Bài viết trình bày nghiên cứu tổng hợp nano bạc trong dung dịch bằng phương pháp khử quang hoá. Đối tượng và phương pháp: Dùng ethylhydroxyl celolose (HEC) làm tác nhân khử, đồng thời là chất ổn định dung dịch nano bạc.
tạP CHí Y - Dợc học quân số 4-2020 TỔNG HỢP NANO BẠC ỨNG DỤNG DIỆT VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHỬ QUANG HOÁ Lê Văn Dung1, Nguyễn Minh Ngọc2, Nguyễn Tiến Thắng3 TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu tổng hợp nano bạc dung dịch phương pháp khử quang hoá Đối tượng phương pháp: Dùng ethylhydroxyl celolose (HEC) làm tác nhân khử, đồng thời chất ổn định dung dịch nano bạc Quá trình tổng hợp thực dung dịch, chiếu sáng với bước sóng 430 nm Xác định kích thước hạt nano phương pháp: Quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS), tán xạ ánh sáng động học (DSL) Nghiên cứu khả diệt vi khuẩn (VK) chủng E coli ATCC 25922, P aeruginosa ATTC 27853 S aureus ATC29213 Kết kết luận: Đã nghiên cứu thành công phương pháp tổng hợp dung dịch nano bạc để diệt VK nhiều đối tượng * Từ khoá: Nano bạc; Khử quang hoá; Diệt vi khuẩn MỞ ĐẦU Bạc kim loại chuyển tiếp màu trắng, mềm, có tính dẫn điện cao tất nguyên tố, độ dẫn nhiệt cao tất kim loại, sử dụng làm đồng tiền xu, đồ trang sức, chén đũa đồ dùng sinh hoạt Các hợp chất bạc dùng phim ảnh, bạc nitrat pha loãng dùng làm chất diệt VK Trong y học, bạc thành phần sản xuất băng vết thương sử dụng lớp phủ kháng sinh thiết bị y tế Băng chứa bạc sulfadiazine bạc nano sử dụng để điều trị nhiễm trùng bên vết thương [1, 2] Nano bạc hạt nano bạc có kích thước từ - 100 nm, hình dạng đa dạng phụ thuộc vào phương pháp điều chế (hình cầu, tứ diện, bát diện…) Có nhiều phương pháp tổng hợp nano bạc, theo thống kê, từ năm 1992 - 2014, số lượng cơng trình công bố phương pháp tổng hợp nano bạc tăng nhanh (năm 1992 có cơng trình, năm 2014 800 cơng trình) Các phương pháp tổng hợp nano bạc phổ biến: Phương pháp khử hoá học [3, 4, 5, 6, 7], chiếu tia laser [8], điện hoá [9] Các phương pháp tổng hợp trước có nhiều ưu điểm tồn nhược điểm: Nhiều giai đoạn phức tạp, hoá chất đắt tiền, sản phẩm thu bền theo thời gian bảo quản nên ảnh hưởng đến khả ứng dụng Vì vậy, nghiên cứu tổng hợp nano bạc qua giai đoạn với chất khử hydroxylcellulose (HEC), đồng thời chất ổn định dung dịch nano bạc trình bảo quản, chất oxi hố bạc nitrat, trình tổng hợp, chiếu sáng tử ngoại để tăng tốc độ tổng hợp Bộ mơn Hóa, Học viện Qn y Khoa Hóa - ĐHNN – ĐHQG Cơng ty Cổ phần Liên doanh Sơn Quốc tế Người phản hồi: Lê Văn Dung (ldungtbt@yahoo.com) Ngày nhận bài: 25/3/2020 Ngày báo đăng: 12/5/2020 24 T¹P CHÝ Y - Dợc học quân số 4-2020 PHNG PHP NGHIấN CU Vật liệu Hydroxyethyl cellulose (HEC) bạc nitrat cung cấp Công ty SigmaAldrich (Mỹ) Ba chủng VK E coli ATCC 25922, P aeruginosa ATTC 27853 S aureus ATC29213 cung cấp Bộ môn Vi sinh vật, Học viện Quân y Tổng hợp nano bạc Thêm từ từ dung dịch muối bạc nitrat nồng độ 0,1M (tương ứng với nồng độ nano bạc thu được) vào bình cầu hồi lưu chứa 50 ml dung dịch HEC 0,35%, khuấy đều, đồng thời chiếu sáng tử ngoại đèn chiếu tử ngoại (15 watt, 254/365 nm) bước sóng 254 nm (đèn đặt cách bình phản ứng cm) đến thu dung dịch nano bạc có màu vàng nhạt đến nâu, đun sơi hồi lưu dung dịch đến khơng cịn ion bạc (khơng có phản ứng tạo kết tủa đen với dung dịch natri sunfua) Bảo quản dung dịch nano bạc điều kiện thường, lọ tối màu Phản ứng trình tổng hợp sau: Cellulose-CH2-CH2-OH + 4Ag+ + H2O Khảo sát dung dịch nano bạc Khảo sát phổ UV-VIS dung dịch nano bạc cách pha loãng dung dịch nano bạc đến 20,0 ppm Thực đo phổ UV-VIS máy đo Spectro UVVIS UVD-2960 (Cơng ty Labomed, Inc, Mỹ) với bước sóng 370 - 600 nm Đo kích thước hạt nano bạc phương pháp tán xạ ánh sáng Pha loãng dung dịch nano bạc đến nồng độ 20 ppm dung dịch Tween 80 nồng độ 2%, thực phép đo máy SZ-100 - HORIBA với góc nhiễu xạ 90o, vùng đo 0,1 - 10.000 nm, cuvet cm Thử hoạt tính diệt VK dung dịch nano bạc * Xác định nồng độ ức chế VK tối thiểu (MIC): Pha loãng dãy nồng độ dung dịch nano bạc nồng độ khác (1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64), trộn dung dịch với lượng VK nồng độ định (108 VK/ml) hν Cellulose-CH2-COOH + 4Ag + 4H+ Sau thời điểm (0 giờ, giờ, giờ, 24 giờ), lấy hỗn hợp cấy lên đĩa thạch thành đường song song Ủ ấm nhiệt độ thích hợp (37oC) thời gian quy định (24 giờ) Định lượng VK mọc đĩa thạch so với mẫu chuẩn (mẫu chuẩn có đường ứng với dãy nồng độ VK: 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 CFU/ml) * Khả diệt khuẩn bề mặt tiếp xúc: Các chủng VK dùng nghiên cứu: VK 24 tuổi, chủng E coli ATCC 25922, P aeruginosa ATCC 27853, S aureus ATCC 29213 Dung dịch nano bạc chia lọ: lọ giữ nguyên nồng độ ban đầu, lọ pha lỗng có nồng độ 1/2 dung dịch ban đầu Tạo huyền dịch nồng độ 108 chủng VK E coli, P aeruginosa, S aureus máy so độ đục nồng độ 0,5 Mc Farland Tạo mơ hình nhiễm: Với chủng VK tạo mơ hình nhiễm cách dùng tăm bơng thấm ướt huyền dịch VK 25 t¹P CHÝ Y - Dợc học quân số 4-2020 chun b bước ria lên bề mặt đĩa petri có đường kính 12 cm Khi bề mặt mơ hình nhiễm se lại dùng tăm làm ẩm nước muối sinh lý phết lên góc đĩa, ria tăm bơng lên đĩa thạch Muller Hinton tương ứng (thời điểm 0) Phun sương dung dịch nano bạc nồng độ 1/2 lên mô hình nhiễm Dùng tăm bơng làm ẩm nước muối sinh lý phết ngẫu nhiên lên góc đĩa petri (1 tăm cho đĩa petri) thời điểm phút, phút, 15 phút sau VK tiếp xúc với dung dịch phun sương nano bạc Mỗi tăm ria lên đĩa thạch Muller Hinton tương ứng để kiểm tra khả diệt khuẩn Ủ đĩa thạch 37oC 24 Sau 24 giờ, lấy đĩa thạch Muller Hinton đọc kết So sánh nồng độ dung dịch nano bạc tiếp xúc với chủng VK tương ứng thời điểm phút, phút 15 phút với thời điểm Nếu không mọc VK, kết luận dung dịch nano bạc diệt hoàn toàn VK; có mọc VK, kết luận dung dịch nano bạc khơng diệt hoàn toàn VK KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tổng