Nghiên cứu quá trình tự phân (Autolysis) protein thịt đỏ cá ngừ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA  TRẦN TRUNG THANH BÌNH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN (AUTOLYSIS) PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ Chuyên Ngành Mã Ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC : 60420201 TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2018 Cơng trình hồn thành TRƯƠNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Người hướng dẫn khoa học: TS BÙI XUÂN ĐÔNG Phản biện 1: PGS TS Trần Thị Xô Phản biện 2: PGS TS Trương Thị Minh Hạnh Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Kỹ thuật Công nghệ sinh học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 13 tháng 10 năm 2018 Có thể tìm hiểu luận văn tại:  Trung tâm Học liệu, ĐHĐN Trường Đại học Bách khoa  Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Việt Nam quốc gia mạnh xuất thủy sản, sản lượng thủy sản năm 2012 đạt 6,13 tỷ USD, năm 2013 – khảng 5,9 triệu tấn, … cá ngừ mặt hàng chủ lực Hiện nay, nước có 100 doanh nghiệp chế biến cá ngừ với sản lượng nguyên liệu ước tính khoảng 91.356 (số liệu tính tới tháng năm 2015) Theo ước tính Hiệp hội chế biến cá ngừ (Vinatuna) sản lượng chế biến tiêu thụ cá ngừ hàng năm đạt 200.000 tấn, với kim ngạch xuất đạt 400 triệu USD/năm, mặt hàng hải sản xuất Việt Nam sau cá Tra tôm [4] Các sản phẩm xuất chủ lực cá ngừ đông lạnh (sashima), cá ngừ đóng hộp dầm dầu, cá ngừ xơng khói, xúc xích cá ngừ, Các phụ phẩm từ quy trình chế biến cá ngừ (đầu cá, xương cá, da cá, ruột cá, thịt đỏ, ) xác định nguồn protein quan trọng để sản xuất mặt hàng có giá trị gia tăng Nguồn phụ phẩm thịt đỏ cá ngừ bị loại bỏ chiếm 7-12% trọng lượng cá ngừ nguyên con, chưa quan tâm nghiên cứu để chế biến [3] Trong đó, nước chưa có cơng trình nghiên cứu cách có hệ thống giải vấn đề tận thu lượng protein giá trị từ thịt đỏ sản xuất cá ngừ để tạo sản phẩm thực phẩm giá trị gia tăng Trong nhiều năm qua, kĩ thuật phát triển việc khai thác thu hồi sản phẩm có giá trị sinh học cao [21] phân bón, thức ăn gia súc, thức ăn thủy sản Ngoài ra, dịch thủy phân protein ứng dụng nhiều ngành công nghiệp [21] Gần đây, dịch thủy phân protein từ nguyên liệu thủy sản trở nên phổ biến ngành công nghiệp thực phẩm hàm lượng protein cao [34] Việc thủy phân protein làm giảm kích thước peptide, dịch thủy phân nguồn acid amin tự do, sử dụng trực tiếp cho sinh tổng hợp protein [26] Trong phương pháp hóa học, số hóa chất áp dụng để thủy phân phụ thủy sản, ví dụ HCl 1M, sodium sulfite, NaOH KOH [26] Tuy nhiên, việc sử dụng acid mạnh base mạnh để thủy phân protein nguyên nhân tạo sản phẩm phụ có tác hại với mơi trường Vì vậy, thực thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ theo phương pháp enzyme có nhiều thuận lợi việc kiểm sốt q trình thủy phân giảm thiểu phản ứng không mong muốn, giảm ô nhiễm môi trường, nhiên việc dùng enzyme thương mại cịn đắt đỏ dẫn tới chi phí sản xuất cao Bên cạnh đó, q trình thủy phân protein thực cách tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động protease/proteinase nội có thịt đỏ cá ngừ [10] Bởi vì, người ta chứng minh, thịt đỏ cá ngừ, cathepsin – proteinase hoạt động môi trường acid, hoạt độ mạnh đạt pH=2,0-5,0 Cathepsin enzyme nội bào, có vai trị quan trọng trình tự phân hủy thịt thủy hải sản, trình tự thủy phân diễn mạnh mẽ điều kiện thích hợp[14] Từ luận giải khoa học đây, mục tiêu luận văn đưa nghiên cứu khả thủy phân thịt đỏ cá ngừ enzyme protease nội để thu dịch đạm tinh chế Từ đó, tìm giải pháp kĩ thuật để chế biến thịt đỏ cá ngừ để tạo sản phẩm có giá trị kinh tế, góp phần làm giảm hao tổn nguyên liệu cá ngừ sau thu hoạch Mục đích nghiên cứu Đề tài tiến hành nhằm mục đích sau đây: - Xác định khối lượng thành phần hóa học thịt đỏ cá ngừ - Nghiên cứu trình bất hoạt vi sinh vật mẫu nguyên liệu phương pháp vật lí hóa học - Khảo sát mức độ thủy phân protein nguyên liệu tác dụng hệ enzyme calpain, cathepsin collagenase - Đề xuất quy trình cơng nghệ thu hồi dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ sở kích hoạt hệ enzyme protease nội - Đánh giá chất lượng dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ để định hướng sử dụng Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu: - Cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa cá ngừ mắt to thu mua từ Cảng Cá Thọ Quang, TP Đà Nẵng dùng để xác định khối lượng thịt đỏ - Hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ lấy mẫu từ nhà máy đồ hộp Hạ Long, Đà Nẵng Nguyên liệu xay nhỏ máy xay (Luxta, Việt Nam) lựa chọn sàng phân loại có đường kính lỗ sàng 3,0 - 3,5 mm Sau đó, nguyên liệu chia nhỏ thành khối (100 gram/khối) lưu trữ -20°C ± 2°C phục vụ nghiên cứu 3.2 Phạm vi nghiên cứu - Sử dụng thịt đỏ cá ngừ thu mua thành phố Đà Nẵng làm chất để nghiên cứu phản ứng tự thủy phân xúc tác enzyme protease nội - Nghiên cứu thực quy mô PTN Phương pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp vật lý Xác định nhiệt độ bảo quản, rã đông nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ Xác định nhiệt độ tiến hành phản ứng tự thủy phân nhiệt độ bất hoạt enzyme vi sinh vật sau phản ứng 4.2 Phương pháp hóa lý Xác định độ pH hỗn hợp nguyên liệu trước phản ứng, pH hỗn hợp phản ứng pH dịch đạm thu sau phản ứng tự thủy phân protein 4.2.1 Phương pháp hóa sinh - Xác định hàm lượng protein - Xác định hàm lượng lipid - Xác định hàm lượng nước - Xác định hàm lượng tro - Xác định hàm lượng ni-tơ amin - Xác định thành phần hàm lượng acid amin dịch đạm thủy phân 4.2.2 Phương pháp vi sinh - Xác định mối nguy lây nhiễm vi sinh vật có hại dịch đạm thủy phân 4.2.3 Phương pháp xử lý số liệu - Kết thí nghiệm độ lệch chuẩn (SD) xử lý tính tốn chương trình Microsoft Excel 2010 ngh a khoa học th c ti n đề tài nghiên cứu 5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài - Làm sở khoa học cho việc định hướng khai thác sử dụng hiệu nguồn thịt đỏ cá ngừ để sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng dịch đạm, bột đạm dinh dưỡng địa bàn Quảng Nam - Đà Nẵng - Xác định điều kiện thích hợp để thu nhận dịch thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ đạt yêu cầu chất lượng 5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài - Tận dụng nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ từ nhà máy, công ty chế biến thủy sản địa bàn thành phố Đà Nẵng để sản xuất sản phẩm giá trị gia tăng, nhằm tăng doanh thu cho doanh nghiệp chế biến cá ngừ - Quy trình thu hồi dịch thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ dễ áp dụng thực tiễn để chuyển giao cho công ty hoạt động lĩnh vực chế biến cá ngừ có nhu cầu Bố cục luận văn Luận văn gồm chương mục sau: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu dịch thủy phân protein Xét theo khía cạnh cơng nghệ, bột gia dinh dưỡng sản xuất cách cô đặc sấy khô dịch đạm thủy phân, chất lượng chất lượng phụ thuộc nhiều vào chất lượng dịch đạm thủy phân Gần đây, dịch đạm thủy phân (DPH) từ nguyên liệu thủy sản dần trở nên phổ biến ngành công nghiệp thực phẩm nhờ giá trị dinh dưỡng cao (Trần Thị Bích Thủy cs, 2015) trình thủy phân làm giảm kích thước protein tạo peptide, axit amin giúp thể sinh vật dễ dàng sử dụng để sinh tổng hợp protein (Herpendi et al, 2011) Hai phương pháp ứng dụng phổ biến để sản xuất dịch đạm thủy phân phương pháp hóa học phương pháp sinh học Phương pháp hóa học sử dụng số hóa chất thủy phân phụ phẩm thủy sản chứa protein, ví dụ HCl 1M, sodium sulfite, NaOH, KOH,…So với phương pháp hóa học, phương pháp sinh học (sử dụng enzym thủy phân) có nhiều ưu (Herpendi et al, 2011) 1.2 Giới thiệu nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ Nhiều nhà khoa học chứng minh, thịt đỏ cá ngừ thích hợp dùng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất bột gia vị dinh dưỡng Theo nghiên cứu đánh giá Viện Nghiên cứu Hải sản Ấn Độ, thịt đỏ cá ngừ chứa 26-28% protein, 4-5% chất béo, tro khoảng 1%, thịt đỏ cá ngừ chứa hầu hết axit amin thiết yếu phát triển trì mơ cơ, axit amin thiết yếu chiếm 49-52% tổng lượng axit amin, axit béo khơng bão hịa đa nối đơi chiếm 65% tổng lượng axit béo Sự khác biệt