cứu nhân giống Bìm bịp hạn chế Các kết nghiên cứu có ý nghĩa vơ quan trọng việc giúp nhà nghiên cứu nước ta thừa kế kinh nghiệm để đem lại hiệu cao nhân nhanh nguồn giống bảo tồn nguồn giống bệnh 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Tại Việt Nam, nghiên cứu sâu tác dụng sinh học hóa học từ Bìm bịp chưa có hiệu cao Ngun nhân chủ yếu Bìm bịp biết đến với thuốc truyền thống hạn chế y học đại sử dụng chiết xuất từ thân có hoạt tính sinh học cao ứng dụng sản xuất dược liệu Tuy có số nghiên cứu Bìm bịp sau đây: - Huỳnh Ngọc Thụy, Nguyễn Thị Trang Đài (2017) bước đầu phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất tinh khiết phân lập từ thân Bìm bịp mọc núi Cấm, Châu Đốc, tỉnh an Giang, Việt Nam Với phương pháp chiết xuất, phân lập: Chiết ngấm kiệt ethanol 96%, phân lập sắc ký cột phát bốn hợp chất isoflavonoid phân lập từ thân có cấu trúc lần lượt: (+) – – hydroxy – – methoxy - 8,9 methylendioxypterocarpan (CN6T - 3), (-) – – hydroxy – – methoxy - 8,9 - methylendioxypterocarpan (CN6T - 4), – hydroxy - 4´-methoxyisoflavon (CN22 - 2), 3´,7 – dihydroxyl - 4´,8 - dimethoxylisoflavon (CN22 - 3) [9] - Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm từ thân Bìm bịp Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, Acanthaceae Nguyễn Thị Trang Đài cộng năm 2017 đưa kết mơ hình in vitro, xác định cao ethanol toàn phần 96% thân có tác dụng kháng viêm mạnh rễ lá, cao phân đoạn ethyl acetat có tác dụng kháng viêm mạnh cao dichloromethan cao nước, phân đoạn cao ethyl acetat có tác dụng kháng viêm mạnh phân đoạn lại, in vivo, cao ethyl acetat liều 1000 2000 mg/kg cho hoạt tính kháng viêm, giảm phù vào ngày đầu điều trị Tuy mức độ tác dụng có so với diclofenac 10 mg/kg chứng tỏ Bìm bịp có tác dụng kháng viêm cấp chất có tác dụng kháng viêm cấp nằm nhiều cao phân đoạn ethyl acetat [4] - Nghiên cứu thực vật học đa dạng di truyền Bìm bịp Việt Nam Nguyễn Thị Trang Đài cộng (2017), kết cho thấy qua hình dạng bên ngồi lá, qua phân tích kiểu hình kiểu gen cho kết 17 mẫu Bìm bịp thu hái 12 tỉnh thành Việt Nam xếp thành nhóm chính, mẫu Bìm bịp CN50 lồi Clinacanthus nutans nhóm lại phân lồi Clinacanthus nutans, kết sở việc đánh giá đa dạng nguồn gen lồi Bìm bịp [3] Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu đề cập đến vấn đề nhân giống Bìm bịp chưa có Việt Nam Bởi đề tài: “Nhân nhanh Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau, 1894) kĩ thuật nuôi cấy mơ” nhằm góp phần tạo giống Bìm bịp bệnh, chất lượng tốt 10 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm tiến hành từ tháng 6/2018 đến tháng 4/2019 Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật, khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.2 Vật liệu, dụng cụ thiết bị nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu Bìm bịp thu xã Ngọc Thanh - tỉnh Vĩnh Phúc 