Phát triển sinh khối vi rút nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THANH HẢI HÀ PH¸T TRIĨN SINH KhốI Virus NHÂN ĐA DIệN (NPV) TRÊN Tế BàO SÂU KHOANG PHụC Vụ SảN XUấT THUốC TRừ SÂU SINH HọC Ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 9420201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2020 Cơng trình hồn thành TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Hồng Đình Hồ PGS.TS Lê Văn Trịnh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá Luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi phút ngày tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài nghiên cứu Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) số đối tượng sâu hại quan trọng trồng cạn, phân bố rộng nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới nhiệt đới Đây loài sâu ăn tạp, sống gây hại 290 loài thuộc 90 họ thực vật khác (Kumari Singh, 2009; Hong, 2002) Ở Việt Nam, sâu khoang thường phát sinh phá hại nặng nhiều loại trồng, điển loại rau họ Thập tự, cà chua, nho, đậu tương, lạc, v.v (Viện Bảo vệ thực vật, 2003) Để bảo vệ khỏi tác hại sâu khoang, nông dân thường sử dụng nhiều loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật với liều lượng cao, để lại tồn dư độc hại sản phẩm gây độc hại đáng kể sức khỏe người sản xuất tiêu dùng sản phẩm, ô nhiễm môi trường tổn hại đến quần thể loài sinh vật có ích đồng ruộng Trên đồng ruộng, sâu khoang thường bị chết virus nhân đa diện (NPV), lồi chun tính có hiệu gây chết cao sâu khoang, không lây nhiễm lồi khơng phải ký chủ (Kitajima, 1989; Kamakoff Ward, 2007) Vì vậy, việc nghiên cứu khả phát triển sinh khối NPV tế bào phục vụ sản xuất chế phẩm NPV cần thiết Lâu nay, việc phát triển sinh khối NPV theo phương pháp thủ công với qui mô nhỏ hẹp nên sản xuất qui mơ cơng nghiệp Để tạo khối lượng lớn sinh khối NPV, nhà khoa học giới nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất chế phẩm NPV (Granados Blissard, 2007; Goodman, 2008; Elanchezyan, 2009) Để đóng góp tư liệu khoa học tiềm khả nhân sinh khối NPV tế bào nuôi nhân, làm sở cho việc phát triển chế phẩm sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại nước ta, việc thực đề tài: “Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học“ vấn đề cần thiết nhằm đáp ứng yêu cầu thực tiễn sản xuất nơng nghiệp Mục đích, u cầu cần đạt đề tài 2.1 Mục đích - Trên sở đánh giá tiềm ký sinh tự nhiên, tiến hành tuyển chọn chủng vi rút nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao phòng chống sâu khoang - Xác định kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang lây nhiễm phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại 2.2 Yêu cầu cần đạt - Đánh giá khả gây chết sâu khoang tự nhiên, thu thập tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao gây chết sâu khoang - Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV tế bào nuôi nhân - Thử nghiệm phát triển chế phẩm virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang dạng bột thấm nước có hiệu cao phòng trừ sâu khoang hại trồng Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học - Các dẫn liệu đánh giá tiềm gây chết sâu khoang NPV đồng ruộng tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao có ý nghĩa to lớn định hướng khai thác, sử dụng NPV để quản lý sâu hại trồng nông nghiệp - Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) tế bào góp phần làm sáng tỏ tiềm ứng dụng phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học - Kết nghiên cứu tinh thể vùi (OB) NPV sâu khoang, thử nghiệm tạo chế phẩm sinh học NPV dạng bột thấm nước có hiệu cao phịng trừ sâu khoang đồng ruộng làm sở định hướng tiêu chuẩn hoá chất lượng chế phẩm sinh học dựa số lượng thể vùi sau sản xuất 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết điều tra, thu thập tuyển chọn chủng NPV có tiềm cao phát sinh thể vùi gây chết sâu khoang phục vụ phát triển chế phẩm sinh học Với kết phát triển chế phẩm NPV có hiệu lực trừ sâu cao góp phần định hướng xây dựng qui trình sản xuất sử dụng chế phẩm để phịng trừ sâu khoang, nhằm hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nơng