thịt đỏ với thịt trắng chỗ, thịt đỏ chứa hàm lượng glycogen, lipid, mioglobin, sắt (75% sắt Hem) chytocrome C cao thịt trắng 1.3 Tổng quan enzyme nội - Hệ enzyme protease quan trọng cathepsin (là enzyme thủy phân nằm lysosome) Lysosome chứa 13 loại cathepsin bao gồm cathepsin A, B, C, D, H L Trong số enzyme cathepsin quan trọng cathepsin D tham gia vào trình thủy phân protein nội tế bào tạo thành peptide - Hệ enzyme protease calpain bao gồm µ-calpain, m-calpain chất ức chế nội sinh calpastatin Vai trò calpain trình tự thủy phân thịt giống loại protease khác, calpain có khả phân cắt protein ống nghiệm lẫn thể sống - Collagenase enzyme có khả thủy phân liên kết peptit dạng poly-L prolin đặc trưng vùng xoắn collagen trạng thái tự nhiên chất khơng biến tính Trong đó, protein khác có thủy phân hạn chế collagen tự nhiên phần cuối chuỗi xoắn có ngồi vùng xoắn đặc trưng collagen, khơng có khả công liên kết vùng xoắn collagen [16] 1.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến trình t phân - Trong phạm vi nhiệt độ định, tốc độ phản ứng tăng lên với tăng nhiệt độ Nhưng vượt phạm vi đó, phản ứng enzyme xúc tác bị ảnh hưởng biến tính phân tử protein-enzyme Nhiệt độ 30-450C thích hợp cho q trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ [8] - Sự phân li khác phân tử protein giá trị pH khác làm thay đổi tính chất trung tâm liên kết chất hoạt động phân tử enzyme Dẫn đến giá trị xúc tác khác phụ thuộc vào giá trị pH Như enzyme nhạy cảm với thay đổi pH môi trường - Muối nguyên liệu quan trọng trình thủy phân Lượng muối cao gây ức chế hoạt động enzyme (5%) [1] - Muốn phản ứng xảy nhanh phải có tiếp xúc tốt enzyme chất Trong nghiên cứu nhóm nghiên cứu tiến hành xay cá trước tiến hành siêu âm cho hiệu tốt - Cá tươi chế biến chất lượng tốt cá ươn [10] Cá ươn chứa nhiều vi sinh vật gây thối cá tươi, phản ứng thủy phân xảy vi sinh vật gây thối hoạt động nhiều làm cho dịch thủy phân có màu đen, mùi khơng mong muốn [10] 1.5 Lịch sử vấn đề nghiên cứu - Một số nghiên cứu liên quan tới vấn đề đặt luận văn thực điều kiện nước sau: Theo Nguyễn Trọng Cẩn sản xuất dịch đạm thủy phân từ nguyên liệu cá cách sử dụng Aspergillus Orizae vi khuẩn Năm 1997, Vũ Xuân Dũng thực nghiên cứu “Phân lập, lựa chọn chủng vi khuẩn chịu kiềm, chịu mặn, chịu nhiệt có hoạt tính protease cao thăm dị khả ứng dụng vào q trình sản xuất nước mắm ngắn ngày” Trong cơng trình “Nghiên cứu tách chiết protein từ thịt đỏ cá ngừ phương pháp điều chỉnh pH” (2012) Phạm Thị Hiền đưa ảnh hưởng pH, nhiệt độ, thời gian chiết, tỷ lệ dung môi nguyên liệu lên hiệu tách chiết protein từ thịt đỏ cá ngừ Cũng năm 2012 cơng trình “Sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng protease thương mại” Nguyễn Thị Mỹ Hương đưa sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng enzyme Protamex 0,5% nhiệt độ 45oC pH tự nhiên thời gian với tỉ lệ nước/nguyên liệu 1:1 Năm 2013, Lý Thị Minh Phương cơng trình “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm dịch thủy phân từ thịt hàu biển dùng thực phẩm” Năm 2014, Nguyễn Thị Mỹ Hương nghiên cứu “Thành phần dinh dưỡng sản phẩm thủy phân từ đầu xương cá chẽm (Lates calcarifer) enzyme Flavourzyme” tiến hành thủy phân đầu xương cá chẽm (Lates calcarifer) enzyme Flavourzyme v Năm 2016, cơng trình “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protamex để thủy phân cá trích (Sardinella Gibbosa) thu dịch đạm” Trần Thị Bích Thủy đưa điều kiện thủy phân thích hợp để thu dịch đạm giàu acid amine từ protein cá trích enzyme Protamex - Một số nghiên cứu giới Ling Lin Liu cộng (1979) sản xuất dịch đạm thủy phân từ cá enzyme pepsin thô chiết từ dày lợn [32] Ở Anh, J.Y.Imm C.M.Lee (1999) nghiên cứu sản xuất bột gia vị thủy sản từ cá tuyết Urophycis chuss enzyme thủy phân [27] Ở Pháp, Guerard F (2002) ứng dụng công nghệ enzyme sản xuất dịch đạm thủy phân từ phế thải nhà máy sản xuất cá hộp Ở Mỹ, Le Blanc cs (2005) thủy phân cá ngừ (Katsuobushi oligopeptide – KO) làm tăng hương vị bột gia vị sử dụng để thay muối thực phẩm đồ uống [31] Ở Malaysia, S.Y.YU, L.K.Tan sử