Nghiên cứu quá trình tự phân (autolysis) protein thịt đỏ cá ngừ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - TRẦN TRUNG THANH BÌNH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN (AUTOLYSIS) PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đà Nẵng – Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - TRẦN TRUNG THANH BÌNH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN (AUTOLYSIS) PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS BÙI XUÂN ĐÔNG Đà Nẵng – Năm 2018 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cám ơn chân thành đến TS Bùi Xn Đơng, người tận tình hướng dẫn cho em suốt thời gian vừa qua Chính nhờ giúp đỡ dẫn thầy giúp em hồn thành đề tài cách tốt qua thời gian làm việc thầy giúp em học hỏi thêm kiến thức kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học Em xin gửi lời cám ơn đến thầy cô cán phịng thí nghiệm ThS Võ Cơng Tuấn ThS Phạm Thị Kim Thảo giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em khoảng thời gian thí nghiệm phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Sinh học Bên cạnh em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy mơn Cơng nghệ Sinh học, khoa Hóa, trường Đại học Bách khoa-Đại học Đà Nẵng dạy dỗ, truyền đạt cho em kiến thức bổ ích giúp đỡ em suốt quãng thời gian học tập trường Cuối em xin gửi lời cám ơn chân thành đến người thân bạn bè động viên giúp đỡ em suốt khoảng thời gian học tập trường Công việc nghiên cứu khơng tránh khỏi bỡ ngỡ sai sót, em kính mong nhận góp ý q thầy phản biện để đề tài em hồn thiện Đà Nẵng, ngày 01 tháng 10 năm 2018 Học viên thực Trần Trung Thanh Bình LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Người cam đoan Trần Trung Thanh Bình NGHIÊN CỨU Q TRÌNH TỰ PHÂN (AUTOLYSIS) PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ Học viên: Trần Trung Thanh Bình Mã số: 107160267 Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Khóa: 32 - Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN Tóm tắt – Cá ngừ (Thunuss spp.) họ cá ngừ nguồn thực phẩm đóng vai trò quan trọng kinh tế Việt Nam Cá ngừ thường sử dụng tươi, chế biến phi-lê/thăn thịt chế biến đồ hộp Quá trình chế biến đồ hộp sử dụng phần ba khối lượng cá ngun liệu Do đó, ngành cơng nghiệp đồ hộp loại bỏ tới 70% phụ phẩm so với nguyên liệu ban đầu, thịt đỏ nguồn phế liệu rắn Dịch đạm thủy phân (FPH) chế biến từ phụ phẩm cá ngừ, ứng dụng loại gia vị công nghiệp chế biến thực phẩm nhằm tạo hiệu ứng chức Mục tiêu nghiên cứu nghiên cứu trình tự phân thịt đỏ cá ngừ để thu dịch đạm thủy phân Đã xác định điều kiện tối ưu cho trình tự phân protein thịt đỏ cá ngừ thời gian phản ứng 6,0, tỷ lệ phối trộn nước : nguyên liệu 2:1, nhiệt độ t=450C pH phản ứng pH=5,0 Từ khóa – tự phân; phế phẩm cá ngừ; thịt đỏ cá ngừ; cathepsin; calpain; collagenase; dịch đạm thủy phân; STUDY OF AUTOLYSIS OF THE TUNA’S RED MUSCLE PROTEIN Abstract – Tuna (Thunnus spp.) and tuna-like species are significant sources of food and thus play a very important role in the economy of Vietmam Tuna generally is processed as raw fish flesh and marketed as loins/steaks or as a canned food In the tuna canning process, only about one-third of the whole fish is used Thus, the canning industry generates as much as 70% solid wastes from original fish materials, red muscle is solid waste too Fish protein hydrolysate (FPH), which is obtained through hydrolysis of tuna waste, can be used as an ingredient in food industries to provide functional effects The purpose of this research is to autolysis of tuna’s