hợp dung dịch nano bạc Bảng 1: Thời gian phản ứng nồng độ AgNO3 khác -1 [AgNO3] (mmol.L ) 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 7,0 8,0 Thời gian phản ứng (phút) 15 15 25 40 60 90 150 320 Hình 1: Hình ảnh dung dịch nano bạc (Nồng độ tăng dần từ phải qua trái) Khi tăng nồng độ AgNO3, thời gian phản ứng tăng dần, dung dịch có màu đậm dần từ vàng chanh sang đỏ, nồng độ cao có mu nõu en 26 TạP CHí Y - Dợc học qu©n sù sè 4-2020 Khảo sát phổ hấp thụ UV-VIS dung dịch nano bạc Bước sóng (nm) Hình 2: Phổ UV-VIS dung dịch nano bạc Khi nồng độ dung dịch cao, bước sóng hấp thụ cực đại lớn Các nghiên cứu bước sóng hấp thụ cực đại lớn, kích thước hạt nano lớn [10] Như vậy, tăng nồng độ AgNO3 trình tổng hợp nano bạc kích thước hạt nano bạc tăng dần Phân tích kích thước hạt Bảng 2: Kích thước hạt nano bạc Tên mẫu Nồng độ AgNO3 (mmol/l) M1 0,5 M2 1,0 M3 2,0 M4 3,0 Các vùng kích thước hạt trung bình (nm) Tỷ lệ (%) 4,1 24,0 45,5 76,0 4,7 23,0 47,1 77,0 4,6 17,0 57,3 83,0 6,5 16,0 62,7 84,0 Kích thước hạt trung bình chung (nm) 35,6 37,3 48,3 53,7 27 tạP CHí Y - Dợc học quân sù sè 4-2020 M5 4,0 M6 5,0 M7 6,0 M8 7,0 7,1 18,0 66,2 82,0 7,9 21,0 73,1 79,0 6,8 12,0 74,3 88,0 73,2 100,0 55,6 59,4 66,2 73,2 Khi tăng dần nồng độ AgNO3, kích thước hạt tăng dần từ 35,6 nm (AgNO3 0,5 mmol/l) đến 73,2 nm (AgNO3 7,0 mmol/l) Tuy nhiên, từ mẫu M1 đến mẫu M7 có vùng kích thước hạt nano, vùng kích thước nhỏ (< 10 nm) với khoảng 20%, vùng có kích thước lớn (40 - 90 nm) Mẫu M8 khơng có vùng có kích thước nhỏ, có vùng có kích thước lớn Nghiên cứu khả diệt VK * Xác định nồng độ ức chế VK tối thiểu (MIC): Bảng 3: Khả diệt VK E coli ATCC 25922 nano bạc nồng độ khác Nồng độ nano bạc (ppm) Khả diệt VK E coli ATCC 25922 (CFU/ml) giờ 24 162,0 10 0 81,0 10 0 40,5 10 20,2 10 10,1 10 5,0 10 Mẫu chuẩn 0 10 10 10 10 10 10 10 10 giờ 24 Hình 3: Hình ảnh khả diệt VK E coli ATCC 25922 dung dịch nano bạc 28 T¹P CHÝ Y - Dợc học quân số 4-2020 Nng dung dịch nano bạc tối ưu dùng để diệt VK E coli ATCC 25922 40,5 ppm Các dung dịch có nồng độ thấp < 10 ppm khơng có khả diệt VK Dung dịch nồng độ 20 ppm ức chế tạm thời VK (sau VK phát triển) * Khả diệt khuẩn bề mặt tiếp xúc: Bảng 4: Khả diệt VK bề mặt tiếp xúc dung dịch nano bạc TT Loại VK E coli ATCC 25922 P aeruginosa ATTC 27853 S aureus ATC 29213 Nồng độ nano bạc (ppm) Nồng độ VK ban đầu (VK/ml) Nồng độ VK sau phun dung dịch nano bạc (VK/ml) phút phút 15 phút 100,0 10 0 50,0 10 0 100,0 10 0 50.0 10 0 10 10 100,0 50,0 10 10 10 Dung dịch nano bạc dạng phun sương bề mặt với nồng độ thử nghiệm có hiệu lực diệt khuẩn với chủng VK Gram âm E coli ATCC 25922, P aeruginosa ATCC 27853 nồng độ nano bạc 50 ppm; hiệu lực diệt khuẩn tốt với chủng S aureus ATCC 29213 nồng độ 100 ppm sau thời gian phun phút KẾT LUẬN Đã nghiên cứu thành công phương pháp tổng hợp dung dịch nano bạc phương pháp quang hoá sử dụng ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, dùng