dụng enzyme alkalase 0.61 để sản xuất dịch đạm thủy phân từ cá rô phi Oreochromis mossambicus [45] Từ kết nghiên cứu cho thấy, cơng nghệ enzyme xúc tác cho q trình chuyển hóa ngun liệu giá trị thấp (cá tạp giá trị, phế phụ phẩm tôm, cá, ) thành loại thực phẩm chức có giá trị cao gấp nhiều lần Dịch đạm thuỷ phân xem nguyên liệu đầu vào cho phát triển sản xuất số sản phẩm giá trị gia tăng bột dinh dưỡng, bột gia vị, tạo nước sốt, súp đặc trưng cho sản phẩm từ thủy sản CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa cá ngừ mắt to tươi, nguyên thu mua từ Cảng Cá Thọ Quang, TP Đà Nẵng dùng để xác định khối lượng thịt đỏ - Hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ lấy mẫu từ nhà máy đồ hộp Hạ Long, Đà Nẵng, nguyên liệu giữ lạnh vận chuyển thùng xốp cách nhiệt phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học – Trường ĐH Bách khoa, ĐH Đà Nẵng 2.2 Dụng cụ máy móc thiết bị Sử dụng thiết bị có phịng thí nghệm Cơng nghệ sinh học trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng: 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp vật lý Xác định nhiệt độ: sử dụng nhiệt kế kiểm tra nhiệt độ trình thực phản ứng enzyme bất hoạt enzyme 2.3.2 Phương pháp hóa lý 10 2.3.4 Phương pháp vi sinh 2.3.4.1 Định lượng tổng số vi sinh vật - Phương pháp: đếm khuẩn lạc theo tiêu chuẩn TCVN 4884 : 2005 2.3.4.2 Định tính Salmonella - Phương pháp: NMKL 71 5th ed 1999 2.3.4.3 Định lượng Staphylococus Phương pháp: NMKL 66 4th ed 2003 2.3.5 Phương pháp cảm quan Dùng phép thử cảm quan để đánh giá chất lượng dịch thủy phân 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu - Số liệu xử lý tính tốn phần mềm Microsoft Office Excel 2010 (giá trị p < 0,05 xem có ý nghĩa mặt thống kê) 2.4 Khảo sát th c nghiệm 2.4.1 ác đ nh thành ph n khối lượng quan cá ngử Cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa, cá ngừ mắt to sau thu mua tách fillet thành phần khác đem cân để xác định tỷ lệ thành phần 2.4.2 ác đ nh thành ph n hóa học hỗn hợp th t đỏ cá ngừ thu gom từ nhà máy Mẫu thịt đỏ cá ngừ hỗn hợp thịt đỏ loại cá ngừ thu gom từ Công ty CP Đồ hộp Hạ Long (Đà Nẵng) phân tích thành phần hóa học thơng qua tiêu: hàm lượng protein, lipid, nước, tro histamin 2.4.3 Nghiên cứu trình bất hoạt vi sinh vật mẫu nguyên liệu phương pháp vật lí hóa học Mẫu ngun liệu thịt đỏ chia thành bao ni lông có khối lượng mẫu 250 gr/một bao Và bổ sung chất bảo quản Kali Sorbat, Natri benzoat, Muối ăn, xử lý tia UV, mẫu đối chứng (không sử dụng yếu tố để bảo quản), sau bảo quản điều kiện -20±20C Mẫu lựa chọn mẫu có lượng tổng số 11 vi sinh vật hiếu khí mức thấp so với mẫu lại 2.4.4 Khảo sát mức độ hoạt động hệ enzyme calpain, cathepsin collagenase nguyên liệu hỗn hợp th t đỏ cá ngừ - Mục đích: Xác định mức độ thủy phân protein hỗn hợp nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ tác dụng hệ enzyme Calpain, Cathepsin, Collagenase Nguyên liệu rã đông, phối trộn với nước theo tỷ lệ 1:1, sau mẫu xử lý siêu âm 15 mẫu để phá vỡ tế bào bất hoạt vi sinh vật có mẫu Các thông số phản ứng lựa chọn dựa nghiên cứu nhà khoa học công bố, cụ thể: hệ enzyme enzyme calpain: tỷ lệ nước:nguyên liệu 1:1; pH = 7,0 ÷ 7,5; nhiệt độ: 350C; thời gian phản ứng 120 phút [41]; Đối với hệ enzyme cathepsin: tỷ lệ nước:nguyên liệu 1:1; pH: 4,0 ÷ 5,0; nhiệt độ: 450C; thời gian: 120 phút [30]; Đối với hệ enzyme collagenase: tỷ lệ nước:nguyên liệu 1:1; pH: 7,0÷7,5; nhiệt độ: 400C; thời gian phản ứng 120 phút [44] Sau trình phản ứng mẫu bất hoạt nhiệt độ t=95±20C [6] sau để nguội đem đánh giá mức độ thủy phân (H) độ tích tụ ni-tơ amin dịch đạm 2.4.