Nghiên cứu quá trình lên men axit xitric từ bả dứa trên môi trường bán rắn sử dụng aspergillus niger

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Cơng trình hồn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHẠM THỊ NGỌC THÙY Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT XITRIC TỪ BÃ DỨA TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN SỬ DỤNG ASPERGILLUS NIGER Phản biện 1: Phản biện 2: Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Đồ uống Mã số: 60 54 02 Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ kỹ thuật họp Đại học Đà Nẵng vào ngày … tháng … năm 2012 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2012 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin-Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng MỞ ĐẦU Mucor piriformis loài Mucor khác Tuy nhiên, A.niger TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Axit xitric ñược sử dụng rộng rãi nhiều ngành kinh tế quốc dân, ñặc biệt công nghiệp thực phẩm chiếm 70% sản lượng loại nấm sợi vi sinh vật ñược lựa chọn ñể sản xuất axit xitric có khả lên men nhiều loại nguyên liệu rẻ tiền cho suất cao [15] axit xitric Nhu cầu axit xitric giới ngày tăng Năm Nước ta nước nhiệt ñới với nhiều trái chủ ñạo ñược 1938, sản lượng axit xitric 10.400 tấn/năm 60 năm sau sản trồng cho suất lớn ñem lại thu nhập cho quốc gia thông qua lượng axit xitric tăng gần gấp 60 lần [3] Năm 2007, sản lượng axit xuất chuối, cam, bưởi, dứa,… Trong đó, dứa loại trái xitric khoảng 1.700.000 tấn/năm [24] Điều khẳng định vai trị trồng dễ dàng sản phẩm ñược xuất tầm quan trọng axit xitric ñời sống người Nhu cầu nhiều, ñặc biệt ñược ưa chuộng nước công nghiệp axit xitric Việt Nam năm khoảng 1000 [3] Mặc dù phát triển Năm 2000, nước ta xuất khoảng 5000 dứa hộp axit xitric có vai trị tầm quan trọng ñời sống người, Năm 2001, xuất khoảng 6000 dứa hộp 1000 nước nước ta chưa quan tâm nhiều Phần lớn lượng axit dứa đặc Năm 2002, xuất khoảng 10.000 dứa hộp xitric ñang phải nhập với giá thành cao, có số nhà 2000 nước dứa đặc Trong đó, dứa đưa vào chế biến máy hóa chất có dây chuyền sản xuất axit xitric với quy mơ nhỏ có 25% phẩm, cịn lại 75% phụ phẩm Như vậy, lượng sản lượng chưa cao Như vậy, vấn ñề lên men axit xitric nước ta phụ phẩm dứa thải từ nhà máy chế biến dứa khơng ngừng cần phải ñầu tư nghiên cứu nhiều ñược tăng lên Hàng năm lượng phụ phẩm nông trường dứa Lên men axit xitric sử dụng vi sinh vật có hai phương pháp lên sở chế biến dứa thải hàng trăm ngàn [6] Phụ phẩm men chìm, lên men (lên men bề mặt) Trong đó, lên men bề mặt phế thải rắn cơng nghiệp chế biến rau nói chung, chế biến mơi trường bán rắn phương pháp đơn giản ñể sản xuất axit dứa nói riêng ñã góp phần gây ô nhiễm môi trường Bã dứa nước ta xitric Đối với nước ñang phát triển nước ta phương từ trước đến chưa sử dụng rộng rãi triệt ñể Tuy nhiên, pháp tỏ hữu hiệu khơng địi hỏi trang thiết bị đại, lượng bã dứa cịn chứa lượng đường, tinh bột, protein, vitamin chi phí lượng, vốn ñầu tư thấp tận dụng ñược sức lao động số chất khống,… thích hợp cho q trình lên men axit xitric dư thừa Lên men bề mặt môi trường bán rắn thật phương Như vậy, tận dụng bã dứa làm nguồn nguyên liệu lên men axit xitric pháp thích hợp cho q trình lên men axit xitric để tận dụng giải pháp ñể xử lý phế thải rắn