red muscle to obtain protein hydrolyzate The optimal parameters for autolysis reaction were reaction time of h, ratio of water to red meat of 2:1, reaction temperature of 45°C and pH of reaction – pH=5,0 Key words – autolysis; tuna waste; tuna’s red muscle; cathepsin; calpain; collagenase; protein hydrolysate; MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu: 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Phương pháp nghiên cứu 1.4.1 Phương pháp vật lý 1.4.2 Phương pháp hóa lý 1.4.3 Phương pháp hóa sinh 1.4.4 Phương pháp vi sinh 1.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 1.5 ngh a khoa học thực ti n đề tài nghiên cứu 1.5.1 ngh a khoa học đề tài 1.5.2 ngh a thực ti n đề tài 1.6 Bố cục luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu dịch thủy phân protein 1.2 Giới thiệu nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ 1.2.1 Thành phần thịt đỏ cá ngừ 1.3 Tổng quan enzyme nội .7 1.3.1 Các loại enzyme nội thủy phân hải sản 1.3.2 Các phương pháp thủy phân protein thủy sản 12 1.3.3 Ứng dụng dịch thủy phân protein cá, thủy hải sản 14 1.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến trình tự phân 15 1.4.1 Nhiệt độ .15 1.4.2 pH 15 1.4.3 ượng muối 15 1.4.4 Diện tích tiếp xúc 15 1.4.5 Bản thân nguyên liệu 16 1.5 Lịch sử vấn đề nghiên cứu 16 1.5.1 Nghiên cứu nước .16 1.5.2 Nghiên cứu nước .19 1.5.3 Mô hình nghiên cứu tổng quan thực nghiệm 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Dụng cụ máy móc thiết bị .23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp vật lý 24 2.3.2 Phương pháp hóa lý 24 2.3.3 Phương pháp hóa sinh 24 2.3.4 Phương pháp vi sinh 26 2.3.5 Phương pháp cảm quan .27 2.4 Khảo sát thực nghiệm 27 2.4.1 Xác định thành phần khối lượng quan cá ngử 27 2.4.2 Xác định thành phần hóa học hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ thu gom từ nhà máy 27 2.4.3 Nghiên cứu trình bất hoạt vi sinh vật mẫu nguyên liệu phương pháp vật lí hóa học 28 2.4.4 Khảo sát mức độ hoạt động hệ enzyme calpain, cathepsin collagenase nguyên liệu hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ 28 2.4.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tự thủy phân thịt đỏ cá ngừ tác dụng enzyme cathepsin 30 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 ết xác định thành phần khối lượng quan số loại cá ngừ khu vực Đà Nẵng 33 3.2 Kết xác định thành phần hóa học hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ thu gom từ nhà máy chế biến thủy sản 33 3.3 Kết nghiên cứu bất hoạt vi sinh vật mẫu ngun liệu phương pháp vật lí hóa học 34 3.4 Kết khảo sát mức độ thủy phân protein nguyên liệu tác dụng hệ enzyme calpain, cathepsin collagenase 35 3.5 ết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tự thủy phân (autolysis) thịt đỏ cá ngừ tác dụng enzyme cathepsin 39 3.5.1 nh hưởng tỷ lệ phối trộn nguyên liệu nước 39 3.5.2 nh hưởng pH môi trường 40 3.5.3 nh hưởng thời gian phản ứng 41 ết thí nghiệm kiếm chứng sản xuất thử dịch đạm .42 3.7 Đề xuất quy trình cơng nghệ thu hồi dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ cở sở kích hoạt hệ enzyme nội 43 3.7.1 Nguyên vật liệu 43 3.7.2 Sơ đồ quy trình cơng nghệ 43 3.7.3 Thuyết minh quy trình cơng nghệ 44 3.8 Đánh giá chất lượng dịch đạm thu hồi từ thịt đỏ cá ngừ theo quy trình cơng nghệ đề xuất 45 3.8.1 Các tiêu lý-hóa dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ 45 3.8.2 Các vi sinh dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (bản sao) DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT FHP Fish protein