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tự thủy phân th t đỏ cá ngừ tác dụng enzyme cathepsin Sau xác định hệ enzyme nội mạnh thịt đỏ cá ngừ cathepsin, nhóm nghiên cứu tiến hành loạt thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng tự phân (phản ứng enzyme) tỷ lệ phối trộn nguyên liệu với nước, pH môi trường phản ứng, thời gian phản ứng Phản ứng enzyme tiến hành máy lắc ổn nhiệt STUART SI500 (Anh) - Để xác định tỷ lệ phối trộn thích hợp nước nguyên liệu theo khối lượng cho phản ứng tự phân, mẫu thí nghiệm tiến hành với tỷ lệ nước: nguyên liệu (w:w) 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, mơ hình thí nghiệm lựa chọn dựa nghiên cứu Bùi Trường Bích Ngân (2013) [10] Các thông số khác phản ứng tự phân 12 cố định nhiệt độ 450C, pH = 4÷5 pH tối ưu cathepsine, thời gian tiến hành thủy phân giờ; Để xác định ảnh hưởng pH mơi trường lên q trình tự phân, nhóm nghiên cứu tiến loạt thí nghiệm với độ pH khác 3, 4, 5, Các thông số khác phản ứng tự phân cố định nhiệt độ 450C, thời gian phản ứng giờ, tỷ lệ phối trộn nước:nguyên liệu xác định từ loạt thí nghiệm tiến hành trước 2:1; tiến hành xác định thời gian thích hợp cho q trình tự phân loạt thí nghiệm với thời gian thủy phân khác giờ, giờ, giờ, giờ, giờ, Các thông số khác phản ứng tự phân cố định nhiệt độ 450C, tỷ lệ phối trộn nước: nguyên liệu 2:1, pH=5,0 Các thông số phản ứng xác định dựa độ tích tụ ni-tơ acid amin dịch đạm sau trình thủy phân CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết ác định thành ph n khối lượng quan số loại cá ngừ khu v c Đà Nẵng Bảng 3.1 Trình bày kết xác định thành phần khối lượng quan cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa cá ngừ mắt to khai thác khu vực Đà Nẵng Bảng 3.1 Thành phần khối lượng quan m t số loại cá ngừ STT Phần trăm khối lượng quan so với trọng lượng thể, % Đầu Xương Ruột Fillet Thịt đỏ Da, vây Cá ngừ 21±0,1 12±0, 8±0,01 38±0,1 9.0±0,3 12±0,3 Cá ngừ 23±0,2 sọc dưa 9±0,3 9±0,1 39±0.6 12±0,1 8±0,15 Cá ngừ 22±0,1 13±0, mắt to 7.5±0,7 37±0,5 10.5±0,28 10±0,4 Phân tích kết từ bảng 3.1 nhận thấy rằng, tỷ lệ thịt đỏ cá ngừ mang phân tích dao động khoảng từ 9,0 đến 12%, cá ngừ sọc dưa có tỷ lệ thịt đỏ cao mẫu phân tích, chiếm 12%, cá ngừ có tỷ lệ thịt đỏ thấp nhất, chiếm 9,0%, lại cá ngừ mắt to có tỷ 13 lệ thịt đỏ chiếm 10,5% trọng lượng thể 3.2 Kết ác định thành ph n hóa học hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ thu gom từ nhà máy chế biến thủy sản Hình 3.1 Thành phần h a học ản hỗn hợp nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ Hình 3.1 cho thấy mẫu hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ chứa hàm lượng protein tổng số cao (24%), giá trị tương đương cao so với hàm lượng protein số loài cá số nghiên cứu khác ví cá trích 19,25% [11], hay so với nghiên cứu Bruce, 1924, hay Shigeo, 1958 cao so với mực (17-21%) hàm lượng lipid thấp (0,53%), nên xếp vào loại nguyên liệu (cá) gầy thích hợp cho việc sản xuất dịch đạm thủy phân 3.3 Kết nghiên cứu bất hoạt vi sinh vật mẫu nguyên liệu phương pháp vật lí hóa học Hình 3.2 Trình bày kết khảo sát số lượng vi sinh vật tồn mẫu tác dụng tác nhân vật lý hóa học Hình 3.2 Ảnh hưởng tác nhân vật lí hóa học lên số lượng vi sinh vật mẫu nguyên liệu Phân tích đường biểu đồ nhận thấy, việc sử dụng chất bảo quản có tác dụng ức chế sinh trưởng phát triển vi sinh vật Cụ 14 thể, mẫu đối chứng không dùng chất bảo quản, số lượng vi sinh vật mức cao, dao động mức 3500-4500 CFU/g suốt tuần bảo quản Mẫu nguyên liệu bảo quản muối ăn có số lượng VSV mức trung bình so với mẫu lại, dao động mức 2000-2500 CFU/g mẫu Đối với mẫu xử lý tia UV giai đoạn đầu số lượng VSV giảm rõ rệt, sau lại tăng, nguyên nhân việc xử lý tia UV khơng có tác dụng kéo dài, số lượng VSV tăng nhanh từ tháng thứ trình bảo quản, dao động mức 1000-3500 CFU/g nguyên liệu Hai mẫu bảo quản kali sorbat natri sorbat có tác dụng ức chế phát triển vi sinh vật rõ rệt nhất, tổng số lượng VSV bị hạn chế mức 2000 CFU/g suốt trình bảo quản, việc sử dụng chất bảo quản kali sorbart có tác dụng rõ rệt mạnh ức chế vi sinh vật phát triển Từ thơng số trên, nhóm nghiên cứu sử dụng chất bảo quản kali sorbate cho nghiên cứu 3.4 Kết khảo sát mức độ thủy phân protein nguyên liệu tác dụng hệ enzyme calpain, cathepsin collagenase Hình 3.3 3.4 trình bày kết khảo sát độ tích tụ ni-tơ acid amin mức độ thủy phân protein q trình kích hoạt điều kiện hoạt động tối ưu hệ enzyme nội cathepsine, calpain collagenase Hình 3.3 Đ tích tụ nitơ acid amin dịch đạm thu sau trình tự thủy