gây ô nhiễm môi trường nguồn phế liệu rắn ngành công-nông nghiệp nước ta mang lại lợi ích kinh tế Nhiều loại vi sinh vật lên men axit xitric Aspergillus (A.) niger, A.clavarus, Penicillium lutcum, Penicillium citrinum, Xuất phát từ tình hình nói chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu trình lên men axit xitric từ bã dứa môi trường bán rắn sử dụng Aspergillus niger” 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Xây dựng quy trình cơng nghệ lên men axit xitric phương pháp lên men môi trường bán rắn từ nguồn phế liệu dứa 1.1 TỔNG QUAN VỀ AXIT XITRIC ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.1.1 Giới thiệu axit xitric PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1.2 Cấu tạo axit xitric Phương pháp vật lý 1.1.3 Tính chất hóa lý axit xitric Phương pháp hóa học 1.1.3.1 Tính chất vật lý Phương pháp vi sinh 1.1.3.2 Tính chất hóa học Phương pháp lên men axit xitric 1.1.4 Lịch sử phát triển axit xitric Phương pháp toán học 1.1.5 Ứng dụng axit xitric Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.1.5.2 Trong công nghệ sinh học công nghiệp dược phẩm - Việc tận dụng nguồn bã dứa cho lên men xitric làm đa dạng hóa 1.1.5.3 Trong ngành công nghiệp khác nguồn nguyên liệu sản xuất axit xitric, nâng cao hiệu kinh tế 1.1.6 Tính an toàn axit xitric sản xuất, hạ giá thành sản phẩm axit xitric giảm lượng axit 1.2 CÔNG NGHỆ LÊN MEN XITRIC xitric ngoại nhập 1.2.1 Vi sinh vật sử dụng công nghệ lên men xitric - Góp phần giải vấn đề mơi trường, tiết kiệm nguyên liệu, 1.2.2 Nấm mốc Aspergillus niger góp phần nâng cao giá trị kinh tế dứa, tăng thu nhập cho nhà 1.2.2.1 Vị trí phân loại máy chế biến dứa tăng thu nhập cho người trồng dứa 1.2.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa A niger CẤU TRÚC LUẬN VĂN 1.2.2.3 Khả ứng dụng A niger Ngoài phần mở ñầu, kết luận, tài liệu tham khảo phụ lục, luận văn gồm có chương sau : 1.2.2.4 Tác hại A niger ñời sống xã hội 1.2.3 Cơ chế sinh tổng hợp axit xitric Chương 1: Tổng quan 1.2.4 Các phương pháp lên men axit xitric Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 1.2.4.1 Phương pháp lên men men (bề mặt) Chương 3: Kết thảo luận 1.2.4.2 Phương pháp lên men chìm 1.2.5 Các giai đoạn q trình lên men axit xitric yếu tố ảnh hưởng ñến trình lên men bề mặt 1.2.5.1 Chuẩn bị môi trường lên men 1.2.5.2 Lên men axit xitric 1.2.5.3 Xử lý mơi trường lên men thu axit xitric CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU DỨA 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.3.1 Nguồn gốc dứa 2.1.1 Bã dứa 1.3.2 Đặc ñiểm sinh học dứa 2.1.2 Chủng vi sinh vật 1.3.3 Thành phần hóa học dứa 2.1.3 Thiết bị hóa chất 1.3.4 Các giống dứa vùng trồng Việt Nam 2.1.3.1 Thiết bị 1.3.5 Thời vụ trồng thu hoạch dứa 1.3.6 Diện tích trồng sản lượng dứa Việt Nam 2.1.3.2 Hóa chất 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3.7 Đánh giá nguồn phụ phẩm dứa nhà máy chế biến 2.2.1 Phương pháp vật lý dứa xuất Nghệ An 2.2.1.1 Phương pháp xác ñịnh ñộ ẩm bã dứa mơi trường lên men 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AXIT XITRIC Ở VIỆT NAM 2.2.1.2 Phương pháp xác ñịnh VÀ TRÊN THẾ GIỚI lên men 1.4.1 Tình hình nghiên cứu axit xitric giới 2.2.2 Phương pháp hóa học 1.4.2 Tình hình nghiên cứu axit xitric Việt Nam 2.2.2.1 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng ñường tổng pH bã dứa môi trường 2.2.2.2 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng nitơ tổng 2.2.2.3 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng axit xitric bã dứa hàm lượng axit xitric dịch lên men 2.2.3 Phương pháp vi sinh 2.2.3.1 Khảo sát thời gian nhân giống A niger 2.2.3.2 Khảo sát mật ñộ tế bào A niger 2.2.4 Phương pháp lên men axit xitric 2.2.4.1 Chuẩn bị môi trường lên men axit xitric 2.2.4.2 Tiến hành lên men axit xitric 2.2.4.3 Xử lý thu dịch sau lên men axit xitric 2.2.5 Phương pháp toán học CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN trình bày mục 2.2.1, chương 2, chúng tơi thu kết 3.1 KHẢO SÁT MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1 Một số thành phần hóa học bã dứa BÃ DỨA Thành phần 3.1.1 Khảo sát hàm lượng ñường tổng bã dứa Hàm lượng (%) Độ ẩm 81,27 dựng ñường chuẩn ñường D-glucoza ñược trình bày mục 2.1.1, pH 4,13 phụ lục Kết xây dựng ñường chuẩn đường D-glucoza Đường tổng 23,25 (% chất khơ) Nitơ tổng 0,84 (% chất khô) Axit xitric 0,37 (% chất khơ) Để xác định hàm lượng đường tổng, chúng tơi tiến hành xây trình bày Bảng 3.2, phụ lục biểu diễn Hình 3.1 Tiến hành xác ñịnh hàm lượng ñường tổng bã dứa trình bày cách tiến hành phần B, mục 2.2.2.1, chương Từ kết ño OD, chúng tơi tính hàm lượng đường tổng bã 3.2 CHUẨN BỊ GIỐNG NẤM MỐC A NIGER dứa 23,25 (% chất khơ), trình bày mục 3.3, phụ lục 3.2.1 Khảo sát thời gian nhân giống A niger 3.1.2 Khảo sát hàm lượng axit xitric bã dứa Chúng tiến hành khảo sát hàm lượng axit xitric bã dứa theo quy trình trình bày mục 2.2.2.3, chương Trong trình nhân giống, thấy sau 24 nuôi A niger thấy bề mặt xuất màng nấm sợi có màu trắng Sau 48 bề mặt thạch ñã bắt ñầu hình thành bào tử màu ñen Để xác ñịnh hàm lượng axit xitric bã dứa, chúng tơi tiến Sau 72 bào tử hình thành dày ñặt bề mặt thạch Sau 84 hành xây dựng đường chuẩn axit xitric trình bày mục xuất bào tử hình thành ăn sâu vào bên thạch sau 92 2.3.1, phụ lục Kết xây dựng đường chuẩn axit xitric trình phần bào tử già ñi ñã rơi khỏi mặt thạch Do đó, chúng tơi bày Bảng 3.3, phụ lục biểu diễn Hình 3.2 chọn thời gian thích hợp cho q trình nhân giống 72 Với Tiến hành xác ñịnh hàm lượng axit xitric bã dứa trình bày cách tiến hành phần B, mục 2.2.2.3, chương Từ kết đo OD, chúng tơi tính ñược hàm lượng axit xitric bã thời gian nhân giống 72 giờ, kết phù hợp với nghiên cứu S.Anwar cộng [16] Ống giống ñược giữ 3-50C cấy chuyền ñịnh kỳ tháng dứa 0,37(% chất khơ), trình bày mục 3.6, phụ lục lần nhằm đảm bảo tính chất khơng bị biến đổi để thuận lợi cho 3.1.3 Đánh giá kết số thành phần hóa học bã dứa nghiên cứu Bã dứa thu từ nhà máy chế biến dứa xuất Nghệ An sau trình xử lý tiến hành khảo sát số thành phần hóa học đường tổng, axit xitric số tiêu khác theo phương pháp 10 3.2.2 Khảo sát mật ñộ tế bào A niger ñược mật ñộ tế bào nấm mốc A niger mơi trường ni cấy Để đáp ứng yêu cầu mật ñộ tế bào giống nấm mốc mức pha loãng 10-6 I = 8,1x107 CFU/ml Kết đảm bảo cho trình lên men, mật ñộ giống phải ñạt I ≥ 7,5x107 CFU/ml [15] Chúng q trình lên men đạt hiệu I ≥ 7,5x107 CFU/ml [15] tơi tiến hành khảo sát mật ñộ tế bào giống ñể bổ sung vào 3.2.3 Xác ñịnh mối tương quan OD mật ñộ tế bào trình lên men phương pháp xác ñịnh gián tiếp số lượng tế A niger bào cách đếm khuẩn