2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu Các dụng cụ bao gồm: dao cấy, khay cấy, panh gắp, kéo, túi nilon, bình cấy, đèn cồn, pipet, bình xịt cồn, giấy thấm 2.2.3 Thiết bị nghiên cứu Các thiết bị sử dụng bao gồm: nồi hấp khử trùng, máy cất nước lần, máy đo pH, cân kĩ thuật, tủ lạnh, bếp hồng ngoại, buồng cấy vô trùng 2.3 Môi trường nuôi cấy - Môi trường nuôi cấy bản: MS [11] + 30 g/l đường sacharose + g/l agar chất điều hòa sinh trưởng chứa khống đa lượng, vi lượng, pH môi trường 5,8 - Chất khử trùng: Javel - Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng: BAP (6-benzyl amino purin), NAA ( -napthalene axetic acid), IAA (Acid β – indol axetic) - Môi trường khử trùng nồi hấp khử trùng 117°C 15 phút 2.4 Điều kiện phòng ni cấy Tất thí nghiệm thực điều kiện nhân tạo: - Nhiệt độ nuôi cấy: 25°C - 27°C - Độ ẩm trung bình: 60% - 70% 11 - Ánh sáng: Sử dụng đèn chiếu sáng Neon với cường độ chiếu sáng 3000 Lux - Thời gian chiếu sáng: 12h/ ngày 2.5 Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với lần nhắc lại Các mẫu cấy có kích thước (3 - 4cm) 2.5.1 Tạo vật liệu khởi đầu Đây giai đoạn quan trọng, chí định tồn quy trình nhân giống in vitro Mục đích giai đoạn tạo nguồn mẫu vô trùng dùng cho giai đoạn sau Chúng tiến hành cắt đoạn thân mang chồi nách Bìm bịp tự nhiên rửa sạch, lắc nước xà phòng lỗng từ 15 - 20 phút rửa kỹ vòi nước chảy Sau tiến hành khử trùng mẫu cồn 70° dung dịch Javel nồng độ thời gian sau: Bảng 2.1 Các cơng thức tạo vật liệu khởi đầu mẫu Bìm bịp Công thức CT1: (CT đối chứng) Nồng độ thời gian khử trùng Xử lí sơ xà phòng, cồn nước cất CT2 Cồn 70% phút, Javel 5% 10 phút CT3 Cồn 70% phút, Javel 5% 15 phút CT4 Cồn 70% phút, Javel 10% 10 phút CT5 Cồn 70% phút, Javel 10% 15 phút CT6 Cồn 70% 10 phút, Javel 15% 10 phút CT7 Cồn 70% 10 phút, Javel 15% 15 phút 12 Sau khử trùng mẫu rửa lại nước cất vô trùng - lần Bìm bịp cắt đốt (3 – cm) cấy lên môi trường MS chứa 30 g/l saccharose, g/l agar chuẩn độ pH = 5,8 Theo dõi đánh giá mẫu sau 10 ngày dựa theo tỷ lệ: + Tỷ lệ mẫu nhiễm = + Tỷ lệ mẫu chết = ∑ ẫ ∑ ∑ + Tỷ lệ mẫu sống = ị ẫ ẫ ễ ấ ị ế ( ặ ẫ ấ ∑ ∑ ẫ ∑ (%) ẫ ố ấ ô ) (%) (%) 2.5.2 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Tiến hành nghiên cứu khả tái sinh mô nuôi cấy hệ số nhân nhanh chồi in vitro Môi trường nuôi cấy dinh dưỡng nhân tạo bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP BAP kết hợp với NAA theo thí nghiệm sau: Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bảng 2.2 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Công thức Nồng độ BAP (mg/l) CT1: (CT đối chứng) CT2 0,25 13 Công thức Nồng độ BAP (mg/l) CT3 0,5 CT4 0,75 CT5 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Bảng 2.3 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tái sinh nhân nhanh chồi in vitro Nồng độ (mg/l) Công thức BAP NAA CT1: (CT