ph n tác dụng hệ enzyme cathepsin, calpain collagenase 15 Hình 3.4 Mức đ thủy phân protein dịch đạm thu sau trình tự thủy ph n tác dụng hệ enzyme cathepsin, calpain collagenase Kết phân tích đồ thị hình 3.3 cho thấy, độ tích tụ nitơ acid amin dịch đạm thu sau phản ứng tự phân hủy cathepsine cao so với mẫu khảo sát lại tác dụng hệ enzyme calpain collagenase, cụ thể, độ tích tụ nitơ acid amin mức 0,64% Độ tích tụ nitơ acid amin 03 mẫu mức tương đối thấp (0,43÷0,64%) tính đặc đặc hiệu hệ enzyme, phân cắt theo chế endo- mạnh exo- Phân tích số liệu đây, nhóm nghiên cứu tới kết luận, hệ enzyme cathepsine nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ hoạt động mạnh nhất, điều phù hợp với nghiên cứu trước (Aoki et al., 2004; Pangkey et al., 2000) Để kiểm chứng kết khảo sát nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát hoạt độ hệ enzyme protease nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ vùng pH khác môi trường Kết khảo sát trình bày đồ thị hình 3.5 16 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH mơi trường lên hoạt đ hệ enzyme protease thịt đỏ cá ngừ Phân tích kết nghiên cứu đồ thị hình 3.5 cho thấy, hoạt độ protease đạt mức cao vùng pH=4÷5 dao động mức 0,075 đến 0,085 UI/g nguyên liệu Vùng pH phù hợp với khảo sát hệ enzyme cathepsin (hình 3.3 3.4) Từ phân tích luận giải đây, nghiên cứu đến kết luận trình tự thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ xảy chủ yếu tác dụng hệ enzyme cathepsin Từ sở đó, nghiên cứu tiếp tục khảo sát yếu tố liên quan đến q trình kích hoạt hệ enzyme cathepsin, nhằm xác định khả ảnh hưởng yếu tố đến trình tự phân hỗn hợp nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ như: tỷ lệ phối trộn nguyên liêu: nước, pH môi trường phản ứng, thời gian phản ứng 3.5 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng t thủy phân (autolysis) thịt đỏ cá ngừ tác dụng enzyme cathepsin 3.5.1 nh hưởng t lệ phối trộn nguyên liệu: nước Sản phẩm phản ứng thủy phân protein tác dụng enzyme peptid có khối lượng phân tử nhỏ acid amin tự do, nhiều nghiên cứu nước thường đánh giá mức độ phân cắt protein phản ứng enzyme thông qua độ tích tụ nitơ acid amin dịch đạm thủy phân thu sau phản ứng [2] 17 Hình 3.6 Sự phụ thu c đ tích tụ nitơ acid amin dịch đạm thủy ph n vào tỷ lệ phối tr n nguyên liệu nước Phân tích kết nghiên cứu hình 3.6 cho thấy độ tích tụ nitơ acid amin giảm tăng tỷ lệ nước hỗn hợp phản ứng Độ tích tụ nitơ acid amin cao mẫu có tỷ lệ phối trộn nguyên liệu: nước 1:2 So sánh với kết nghiên cứu phần 3.2, trường hợp độ tích tụ nitơ acid amin cao mẫu với tỷ lệ phối trộn 1:2 đạt mức 0,09% (hình 4), thấp so với mẫu tiến hành với tỷ lệ phối trộn nguyên liệu:nước 1:1 đạt mức 0,64% điều kiện phản ứng (hình 3.3) Tuy nhiên, so sánh tiêu cảm quan dịch thủy phân sau lọc nhận thấy, mẫu tiến hành với tỷ lệ phối trộn nguyên liệu:nước 1:2 có nhiều ưu điểm độ đồng cao, dịch có màu vàng mùi vị đặc trưng Ở mẫu tiến hành với tỷ lệ nước cao hơn, trình lọc sau phản ứng thủy phân tiến hành đễ dàng hơn, hàm lượng nước lớn gây khó khăn cho việc đặc sấy dịch đạm để thu bột đạm 3.5.2 nh hưởng p m i trư ng Phân tích kết nghiên cứu thay đổi độ tích tụ nitơ acid amin dịch đạm thủy phân mức pH môi trường phản ứng khác h nh cho thấy, độ tích tụ nitơ acid amin tăng từ 0,031 đến 0,05% pH tăng từ pH=3,0 đến pH=5,0 đạt giá trị cực đại pH= 5,0 đạt mức 0,05%, tiếp tục tăng pH lên mức pH=6,0 độ tích tụ nitơ acid amin khơng tăng mà giảm 18 Hình 3.7 Sự thay đổi đ tích tụ nitơ acid amin dịch đạm thủy ph n mức pH môi trường phản ứng khác Theo nghiên cứu Aoki cộng năm 2004 [15], vùng pH hoạt động hệ enzyme cathepsine đại đa số thủy hải sản nằm khoảng pH=3,0÷5,0, mạnh pH=5,0, hoạt động đến mức pH=7,0 hoạt độ yếu Như vậy, nhóm nghiên cứu xác định độ tích tụ nitơ acid amin cao mẫu tiến hành pH=5,0 phù hợp với kết nghiên cứu nhà khoa học trước đây, đến kết luận chọn pH môi trường phản ứng pH=5,0 để tiến hành phản ứng tự phân hủy thịt đỏ cá ngừ 3.5.3 nh hưởng th i gian phản ứng Hình 3.8 Sự phụ thu c đ tích tụ nitơ acid amin dịch đạm