sản an tồn bảo vệ mơi trường đồng ruộng Đối tượng phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu - NPV sâu khoang: Được thu thập, phân lập tuyển chọn từ sâu non sâu khoang chết NPV đồng ruộng - Tế bào sâu khoang: Do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp, dòng tế bào phát triển từ tế bào gốc mô phôi sâu khoang, nuôi nhân qua 135 chu kỳ - Sâu non sâu khoang: Được nuôi nhân bắp cải 4.2 Phạm vi nghiên cứu - Đánh giá tiềm gây chết sâu khoang NPV bắp cải, lạc, đậu tương khoai sọ đồng ruộng Thu thập tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao gây chết sâu khoang - Xác định điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang - Điều kiện lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV tế bào sâu khoang - Kỹ thuật tinh thể vùi, tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước Những đóng góp luận án - Lần cung cấp dẫn liệu khoa học có hệ thống khả phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) tế bào, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Việt Nam - Bổ sung dẫn liệu khoa học mức độ phổ biến NPV sâu khoang hại bắp cải, lạc, đậu tương khoai sọ Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có tiềm (TL.1a; TL.2a; TL.3a), số TL.1a có hoạt lực cao gây chết sâu khoang (80%) hình thành thể vùi (2,6 x 108 OB/10sâu) - Bước đầu xác định kỹ thuật tinh thể vùi NPV Phát triển chế phẩm sinh học NPV dạng bột thấm nước (NPV-1 NPV-2) có hiệu cao phòng trừ sâu khoang hại bắp cải (80,51- 82,29%) đậu tương (96,92%) Cấu trúc luận án Luận án gồm 142 trang, với phần: mở đầu, nội dung (gồm chương), kết luận đề nghị, với 33 bảng số liệu 14 hình Tham khảo 121 tài liệu, có 19 tài tiếng Việt 102 tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học đề tài nghiên cứu Virus nhân đa diện (NPV) thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ cao tồn dạng thể vùi (OB), thể vùi tồn tới 30 năm tự nhiên (Grzywacz et al.,1996) Khi sâu non ăn phải thức ăn vùi NPV, gặp pH cao ruột làm vỏ protein thể vùi bị phá vỡ, giải phóng thể hoạt động (virion) xâm nhiễm vào nhu mô ruột Sau lây nhiễm sang mơ bào khác thể Sau 2-3 ngày sâu ngừng ăn chết sau 5- ngày (Sajap et al., 2000) Tuy nhiên, NPV lây nhiễm phát triển sinh khối mô, tế bào sống thể côn trùng (Kalmakoff Ward, 2007; Elanchezhyan, 2009; Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007) Vì vậy, cần nghiên cứu có hiểu biết đầy đủ điều kiện phát triển sinh khối tế bào côn trùng, lây nhiễm NPV tế bào sở sử dụng chủng NPV có hoạt lực cao tuyển chọn để phát triển sinh khối NPV phục vụ phát triển thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại (Elanchezhyan, 2009) 1.2 Tổng quan tài liệu 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.2.1.1 Nghiên cứu sâu khoang hại trồng Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) đối tượng sâu hại quan trọng sản xuất nông nghiệp nhiều nước giới (Kumari Singh, 2009; Hong, 2002, Jadhav et al, 2015, Cherry et al., 2000) Sâu có thời gian phát dục dài, khả sinh sản lớn, nên dễ phát sinh gây hại nặng cho trồng (Hong, 2002, Nagamandla Shantanu, 2018) 1.2.1.2 Nghiên cứu NPV sâu hại Virus nhân đa diện (NPV) nhóm virus lớn có hiệu gây chết cao lồi trùng Đặc biệt, lồi NPV chun tính hồn tồn khơng lây nhiễm lồi động vật có xương sống, chúng tồn dạng thể vùi (OB) có kích thước 1-7µm khối lượng phân tử khoảng 25- 30 kDa Chúng tác nhân sinh học hữu ích phịng trừ sâu hại trồng (Farrar et al., 1999) 1.2.1.3 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng Lynn (2002) tổng kết thành qui trình chung cho việc nhân sinh khối tế bào côn trùng qua 11 công đoạn với yêu cầu cụ thể khác cho công đoạn nuôi nhân, loại vật liệu thiết bị, bước thực phát triển sinh khối tế bào Kết nghiên cứu triển sinh khối tế bào côn trùng thể qua công bố nhiều nhà khoa học (Granados et al., 2007, Lynn, 2002, Weiss et al., 1981, 1996, Sudeep et al., 2005 Murhammer, 2007, v.v ) 1.2.1.4 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào trùng Elanchezhyan (2009) nhiều tác giả khác rõ yếu tố quan trọng có liên