đối chứng) 0 CT2 0,25 0,05 CT3 0,5 0,05 CT4 0,75 0,05 CT5 0,05 Mẫu cho vào môi trường sau tuần ni cấy, đánh giá thí nghiệm dựa theo tiêu: + Số chồi/mẫu (chồi) + Chiều cao chồi (cm) + Số lá/chồi (lá) + Đặc điểm chồi: Màu sắc lá, thân, rễ 2.5.3 Ra rễ - Tạo in vitro hồn chỉnh Chồi in vitro thu từ thí nghiệm có chiều cao 2,5 - cm ni cấy mơi trường có bổ sung IAA với nồng độ khác sau: 14 Bảng 2.4 Các cơng thức thí nghiệm tạo in vitro hồn chỉnh Cơng thức Nồng độ IAA (mg/l) CT đối chứng CT1 0,1 CT2 0,2 CT3 0,3 CT4 0,4 CT5 0,5 Đánh giá thí nghiệm theo dõi dựa theo tiêu sau tuần nuôi cấy: + Tỷ lệ rễ (%) + Số rễ/chồi (rễ) + Chiều dài rễ (cm) + Chiều cao (cm) + Thời gian rễ (ngày) 2.5.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên Cây Bìm bịp ni cấy mơ hồn chỉnh - rễ, cao - cm đưa vào rèn luyện thích nghi với điều kiện tự nhiên giá thể sau: Bảng 2.5 Các cơng thức thí nghiệm rèn luyện in vitro Công thức Giá thể CT1 100% cát CT2 cát đất (tỷ lệ 1:1) CT3 trấu hun đất (tỷ lệ 1:1) CT4 100% đất Đánh giá thí nghiệm theo dõi dựa theo tiêu sau tuần rèn luyện: + Tỷ lệ sống (%) 15 + Chiều cao (cm) + Đặc điểm cây: thân, màu sắc lá, chiều cao 2.6 Phân tích thống kê số liệu Các số liệu phân tích theo tham số thống kê gồm giá trị trung bình độ lệch chuẩn, giới hạn sai khác nhỏ LSD0,05 chương trình Excel [7] 16 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro Trong giai đoạn kĩ thuật nhân giống in vitro giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu đóng vai trò vơ quan trọng, định đến thành công đề tài nghiên cứu Nhiệm vụ giai đoạn phải đưa nguồn mẫu từ bên ngồi mơi trường vào ni cấy điều kiện vô trùng để thực nghiên cứu Để loại bỏ vi khuẩn có mẫu ngồi mơi trường sử dụng nhiều loại chất khử trùng khác NaClO, Ca(OCl)2, H2O2, HgCl2, thí nghiệm này, chất khử trùng Javel (NaClO) sử dụng chất khử trùng có hiệu cao với chế độ khử trùng thích hợp Mẫu Bìm bịp sau thu xử lý sơ + Javel với nồng độ thời gian khử trùng khác Theo dõi tiêu mẫu nhiễm, mẫu sau 15 ngày nuôi cấy ta thu kết trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Hiệu tạo vật liệu khởi đầu mẫu Bìm bịp Cơng thức Nồng độ chất xử lí/ thời gian Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 17 Tỷ lệ mẫu chết ... Nhân nhanh Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f. ) Lindau, 189 4) kĩ thuật nuôi cấy mơ” Mục đích đề tài: Xây dựng quy trình nhân nhanh giống Bìm bịp (Clinacanthus nutans (Burm f. ) Lindau, 189 4), ... KHOA SINH – KTNN *** PHÙNG THỊ THANH HẰNG NHÂN NHANH CÂY BÌM BỊP (CLINACANTHUS NUTANS (BURM F. ) LINDAU, 189 4) BẰNG KĨ THUẬT NI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh... (Magnoliopsida) Bộ: Hoa Môi (bộ Bạc H ) (Lamiales) Họ: Ơ rơ (Acanthaceae) Tên khoa học: Clinacanthus nutans (Burm f. ) Lindau, 1894 Tên Việt Nam: Bìm bịp (Mảnh cộng hay Xương kh ) Cây Bìm bịp (cây Mảnh