hydrolysate – Dịch đạm thủy phân từ cá ATP Adenosine triphotphate – dạng lượng sinh học w/w Weigh/Weigh – khối lượng/khối lượng SD Độ lệch chuẩn Mb Myoglobin Hb Hemoglobin KLPT HPLC hối lượng phân tử High performance lipuid chromatography - Sắc ký lỏng cao áp kDa Đơn vị khối lượng phân tử pH Power of Hydrogen - Độ hoạt động ion H + µM Micro mol mM Mili mol ACE Angiotensin-I-converting enzyme STPP Sodium Tripolyphosphate DHA Docosahexaenoic acid EPA Eicosapentaenoic acid XLD agar TSA Thạch Xylose Lysine Desoxycholate Tryptone casein soy agar DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng Trang 1.1 Hàm lượng chất lượng 1.2 Hàm lượng số acid amin có thịt đỏ cá ngừ 1.3 Hàm lượng chất khống có thịt đỏ cá ngừ 2.1 g thịt đỏ cá ngừ Tỷ lệ bổ sung chất bảo quản vào mẫu nguyên liệu phân bố thời gian lấy mẫu phân tích vi sinh vật 28 3.1 Thành phần khối lượng quan số loại cá ngừ 33 3.2 Tính cảm quan mẫu dịch đạm mức pH khác 41 3.3 Kết phân tích thành phần hóa học dịch thủy phân 46 3.4 Kết phân tích thành phần acid amin dịch thủy phân 46 3.5 Kết phân tích tiêu vi sinh vật dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ 48 - Dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 7,0: Cho vào bình nón dung tích 100ml : 20 ml dung dịch đệm pH = 7,0 0,1ml dung dịch thị hỗn hợp, dung dịch có màu xanh mạ; - Dung dịch đệm pH = 9,2: Cân xác 1,9018g natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) hịa tan bình định mức dung tích ml, thêm nước cất đến vạch mức; - Dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 9,2: Cho vào bình nón dung tích 100ml : 20ml dung dịch đệm pH = 9,2, 1ml dung dịch thị hỗn hợp Dung dịch có màu tím 2.2.2 Tiến hành Cân xác 10 – 15g mẫu thử cho vào cốc thủy tinh dung tích 100ml Dùng nước cất hịa tan mẫu chuyển tồn (cả nước tráng cốc) vào bình định mức dung tích 25 ml, thêm nước cất đến khoảng ml Sau đó, lắc phút, để yên phút, lặp lại lần Thêm nước cất đến vạch mức, lắc lọc Dùng pipet lấy xác 20ml dịch lọc vào bình nóng dung tích 250ml, thêm 1ml dung dịch thị hỗn hợp, trung hòa dịch lọc dung dịch có màu giống dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 7, Sau dùng buret cho thêm ml dung dịch foocmon trung tính 30% vào đậy nút bình lại, lắc đều, để yên phút Chuẩn độ dung dịch natri hydroxyt ,1N dung dịch có màu giống dung dịch màu tiêu chuẩn pH = 9,2 Tiến hành xác định mẫu trắng với tất lượng hóa chất bước thử nghiệm trên, thay dịch mẫu thử ml nước cất.[TCVN] 2.2 Tính kết Hàm lượng nitơ-amoniac (X10) tính phần trăm theo công thức: X10 = (V1  V2 )  0,0014  250  100 20  m Trong V1 – Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu thử, tính ml; V2 – Thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn chuẩn độ mẫu trắng, tính ml; m – Khối lượng mẫu thử, tính g; 0,0014 – Số g nitơ tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0,1N; 250 - Thể tích tồn dịch lọc, tính ml; 20 – Thể tích dịch lọc để xác định, tính ml; 100 – Hệ số tính phần trăm Mức độ thủy phân (H) protein tác dụng enzyme tính theo cơng thức sau: H N AA  N AA0 N OA  N AA0  100% Trong đó, NOA – Ni-tơ tổng, % xác định phương pháp jeldahn NAAo- Ni-tơ amin nguyên liệu chưa thủy phân, xác định phương pháp chuẩn độ fooc-môn NAA- Hàm lượng ni-tơ amin sau thủy phân, xác định phương pháp chuẩn độ fooc-môn 2.3 Định lượng tổng số vi sinh vật - Phương pháp đếm khuẩn lạc theo tiêu chuẩn TCVN 4884 : 2005 - Nguyên tắc Đồng nhất, pha loãng mẫu thành nồng độ xác định Chuyển thể tích xác định độ pha loãng đồng vào môi trường nuôi cấy, đ a môi