lạc phát triển mơi trường thạch Trong q trình nghiên cứu, chúng tơi tiến hành nhiều mẫu thí trình bày mục 2.4, phụ lục Mật ñộ khuẩn lạc nấm mốc A nghiệm lên men axit xitric cần cấy A niger với tỷ lệ 2x107 tế niger mức pha lỗng khác thể Hình 3.5 bào/g bã dứa khô [15] Tuy nhiên, theo thời gian mật độ tế bào giống thay đổi, để ñảm bảo ñộ xác mẫu thí nghiệm chúng tơi phải kiểm tra lại mật độ tế bào giống bổ sung vào môi trường Việc kiểm tra mật ñộ tế bào giống tốn nhiều thời gian, chúng tơi tiến hành xác định mối tương quan ñộ ñục (OD) mật ñộ tế bào giống Như vậy, tiến hành thí nghiệm lên men chúng tơi khơng cần đếm mật độ tế bào giống bổ sung mà cần xác ñịnh OD, từ ñó suy mật ñộ tế bào giống -4 Pha loãng 10 -5 Pha loãng 10 Sau tiến hành hút cấy canh trường vào môi trường thạch, chúng tơi tiến hành đo OD bước sóng 620nm mức độ pha lỗng khác Kết việc ño OD tương ứng với mật ñộ tế bào ñếm ñược ñộ pha loãng khác ñược trình bày mục 3.7, phụ lục Bảng 3.2 Từ kết Bảng 3.2, tiến hành xây dựng ñường chuẩn mật ñộ tế bào giống với trục tung độ đục (OD620nm), trục hồnh mật độ tế bào giống Tìm phương trình biểu diễn đường Pha lỗng 10-6 Pha lỗng 10-7 Hình 3.5 Q trình khảo sát mật độ tế bào A niger Qua 72 kết thúc trình ủ 300C, chúng tơi đếm số lượng khuẩn lạc mọc đĩa thạch mức pha lỗng 10-6 đĩa petri số khuẩn lạc theo thứ tự ñĩa là: 71; 83; 89 Chúng tơi xác định chuẩn dạng: y = a.x + b với y = OD620nm; x = mật ñộ tế bào giống (CFU/ml) hệ số tương quan R2 phần mền Excel Kết xây dựng ñường chuẩn mật ñộ tế bào giống là: y = -0,0036x + 0,2575 (3.1) Đường chuẩn mật ñộ tế bào giống ñược biểu diễn Hình 3.6 11 12 OD 0.3 70 65 60 y = -0.0036x + 0.2575 0.25 R = 0.994 Độ ẩm (%) 0.2 0.15 0.1 0.05 62.1 58.6 54.3 49.2 50 42.5 40 34.5 30 20 0 10 15 20 25 30 35 10 Mật ñộ tế bào giống (CFU/ml ) 0 Hình 3.6 Đồ thị ñường chuẩn mật ñộ tế bào A niger Thời gian lên men (ngày) Như vậy, từ phương trình (3.1) xác ñịnh ñược mật ñộ tế bào giống trước bổ sung vào trình lên men 3.3 KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI ẨM TRONG Q TRÌNH Hình 3.7 Sự thay ñổ ẩm qua ngày lên men Theo mục 2.2.1.1, chương 2, chúng tơi tính lượng nước mẫu qua ngày lên men Bảng 3.3 LÊN MEN Để khảo sát ẩm q trình lên men, chúng tơi tiến Bảng 3.3 Kết ñộ ẩm lượng nước qua ngày lên men hành lên men mẫu thí nghiệm với điều kiện nhau: cân 10g Trước lên bã dứa có bổ sung sacaroza 12%; NH4NO3 0,2%; KH2PO4 0,1%; MgSO4.7H2O 0,05%; MnSO4 0,01% FeSO4.7H2O 0,001%; ethanol 2% (% so với khối lượng bã dứa) Độ ẩm môi trường lên men men Thời Mẫu gian (ngày) 65%, pH ban ñầu 5,5, cấy A niger với tỷ lệ 2x10 tế bào/g bã Sau lên men Lượng Lượng nước nước m1 W1 m2 W2 (g) (%) (g) (%) mẫu, ngày m (g) (g) dứa khơ[15], nhiệt độ lên men 30 C Thời gian lên men tương ứng với mẫu thí nghiệm A1 (1 ngày), A2 (2 ngày), A3 (3 ngày), A4 A1 25 65 23,09 62,1 1,91 1,91 (4 ngày), A5 (5 ngày) A6 (6 ngày) A2 25 65 21,14 58,6 3,86 1,93 A3 25 65 19,15 54,3 5,85 1,95 A4 25 65 17,22 49,2 7,78 1,94 tính tốn độ ẩm thay đổi (W2) trình bày Bảng 3.1, phụ lục A5 25 65 15,22 42,5 9,78 1,96 thể Hình 3.7 A6 25 65 13,36 34,5 11,64 1,94 Cứ sau ngày lên men, lấy mẫu tương ứng với thời gian lên men ñem xác ñịnh ñộ ẩm phương pháp sấy đến trọng lượng khơng đổi trình bày mục 2.2.1.1, chương Kết 13 14 Theo số liệu trình bày