quan đến nhân nuôi thành công tế bào côn trùng, như: chủng loại môi trường, huyết thanh, nhiệt độ pH môi trường nhân ni, v.v Các nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào thể qua cơng trình Mishuhashi (1994); Bhutia et al (2012); Lynn, (2003); Agathos (2007); Granados et al (2007); Segura Felio (2012) v.v 1.2.1.5 Nghiên cứu lây nhiễm NPV tế bào nhân nuôi Các tác giả rõ để lây nhiễm NPV tế bào côn trùng ni nhân có hiệu cần quan tâm nghiên cứu làm rõ điều kiện thích hợp cho lây nhiễm dựa số MOI, môi trường, huyết thanh, nhiệt độ pH môi trường , v.v Nhiều nghiên cứu công bố vấn đề thể qua cơng trình Mclntosh et al (2003); Demir et al (2009); Knudson et al (1974); Petchprakob et al (2007); Jakubowska et al (2009) nhiều tác giả khác 1.2.1.6 Nghiên cứu tinh thể vùi tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV Kanokwan et al (2004) thực tinh thể vùi tinh cách ly tâm với tốc độ 5.000 vịng/phút để loại bỏ mơi trường ni nhân, sau ly tâm lại nước cất Tipadee et al., (1988) tinh thể vùi NPV sâu xanh áp dụng phương pháp ly tâm tốc độ 2500 vịng/phút 10 phút, sau 16.000 vịng/phút 90 phút Theo Shapiro et al (2008), thành phần Bentonite, Kaolin, bột tan khoáng sét thường sử dụng để tạo chế phẩm dạng bột thấm nước Mushobozi et al (2004) xác định công nghệ đơn giản để tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước sử dụng kaolin khoáng sét nghiền với độ mịn để phun rải dễ dàng pha loãng Theo Grzywacz, et al (1996), chế phẩm phải đảm bảo tổng lượng thể vùi phun rải cho trồng đạt từ x 1010 đến x 1012 OB/ha 1.2.2 Nghiên cứu nước 1.2.2.1 Nghiên cứu sâu khoang hại trồng Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) sâu hại quan trọng trồng cạn số quan, nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ năm 1970 Các công trình nghiên cứu cơng bố tập trung vào đặc điểm sinh học, sinh thái học biện pháp phòng trừ sâu khoang thuốc hoá học biện pháp canh tác, như: Viện Bảo vệ thực vật (2000, 2001, 2003, 2006), Nguyễn Duy Nhất (1970), Lê Văn Trịnh (1996), v.v 1.2.2.2 Nghiên cứu NPV sâu hại Việc điều tra tiềm gây chết sâu hại NPV phân lập tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực trừ sâu cao thể qua cơng trình cơng bố tác giả Nguyễn Văn Cảm et al (1996), Trương Thanh Giản et al (1996), Hoàng Thị Việt et al (2002), Trịnh Thị Xuân (2016), Trần Văn Hai (2010), v.v 1.2.2.3 Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng Hoạt động nghiên cứu tế bào côn trùng Việt Nam năm 2011 với cơng trình cơng bố Lê Văn Trịnh Lê Thanh Hải Hà (2011) việc phát triển dòng tế bào sâu khoang 1.2.2.4 Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV Việc phát triển sinh khối NPV cách lây nhiễm virus sâu hại, nêu rõ cơng trình nghiên cứu Nguyễn Văn Cảm et al (1996), Trương Thanh Giản et al (1996), Hoàng Thị Việt et al (2000) Nguyễn Thị Hai (2005), v.v 1.2.2.5 Nghiên cứu tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại Việc tạo chế phẩm dạng dịch thể bột khô nghiền từ sâu non chết bệnh nghiên cứu Kết nghiên cứu thể qua cơng trình cơng bố tác giả Nguyễn Văn Cảm et al (1996); Trương Thanh Giản et al (1996), v.v Nhận xét chung: Virus nhân đa diện (NPV) tác nhân sinh học hữu ích, phổ biến đồng ruộng có tiềm cao phòng trừ sâu hại, nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Ở nước ngoài, việc nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng, phát triển sinh khối virus để phòng trừ sâu hại thực với qui mô khác Tại Việt Nam, chủ yếu tập trung nghiên cứu phát triển sinh khối NPV cách lây nhiễm NPV sâu non nghiền, lọc tạo chế phẩm vào năm 1990- 2005 Vì vậy, việc nghiên cứu ni nhân tế bào, tuyển chọn chủng virus nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao để lây nhiễm tế bào nhân nuôi, sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại u cầu cấp thiết, có tính thời sản xuất nơng sản an tồn, hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hố học, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái nước ta CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu - Các loại môi trường nuôi nhân tế bào sâu