thủy phân vào thời gian phản ứng Kết nghiên cứu hình 3.8 cho thấy, độ tích tụ nitơ acid amin tăng nhanh thời gian phản ứng tăng đạt đạt giá trị cao mẫu 19 tiến hành 7,0 Từ đồ thị hình cho thấy, độ tích tụ nitơ acid amin cao mẫu tiến hành 6,0 7,0 giờ, tương đương mức 0,099% 0,103% dựa vào tính kinh tế nhóm nghiên cứu chọn thời gian 6,0 thời gian tiến hành phản ứng thích hợp cho trình tự phân protein thịt đỏ cá ngừ kéo dài thời gian thủy phân vừa làm tăng chi phí sản xuất tiêu mặt cảm quan dịch đạm bị ảnh hưởng.Vì vậy, dựa vào tính kinh tế ta chọn thời gian làm thời gian thích hợp cho q trình tự phân protein 3.6 Kết thí nghiệm kiếm chứng sản uất thử dịch đạm a b H nh ẫu dịch sản phẩm đạm thủy ph n a –mẫu chưa ly t m mẫu sau ly t m Sau loạt thí nghiệm khảo sát đơn biến yếu tố ảnh hưởng tới trình tự phân protein thịt đỏ cá ngừ tác dụng enzyme cathepsine, để kiểm chứng nhóm nghiên cứu tiến hành thu mẫu điều kiện tối ưu xác định tỷ lệ phối trộn nguyên liệu:nước 1:2, pH môi trường phản ứng pH=5,0, thời gian phản ứng 6,0 giờ, nhiệt độ phản ứng t=450C Mẫu dịch đạm thủy phân thu trước ly tâm sau ly tâm mô tả hình 3.9 Mẫu dịch đạm sau ly tâm (hình 3.9b) dạng lỏng đồng nhất, có màu nâu vàng mùi đặc trưng dịch đạm thủy phân cá ngừ 3.7 Đề uất quy trình cơng nghệ thu hồi dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ cở sở kích hoạt hệ enzyme nội 3.7.1 Nguyên vật liệu Nguyên liệu chính: hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ 20 3.7.2 đ quy trình c ng nghệ Quy trình thu hồi tinh chế dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ dự kiến sơ đồ hình 3.10 Hình 3.10 Quy trình cơng nghệ thu nhận dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ phản ứng tự thủy phân protein 3.7.3 huyết minh quy trình c ng nghệ Thông số công đoạn quy trình cơng nghệ rút từ kết khảo sát Ngồi ra, thơng số công đoạn tinh chế tạo sản phẩm tham khảo từ cơng trình nghiên cứu nhà khoa học nước Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng (1996) [7], Shironina (2015) [35], Ali Bougatef (2012)[17], 3.7.3.1 Siêu m phá mẫu Mẫu nguyên liệu xử lý phối trộn với nước theo tỷ lệ 1:2 (nguyên liệu:nước) tiến hành siêu âm 15 phút để phá vỡ màng tế bào diệt vi sinh vật tồn dư 3.7.3.2 hản ứng tự thủy ph n tác dụng hệ enzyme n i Thiết bị phản ứng cần trang bị áo nước (hoặc hơi) cánh khuấy Hỗn hợp nguyên liệu nhào trộn thiết bị phản ứng Sau nỗn hợp khuấy đảo đồng tiến hành nâng nhiệt hỗn hợp lên mức 45 0C Cần giữ ổn định độ pH hỗn hợp pH = 5,0 cách 21 cho thêm HCl 37% Quá trình thủy phân tiến hành nhiệt độ 450C 6,0 3.7.3.3 ất hoạt enzyme Sau trình phản ứng, hỗn hợp gia nhiệt thiết bị phản ứng lên nhiệt độ 95 20C giữ mức nhiệt độ 15 phút Khi tháo sản phẩm phản ứng thủy phân sang thiết bị ly tâm thực khuấy đảo để tránh lắng cặn 3.7.3.4 Ly t m tách ỏ cặn Quá trình ly tâm thực máy ly tâm đứng Model Rotanta 460R Thông số q trình ly tâm: vận tốc v=2000 vịng/phút, thời gian ly tâm 10 phút nhiệt độ t=300C Sau trình ly tâm, thu dịch đạm loại bỏ bã 3.7.3.5 Trung hịa dịch đạm Q trình thực thiết bị chế tạo vật liệu chịu kiềm chịu acid có trang bị phận khuấy đảo Dịch đạm thủy phân trung hòa dung dịch NaOH 1M đến mức pH=7,2 0,2 Dung dịch trung hòa mang lọc để loại bỏ tủa 3.7.3.6 ảo quản dịch đạm Dịch đạm đóng chai có nắp đậy kín để tránh sâm nhập vi sinh vật bảo quản môi trường nhiệt độ 3÷50C 3.8 Đánh giá chất lượng dịch đạm thu hồi từ thịt đỏ cá ngừ theo quy trình cơng nghệ đề uất 3.8.1 Các tiêu lý-hóa d ch thủy phân th t đỏ cá ngừ Kết phân tích thành phần hóa học dịch thủy phân trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết phân tích thành phần hóa học dịch thủy phân Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết Protein % 3,05 Nước % 90,4 Lipid % Muối % 0.21 22 Kết phân tích thành phần hóa học dịch đạm thủy phân thịt đỏ cá ngừ thu sau trình tự phân tác dụng enzyme cathepsine xác định Nafiqad (Đà Nẵng) cho thấy, hàm lượng protein mẫu dịch đạm thủy phân đạt 3,05%, so sánh với hàm lượng protein xác định hỗn hợp nguyên liệu (24%) ước tính hiệu suất thu hồi đạm phản