Bảng 3.3 cho thấy lượng nước ñi 80 1,91 ñến 1,96 Như vậy, sau ngày lên men ñi lượng 75 nước Để trì độ ẩm mơi trường lên men độ ẩm ban đầu 65% cần bổ sung lượng nước lượng nước ñi bổ sung lượng nước sau ngày lên men, kết phù hợp với báo cáo De Lima [11] Ở kết nghiên cứu này, lên men 10g bã dứa khơ với độ ẩm ban đầu 65% sau ngày lên men cần thêm 1,91-1,96g Hàm lượng axit xitric (g/kg) ngày mẫu thí nghiệm giống nhau, chúng xê dịch từ 72.9 70 68.6 65 61.5 60 54.9 55 50 45 40 nước ñể trì ñộ ẩm ban ñầu Như vậy, tiến hành thí nghiệm lên men ñộ ẩm 65% cần biết khối lượng bã dứa cho lên men tính lượng nước cần bổ sung vào AXIT XITRIC Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến hàm lượng axit xitric tạo thành 3.4 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN LƯỢNG Thời gian lên men (ngày) ngày suốt trình lên men HÀM 73.4 TẠO THÀNH TRONG Kết nghiên cứu cho thấy, hàm lượng axit xitric tạo thành tăng dần từ ngày đầu q trình lên men, từ ngày thứ đến Q TRÌNH LÊN MEN ngày thứ hàm lượng axit xitric tăng lên rõ rệt, tăng từ 54,9 g/kg ñến 3.4.1 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến hàm lượng axit xitric 72,9 g/kg Ở ngày thứ thứ hàm lượng axit xitric tạo thành cao tạo thành ñạt hàm lượng tương ñương 72,9 g/kg 73,4 g/kg Các thí nghiệm tiến hành với điều kiện sau: cố ñịnh hàm lượng bã dứa 40g; sacazoza 12%; NH4NO3 0,2%; KH2PO4 Sang ngày thứ hàm lượng axit xitric tạo thành lại giảm xuống 68,6 g/kg 0,1%; MgSO4.7H2O 0,05%; MnSO4 0,01% FeSO4.7H2O 0,001%; Như vậy, hàm lượng axit xitric tạo thành trình lên men ethanol 2% (% so với khối lượng bã dứa); độ ẩm mơi trường lên men A niger phụ thuộc nhiều vào thời gian lên men Hàm lượng 65%; pH ban ñầu 5,5; cấy A niger với tỷ lệ 2x10 tế bào/g bã axit xitric ñạt kết cao vào ngày lên men thứ thứ dứa khô [15]; nhiệt ñộ lên men 30ºC Khảo sát mốc thời gian lên Tuy nhiên, ñể rút ngắn thời gian lên men có hiệu kinh tế chúng men 4; 5; 6; 7; ngày để theo dõi q trình lên men Kết thí tơi chọn thời gian lên men ngày với hàm lượng axit xitric tạo nghiệm ñược thể Bảng 3.4, phụ lục biểu diễn đồ thị thành 72,9g/kg Hình 3.8 15 16 3.4.2 Ảnh hưởng loại ñường hàm lượng ñường bổ sung sung 12% glucoza ñã cho 66,5g/kg bổ sung 12% fructoza ñã cho ñến hàm lượng axit xitric tạo thành 62,1g/kg Tiếp tục tăng hàm lượng đường lên 16% 20% kết Các thí nghiệm ñược tiến hành với ñiều kiện sau: cố định hàm lượng axit xitric tạo thành khơng không tăng mà hàm lượng bã dứa 40g; NH4NO3 0,2%; KH2PO4 0,1%; MgSO4.7H2O ngược lại cịn giảm đi, chẳng hạn bổ sung 20% sacazoza, axit 0,05%; MnSO4 0,01% FeSO4.7H2O 0,001%; ethanol 2% (% so xitric tạo thành cịn 61,5g/kg với khối lượng bã dứa); độ ẩm môi trường lên men 65%; pH ban So sánh loại đường nghiên cứu đường sacazoza cho kết axit xitric cao ñến glucoza cuối fructoza Khi tiến hành lên men ngày nhiệt ñộ 30ºC Hàm lượng ñường tăng hàm lượng ñường bổ sung hàm lượng axit xitric tạo thành bổ sung thí nghiệm thay ñổi từ 0; 4; 8; 12; 16 ñến 20% (% so tăng lên ñáng kể, ñến hàm lượng ñường bổ sung 12 ñến 16% với khối lượng bã dứa) Kết thí nghiệm thể Bảng cho hàm lượng axit xitric cao tiếp tục tăng hàm lượng 3.5, phụ lục biểu diễn đồ thị Hình 3.9 đường lên 20% axit xitric tạo thành giảm Điều có nghĩa, Hàm lượng axit xitric (g/kg) ñầu 5,5; cấy A niger với tỷ lệ 2x10 tế