trường sau cấy mẫu ủ 20 – 220C 300C ngày Đếm tất khuẩn lạc xuất đ a, vào độ pha lỗng thể tích cấy để qui tổng số vi sinh vật đơn vị khối lượng mẫu thực phẩm - Tiến hành: Cân xác 10.0g mẫu vào bao PE điều kiện vô trùng Thêm 90 ml dung dịch pha loãng Saline Pepton Water Đồng mẫu để thu dung dịch mẫu có độ pha loãng 10-1, chuyển ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha loãng Saline Pepton Water , Tiếp tục để thu dung dịch mẫu với độ pha loãng 10-2; 10-3; 10-4 … Chọn hai hay ba độ pha loãng liên tiếp cho ml chứa 25-250 tế bào vi sinh vật để cấy Dùng pipet vô trùng chuyển ml dịch mẫu pha loãng chọn vào đ a petri vơ trùng Mỗi nồng độ cấy vào hay đ a Sau cấy, đổ vào đ a -15 ml môi trường Plate Count Agar đun chảy để ổn định 450C.Trộn dịch mẫu với môi trường cách lắc trịn đ a petri xi ngược chiều kim đồng hồ, chiều 3-5 lần sau đổ môi trường Đặt đ a mặt phẳng ngang cho agar đông đặc Lật ngược ủ đ a tủ ấm nhiệt độ 30,01,00C thời gian 72 Đếm tất số khuẩn lạc xuất đ a sau ủ Chọn đ a có số đếm từ 25 đến 25 để tính kết Số lượng tổng số vi sinh vật gam mẫu tính sau A N (CFU/g) n1  V1  f1    ni  Vi  f i Trong A: số lượng vi sinh vật gam mẫu N: tất khuẩn lạc đếm đ a chọn ni: số lượng đ a cấy độ pha lỗng thứ i V: thể tích dịch mẫu cấy vào đ a fi độ pha loãng tương ứng 2.4 Định tính Salmonella + Tiền tăng sinh Cân 25g mẫu túi vô trùng, Thêm 225ml nước peptone đệm, đồng mẫu Thời gian đồng mẫu (15 30 giây) tùy thuộc vào loại thực phẩm Ủ 37,00C1,00C/18-24 + Tăng sinh: Trộn canh thang tiền tăng sinh trước chuyển 0,1ml sang ml canh thang tăng sinh chọn lọc Rappapport-vassliadis soya pepton Trước cấy mẫu, canh thang tăng sinh phải ủ ấm đến nhiệt độ 420C, nhiệt độ yếu tố quan cho việc tăng sinh tối ưu Ủ mẫu bể điều nhiệt 42,00C 0,20C trong18-24h (có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 thấy cần thiết) + Cấy đọc kết đ a: Dùng khuyên cấy tròn ria dịch mẫu từ canh thang tăng sinh lên đ a thạch XLD thạch Brilliant green-phenol red để tạo khuẩn lạc riêng rẽ Ủ 37,00C1,00C khoảng 18-24 Trên thạch XLD: Khuẩn lạc điển hình suốt, nhuốm đỏ, tâm đen, thường có vùng đỏ hồng bao quanh, đặc biệt Salmonella phát triển mạnh Trên thạch Brilliant green-phenol red: Khuẩn lạc điển hình trong, có vùng đỏ hồng bao quanh + Khẳng định: Khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella phải kiểm tra sinh hóa kháng huyết Từ môi trường phân lập (XLD hay thạch Briliant green-phenol red) cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc (TSA) ủ 37,00C 1,00C khoảng 18-24 + Khẳng định thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm mơi trường TSI hay KIA: Dùng kim cấy nhọn cấy vi sinh vật làm vào phần nghiêng phần sâu môi trường Ủ 37,0 1,00C khoảng 18-24 Nắp ống nghiệm không nên vặn chặt để trì tình trạng hiếu khí tránh lượng H2S ứ đọng nhiều Sau nuôi cấy, Salmonella chuyển pH môi trường sang kiềm phần nghiêng (màu đỏ) sang acid phần sâu (màu vàng), có hay khơng có H2S (xuất vệt màu đen môi trường) Khẳng định thử nghiệm kháng huyết Thử nghiệm kháng huyết phải tiến hành song song với mẫu trắng (dung dịch nước muối sinh lý) nhằm loại trừ khả ngưng kết giả Dùng kháng huyết Salmonella polyvalent O Salmonella polyvalent H Trình bày kết quả: Khơng có (hoặc có) Salmonella phát 25g mẫu 2.5 Định lượng Staphylococcus Tiến hành: Xử lý pha loãng mẫu: Cân 10,0 0,1 gram mẫu túi vô trùng, thêm 90 ml dung dịch pha loãng, đồng máy dập mẫu khoảng 30 giây Chuẩn bị dãy pha loãng thích hợp tùy theo mức nhi m loại mẫu cho cấy thể tích xác định lên đ a BP sau ủ có khoảng