chất hydroxyetylcellulose làm chất khử ổn định dung dịch Dung dịch nano bạc thu có kích thước trung bình nhỏ, bền theo thời gian Sử dụng phương pháp đại quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), tán xạ ánh sáng động học (DSL) xác định kích thước hạt nano dung dịch Nghiên cứu khả ức chế VK E coli ATCC 25922, kết khả ức chế VK tốt nồng độ nano bạc 40 ppm Dung dịch nano bạc dạng phun sương bề mặt với nồng độ thử nghiệm có hiệu lực diệt khuẩn với chủng VK Gram âm E coli ATCC 25922, P aeruginosa ATCC 27853 nồng độ nano bạc 50 ppm; hiệu lực diệt khuẩn tốt với chủng S aureus ATCC 29213 nồng độ 100 ppm sau thời gian phun phút Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng dung dịch nano bạc tổng hợp để diệt VK nhiều đối tượng TÀI LIỆU THAM KHẢO Atiyeh, Bishara S, Costagliola, et al Effect of silver on burn wound infection control and healing: Review of the literature Burns 2007; 33(2): 139-148 Hermans, Michel H Silver-containing dressings and the need for evidence American Journal of Nursing 2006; 106(12):60-68 29 tạP CHí Y - Dợc học qu©n sù sè 4-2020 Turkevich J, Stevenson PL, Hillier J A study of the nucleation and growth process in the synthesis of colloidal gold Discuss Faraday Soc 2006; 11:55-75 Polte J, et al Formation mechanism of colloidal silver nanoparticles: Analogies and differ-ences to the growth of gold nanoparticles ACS Nano 2012; 6(7):5791-5802 Patakfalvi R, Dekany I Nucleation and growth of silver nanoparticles monitored by titration microcalorimetry J Therm Anal Calorim 2005; 79:587-594 Yoosaf K, et al In situ synthesis of metal nanoparticles and selective naked-eye detection of lead ions from aqueous media J Phys Chem C 2007; 111:12839-12847 30 Hada H, et al Photoreduction of silver ion in aqueous and alcoholic solutions J Phys Chem 1976; 80(25):2728-2731 Hu MZ, Easterly CE A novel thermal electrochemical synthesis method for production of stable colloids of “naked” metal (Ag) nanocrystals Mater Sci Eng C 2009; 29(3):726-736 Surudzic R, et al Electrochemical synthesis of silver nanoparticles in poly(vinyl alcohol) solution J Serb Chem Soc 2013; 78(12):2087-2098 10 MA Noginov, et al The effect of gain and absorption on surface plasmons in metal nanoparticles Applied Physics B 2007; 86:455-460 ... công phương pháp tổng hợp dung dịch nano bạc phương pháp quang hoá sử dụng ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, dùng chất hydroxyetylcellulose làm chất khử ổn định dung dịch Dung dịch nano bạc. .. quản dung dịch nano bạc điều kiện thường, lọ tối màu Phản ứng trình tổng hợp sau: Cellulose-CH2-CH2-OH + 4Ag+ + H2O Khảo sát dung dịch nano bạc Khảo sát phổ UV-VIS dung dịch nano bạc cách pha loãng... S aureus ATC29213 cung cấp Bộ môn Vi sinh vật, Học vi? ??n Quân y Tổng hợp nano bạc Thêm từ từ dung dịch muối bạc nitrat nồng độ 0,1M (tương ứng với nồng độ nano bạc thu được) vào bình cầu hồi lưu