bào/g bã dứa khơ [15]; 80 lượng đường thấp khơng đủ nguồn cacbon cung cấp cho A niger 70 phát triển hết đường hệ sợi nấm bắt đầu sử dụng ñến axit 60 xitric làm giảm hàm lượng axit xitric tạo thành Cịn nồng độ 50 đường q cao, trình lên men bị ức chế 40 Như vậy, hàm lượng axit xitric tạo thành trình lên men 30 A niger phụ thuộc nhiều vào loại nồng ñộ ban ñầu Sacazoza 20 Glucoza 10 bổ sung hàm lượng sacazoza từ 12 ñến 16% Tuy nhiên, tính ñến hiệu Fructoza 0 12 16 Hàm l ượng ñường bổ sung (%) 20 nguồn ñường bổ sung Hàm lượng axit xitric ñạt kết cao 24 Hình 3.9 Ảnh hưởng loại ñường hàm lượng ñường bổ sung ñến hàm lượng axit xitric tạo thành kinh tế, chọn hàm lượng sacazoza bổ sung 12% với hàm lượng axit xitric tạo thành 73g/kg sau ngày lên men 3.4.3 Ảnh hưởng loại nitơ hàm lượng nitơ bổ sung ñến hàm lượng axit xitric tạo thành Kết nghiên cứu cho thấy, khơng bổ sung đường, A niger Từ kết nghiên cứu mục 3.4.1 3.4.2, tiến hành sử dụng lượng đường có bã dứa hàm lượng axit xitric lên men với mẫu thí nghiệm cố ñịnh thời gian lên men ngày, tạo thành thấp, 12,5g/kg Khi có bổ sung hàm lượng ñường từ hàm lượng ñường sacazoza bổ sung 12%; 40g bã dứa; KH2PO4 0,1%; đến 12% hàm lượng axit xitric tạo thành ñã tăng lên ñáng kể MgSO4.7H2O 0,05%; MnSO4 0,01% FeSO4.7H2O 0,001%; Khi bổ sung 12% sacaroza ñã cho hàm lượng axit xitric 73g/kg; bổ ethanol 2% (% so với khối lượng bã dứa); ñộ ẩm môi trường lên men 17 18 Như vậy, qua nghiên cứu ảnh hưởng loại nitơ hàm lượng dứa khơ [15], nhiệt độ lên men 30ºC Khảo sát hàm lượng nitơ bổ nitơ ñến hàm lượng axit xitric tạo thành, nhận thấy không sung vào môi trường lên men 0; 0,2; 0,4; 0,6% Kết thí nghiệm có hàm lượng nitơ mà cịn tùy thuộc vào loại nitơ bổ sung thể bảng 3.6, phụ lục biểu diễn đồ thị Hình vào mơi trường lên men ñã làm thay ñổi ñến hàm lượng axit xitric tạo 3.10 thành Giữa loại nitơ vô (NH4NO3, (NH4)3PO4) nitơ hữu Hàm lượng axit xitric (g/kg) 65%; pH ban ñầu 5,5; cấy A niger với tỷ lệ 2x107 tế bào/g bã 80 (pepton) khảo sát muối nitơ vơ NH4NO3 cho kết 70 hàm lượng axit xitric tạo thành cao Và việc thiếu, thừa 60 nitơ trình lên men ñều hạn chế tăng trưởng A niger 50 Do đó, việc tăng, giảm khác NH4NO3 0,2%; (NH4)3PO4 0,2% 40 pepton 0,2%, dẫn ñến xáo trộn A niger, làm giảm khả 30 tăng trưởng dẫn ñến giảm hàm lượng axit xitric tạo thành Amoni nitrat Amoni photphat Pepton 20 10 Qua nghiên cứu, chọn kết bổ sung hàm lượng NH4NO3 0,2% ñạt hàm lượng axit xitric tạo thành 73,1g/kg 0 0.2 0.4 Hàm lượng nitơ (%) 0.6 0.8 Hình 3.10 Ảnh hưởng loại nitơ hàm lượng nitơ bổ sung ñến hàm lượng axit xitric tạo thành Kết nghiên cứu cho thấy, không bổ sung hàm lượng nitơ 3.5 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐỒNG THỜI CỦA BA YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT XITRIC 3.5.1 Chọn điều kiện thí nghiệm 3.5.2.Tính hệ số b 3.5.3 Kiểm tra ý nghĩa hệ số b phương trình (3.2) vào mơi trường lên men hàm lượng axit xitric tạo thành Phương trình hồi qui có dạng: 48,2g/kg Bổ sung NH4NO3 0,2% hàm lượng axit xitric tạo thành ñã Ỹ = 74,225+ 1,0827x1 -0,761x2 – 1,071x3 (3.5) tăng ñến 73,1g/kg Nhưng tiếp tục bổ sung hàm lượng NH4NO3 lên 3.5.4 Kiểm tra tương thích phương trình (3.5) với 0,4; 0,6 hàm lượng axit xitric khơng khơng tăng mà ngược thực nghiệm lại giảm dần, bổ sung NH4NO3 