ứng tự phân 30,12% Ngoài ra, dịch đạm thủy phân chứa lượng nhỏ tro (1,53%) hàm lượng nước mức 90,4% Kết phân tích thành phần acid amin dịch thủy phân trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết phân tích thành phần acid amin dịch thủy phân Kết Kết STT Acid amin STT Acid amin (g/l) (g/l) Lysine 2,15 10 Methionine 1,30 Arginine 1,70 11 Leucine 1,89 Aspartic acid 2,05 12 Tryptophan 0,85 Glutamic acid 2,98 13 Valine 1,38 Tyrosine 1,05 14 Serine 1,01 Glycine 1,71 15 Phenylalanine 0,96 Threonine 0,99 16 Proline 1,15 Alanine 1,50 17 Isoleucine 1,22 Cystein 1,08 18 Histidine 0,64 Phân tích kết phân tích thành phần acid amin dịch thủy phân bảng 1, thấy tổng lượng acid amin đạt 25,61 g/l Dịch đạm thủy phân chứa amin thiết yếu có giá trị cao dinh dưỡng sinh học valine, leucine, isoleucine, methionine, threonine, phenylalanine, tryptophan, lysine, arginine, histidine 23 Hình 3.11 Sắc kí đ H L thu ph n tích thành phần acid amin dịch đạm thủy phân thịt đỏ cá ngừ Hàm lượng histamine tiêu quan trọng để xác định chất lượng dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ để sản xuất bột đạm dinh dưỡng từ nguyên liệu cá ngừ Giới hạn hàm lượng histamine sản phẩm xác định phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC – High performance lipuid chromatography) quy định quy chuẩn EC.2073/2005 không vượt 200 ppm (mg/kg) 3.8.2 Các vi sinh d ch thủy phân th t đỏ cá ngừ Các phân tích vi sinh vật dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết phân tích tiêu vi sinh vật dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ Giới hạn cho Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết phép theo TCVN Tổng số vi sinh vật CFU/ml 3,0 x 10  104 Coliform CFU/ml 3 Escherichia coli CFU/ml 3 Tổng số nấm men, mốc CFU/ml 0,1 x 10  102 Staphylococcus aureus CFU/ml 0,1 x 102  102 Salmonella spp CFU/25ml Âm tính  102 24 Kết phân tích vi sinh vật cho thấy chất lượng dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ cá ngừ phù hợp theo yêu của tiêu chuẩn hành Cụ thể, tiêu Coliforms, Escherichia coli, Staphylococcus aureus mức 10 CFU/ml sản phẩm tổng số vi sinh vật hiếu khí 3,0 x 101 CFU/ml, kết nằm giới hạn cho phép Điều giải thích q trình bảo quản chất bảo quản có tác dụng tiêu diệt ức chế q trình phát triển vi sinh vật sản phẩm CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu luận văn, rút số kết luận sau: - Tỷ lệ thịt đỏ cá ngừ khai thác khu vực biển Đà Nẵng dao động khoảng từ 9,0 đến 12%, cá ngừ sọc dưa có tỷ lệ thịt đỏ cao mẫu phân tích, chiếm 12%, cá ngừ có tỷ lệ thịt đỏ thấp nhất, chiếm 9,0%, cịn lại cá ngừ mắt to có tỷ lệ thịt đỏ chiếm 10,5% trọng lượng thể - Đã xác định thành phần hóa học hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ lấy mẫu từ nhà máy sản xuất đồ hộp Hạ Long sau: hàm lượng protein 24%, lipid 0,51%, nước 65%, tro 2%, thành phần khác chiếm 8,49% - Sử dụng chất bảo quản kali sorbart có tác dụng rõ rệt mạnh ức chế vi sinh vật phát triển, tổng số lượng VSV bị hạn chế mức 2000 CFU/g suốt trình bảo quản để khảo sát - Quá trình tự thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ xảy chủ yếu tác dụng hệ enzyme cathepsin - Thông số phản ứng tự phân protein thịt đỏ cá ngừ xúc tác enzyme protease nội xác định sau: pH môi trường 5,0, nhiệt độ phản ứng 450C, thời gian phản ứng giờ, tỷ lệ phối trộn nguyên liệu: nước 1:2 Khi hiệu suất thu dịch đạm đạt 61,46% ... ch thủy phân th t đỏ cá ngừ Kết phân tích thành phần hóa học dịch thủy phân trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết phân tích thành phần hóa học dịch thủy phân Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết Protein %... nước Sản phẩm phản ứng thủy phân protein tác dụng enzyme peptid có khối lượng phân tử nhỏ acid amin tự do, nhiều nghiên cứu ngồi nước thường đánh giá mức độ phân cắt protein phản ứng enzyme thơng... thủy phân th t đỏ cá ngừ Các phân tích vi sinh vật dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết phân tích tiêu vi sinh vật dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ Giới hạn cho Chỉ tiêu phân