0,6% hàm lượng axit 3.5.5.Tối ưu hóa thực nghiệm xitric giảm xuống 50,7g/kg Khi bổ sung (NH4)3PO4 0,2% Từ kết bước chuyển ñộng δ j Bảng 3.9, tổ hàm lượng axit xitric tạo thành ñạt 70,2g/kg, bổ sung pepton 0,2% chức thí nghiệm leo dốc, xuất phát từ tâm thực nghiệm theo hướng ñã hàm lượng axit xitric tạo thành thấp hơn, ñạt 67,4g/kg Tương tự chọn Kết ñược biểu diễn Bảng 3.10 bổ sung hàm lượng NH4NO3, bổ sung hàm lượng (NH4)3PO4 pepton lên 0,4; 0,6 hàm lượng axit xitric tạo thành giảm dần 19 20 Bảng 3.10 Kết thí nghiệm theo hướng dốc ñứng bã nho ñạt 92g/kg; Shankaranand Lonsane (1992) lên men cám Thí nghiệm Các yếu tố ảnh hưởng Hàm mục tiêu Z1 (ngày) Z2 ( %) Z3 ( %) Y 12 0,2 73,065 5,5 13 0,25 76,303 14 0,3 78,217 4,5 15 0,35 74,152 16 0,4 72,473 (TN tâm) lúa mì đạt 72g/kg [17] Võ Thị Hạnh lên men bã mía đạt 80g/kg bã khoai mì đạt 98g/kg [3] 3.6 ĐỀ XUẤT QUI TRÌNH CƠNG NGHỆ LÊN MEN AXIT XITRIC TỪ BÃ DỨA TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN SỬ DỤNG A NIGER Ở QUI MÔ PTN 3.6.1 Quy trình cơng nghệ lên men axit xitric quy mơ PTN Bã dứa Sấy (600C) Qua thí nghiệm leo dốc, kết nhận thí nghiệm cao với hàm lượng axit xitric tạo thành 78,217 (g/kg), ứng với hàm lượng ñường bổ sung 14% sacazoza, hàm lượng nitơ bổ sung Nghiền 0,3% NH4NO3 thời gian lên men ngày Theo nghiên cứu tác giả Kareem cộng sự, sau ngày lên men vỏ dứa có bổ sung sacazoza 15%, NH4NO3 0,25% ñã cho hàm lượng axit xitric 60,6g/kg vỏ dứa khô [15] So sánh kết Sacaroza 14%, NH4NO3 0,3%, khống Chuẩn bị mơi trường lên men (W=65%; pHbđ=5,5) nghiên cứu chúng tơi tác giả Kareem có chênh lệch, nghiên cứu cho kết cao Nhưng so sánh Tiệt trùng (1210C, 20 phút) A.niger với kết nghiên cứu Tran CT, Sly LI, Mitchel DA ñã sử dụng Asper & illus foetidus ACM3996 với diện 3% methanol, với ñộ ẩm 70% thu ñược 161g/kg bã dứa khô sau ngày lên men Nhân giống Lên men (t= 30 C; τ=5 ngày) [17] kết nghiên cứu chúng tơi cịn thấp Có thể nhiều yếu tố, có nguồn nguyên liệu khác nhau, việc sử dụng chủng vi sinh vật khác ñiều kiện lên men khác ñã dẫn ñến Nước Tách bã kết nghiên cứu không giống Kết nghiên cứu tương ñối so với kết nghiên cứu Hang Woodams (1984) lên men bã táo ñạt 65g/kg; Hang Woodams (1985) lên men Thu dịch sau lên men Hình 3.11 Quy trình cơng nghệ lên men axit Bã 22 21 3.6.2 Thuyết minh quy trình Bã dứa: Thu từ nhà máy chế biến dứa xuất khẩu, nhà máy chế biến dứa đặc nhà máy chế biến hoa nước Sấy: Sấy nhiệt ñộ 60ºC cho ñến bã dứa ñạt ñộ ẩm khoảng 14%, sau ñó tiến hành nghiền nhỏ Nghiền: Nghiền nhỏ với kích thước hạt khoảng 1-3 mm Mục đích việc nghiền làm tăng ñộ xốp cho môi trường lên men, ñể thuận lợi cho q trình hơ hấp nấm mốc A niger Lượng bã dứa ñược lưu trữ nhiệt ñộ thường sử dụng làm nguyên liệu cho trình nghiên cứu Chuẩn bị mơi trường lên men: Bã dứa bổ sung chất dinh dưỡng: sacaroza 14%, NH4NO3 0,3%, ethanol 2%, KH2PO4 0,1%; MgSO4.7H2O 0,05%; MnSO4 0,01% FeSO4.7H2O 0,001% Độ ẩm môi trường lên men 65%, pH ban đầu 5,5 Tiệt trùng: mơi trường lên men ñược tiệt trùng 1210C 20 phút, nhằm tiêu diệt vi sinh vật gây ảnh hưởng ñến q trình lên men Nhân giống: Để đáp ứng lượng giống nấm mốc cho lên men axit xtric cần phải tiến hành nhân giống Đầu tiên tiến hành nhân giống phịng thí nghiệm sau tiến hành nhân giống sản xuất Nhân giống phịng thí nghiệm nuôi cấy A niger khiết môi trường chứa ñầy ñủ chất dinh dưỡng ñược tiệt trùng Nấm mốc A niger thường nuôi môi trường thạch czapeck, raulin, sabouraud, Nhân giống sản xuất, A niger thường ni mơi trường từ nguồn nguyên liệu giàu ñường, rẻ tiền rỉ ñường, malt ñại mạch, cám gạo, Lên men: Môi trường lên men phân phối bình erlen, khay, ñược cấy A niger (với tỷ lệ 2x107 tế bào/g bã dứa) điều kiện vơ trùng Nhiệt độ lên men 30ºC, thời gian lên men ngày Trong q trình lên men có thất nước nên cần bổ sung nước để trì độ ẩm ban đầu Tách bã: Khi kết thúc q trình lên men, trộn mơi trường lên men với nước, tiến hành khuấy trộn, ép lọc bã thu dịch sau lên men 24 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5) Khi tối ưu hóa thực nghiệm phương pháp leo dốc kết thu 78,217 g/kg với thông số lên men tối ưu bổ KẾT LUẬN 1) Đã xác ñịnh ñược số thành phần hóa học bã dứa nhà máy chế biến dứa xuất Nghệ An sau: sung 14% sacazoza, 0,3% NH4NO3 thời gian lên men ngày 6) Đã đề xuất qui trình cơng nghệ lên men axit xitric từ bã dứa Độ ẩm: 81,27% môi trường bán rắn sử dụng Asperillus niger qui mô PTN pH: 4,13 KIẾN NGHỊ Axit xitric: 3,7% (% chất khô) - Cần tiếp tục nghiên cứu trình lên men axit xitric từ bã dứa, Đường tổng: 23,25% (% chất khô) tiếp tục nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng khác tỷ lệ giống, pH, Nitơ tổng: độ ẩm, kích thước hạt, bề dày mơi trường, nồng độ oxy,… để mạnh 0,84% (% chất khơ) 2) Trong q trình lên men độ ẩm mơi trường thay ñổi ñáng kể nên ngày phải bổ sung lượng nước tương ứng để trì độ ẩm khơng đổi Lượng nước bổ sung ngày suốt trình lên men 3) Kết nghiên cứu ñơn biến số yếu tố ảnh hưởng đến q trình lên men cho thấy thời gian lên men, hàm lượng ñường hàm lượng nitơ bổ sung có ảnh hưởng đáng kể đến q trình lên men Trong đó: + Trong loại đường sacazoza, glucoza fructoza đường sacazoza bổ sung tốt cho trình lên men xitric + Trong loại nitơ NH4NO3, (NH4)3PO4 pepton NH4NO3 bổ sung tốt cho trình lên men xitric 4) Khi nghiên cứu ảnh hưởng ñồng thời yếu tố ảnh hưởng ñến trình lên men thời gian lên men, hàm lượng sacazoza bổ sung hàm lượng NH4NO3 bổ sung phương pháp quy hoạch thực nghiệm, TYT23 phương trình hồi quy thu ñược là: Ỹ = 74,225+ 1,0827x1 -0,761x2 – 1,071x3 dạn đề xuất qui trình cơng nghệ lên men axit xitric từ bã dứa môi trường bán rắn sử dụng Asperillus niger qui mô pilot - Mở rộng phạm vi nghiên cứu ñề tài nhiều nguồn phế liệu nông–công nghiệp rẻ tiền giàu ñường, tinh bột xenluloza với chủng A niger bị ñột biến ñể thu axit xitric cao - Từ axit xitric tạo thành, tinh chế, kết tinh thu axit xitric tinh khiết ứng dụng vào nhiều ngành công nghiệp khác - Nghiên cứu tận dụng bã thải mơi trường sau lên men để làm thức ăn gia súc  ... trình lên men axit xitric dư thừa Lên men bề mặt môi trường bán rắn thật phương Như vậy, tận dụng bã dứa làm nguồn nguyên liệu lên men axit xitric pháp thích hợp cho q trình lên men axit xitric. .. 1.2.4.2 Phương pháp lên men chìm 1.2.5 Các giai đoạn q trình lên men axit xitric yếu tố ảnh hưởng ñến trình lên men bề mặt 1.2.5.1 Chuẩn bị môi trường lên men 1.2.5.2 Lên men axit xitric 1.2.5.3 Xử... gian nhân giống A niger 2.2.3.2 Khảo sát mật ñộ tế bào A niger 2.2.4 Phương pháp lên men axit xitric 2.2.4.1 Chuẩn bị môi trường lên men axit xitric 2.2.4.2 Tiến hành lên men axit xitric 2.2.4.3