khoang lây nhiễm NPV công ty Invitrogen Life Technologies cung cấp, như: Excell 420- 14419C serum free (Sigma), Schneider (Sigma), TC - 100 BML-TC/10 (Sigma), TNM- FH (Sigma), IPL-41 (Sigma), Grace (Gibco), huyết Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco), Photphatse Buffer Saline pH 7,2 (1X) (PBS) (Gibco), Trypan blue 0.4%, Trypsin- EDTA 10X (Gibco), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), Tryphto broth, loại kháng sinh, v.v 2.1.2 Dụng cụ trang thiết bị nghiên cứu: - Các dụng cụ nuôi nhân tế bào: bình cổ vếch có nắp lọc khuẩn loại 25cm2, 75 cm2, 250 cm2, 250ml 1000ml (Corning SPL- Hàn Quốc) Hộp nhân nuôi, đánh giá tế bào Multiple Well Plates loại 12 giếng (Corning- Mỹ), v.v - Dụng cụ, vật liệu nuôi sâu sâu khoang: lồng nuôi sâu, chậu nhựa, đĩa petri, bô can, ống tuýp, pank, kéo, chổi lông, giấy thấm thấm nước, v.v - Các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu: buồng cấy vô trùng, máy lắc N-Biotek (Hàn Quốc), máy ly tâm từ 3000- 9.000 vịng/phút, tủ ni tế bào Binder (Mỹ), tủ lạnh sâu -960C kính hiển vi soi Zeiss (Đức), v.v 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm phịng tiến hành phịng thí nghiệm Trung tâm Đấu tranh Sinh học (Viện Bảo vệ thực vật), phường Đức Thắng, Bắc Từ Liêm, Hà Nội Các thí nghiệm đồng ruộng tiến hành Đông Anh Mỹ Đức (Hà Nội) 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 9/2014 đến tháng 12/2019 2.3 Nội dung nghiên cứu 1- Điều tra, thu thập tuyển chọn chủng NPV sâu khoang có hoạt lực cao 2- Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm NPV tế bào nuôi nhân 3- Nghiên cứu tinh thể vùi tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Điều tra, đánh giá thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang Theo phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật Viện Bảo vệ thực vật (1997) QCVN 01-38:2010/BNNPTNT Phân lập tuyển chọn chủng NPV theo phương pháp Grzywacz et al (1996) Tiến hành điều tra, thu thập sâu khoang bắp cải lạc Đông Anh (Hà Nội), lạc khoai sọ Yên Phong (Bắc Ninh) Sâu thu đem phòng đánh giá phân lập, tuyển chọn chủng NPV Trong trình phân lập kết hợp với xác định hiệu gây chết sâu khoang khả sinh thể vùi virus Từ lựa chọn chủng có tiềm phục vụ nghiên cứu 2.4.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm NPV tế bào ni nhân 2.4.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang Theo phương pháp tác giả Lynn Shapiro (1998), Lynn (2002) qui trình hướng dẫn Invitrogen Life Technologies (2002) Đề tài tập trung nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp để phát triển sinh khối tế bào sâu khoang như: chủng loại môi trường, pH, nhiệt độ, tỷ lệ bổ sung huyết FBS Xác định khả phát triển sinh khối tế bào điều kiện thích hợp, nhân ni với lượng 150ml mơi trường bình cổ vếch 250ml 750ml mơi trường loại bình ni nhân có dung tích lít 2.4.2.2 Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang tế bào nhân nuôi - Phá vỡ vỏ bọc protein thể vùi để giải phóng thể hoạt động vi rút theo phương pháp Tipvadee et al (1988) Lây nhiễm NPV tế bào theo phương pháp Lynn (1998; 2003), Grzywacz et al (1996), v.v Các thí nghiệm xác định khả lây nhiễm tạo thể vùi NPV sâu khoang, như: số lây nhiễm MOI, mật độ tế bào, môi trường, pH, nhiệt độ, tỷ lệ bổ sung huyết FBS Đánh giá hiệu gây chết sâu khoang chủng NPV nhân sinh khối tế bào - Xác định mật độ tế bào số lượng thể vùi theo phương pháp Lynn (2002) cách đếm buồng đếm hồng cầu Neubauer kính hiển vi - Giải trình tự gen NPV theo phương pháp phân tích PCR so sánh với ngân hàng Genbank Maeda et al (1990) Đánh giá hiệu gây chết sâu khoang hàm lượng thể vùi hình thành chủng NPV lựa chọn, xác định chủng TL.1a có hiệu lực gây chết sâu 80,0% số lượng thể vùi hình thành đạt 2,0 x 108 OB/10 sâu vào 10 ngày sau lây nhiễm (NSLN) Chủng TL.3a đạt tương ứng 73,33% 1,85 x 108 OB/10 sâu, chủng TL.2a đạt 68,33% 1,60 x 108 OB/10 sâu (tương ứng) Virion B A Hình 3.4 Hình 3.4 Thể thể vùi (OB) thể hoạt động (virion) chủng TL.1a A: Thể vùi (OB) với độ phóng đại 2000X B: Thể virus hoạt động (virion) với độ phóng đại 25.000X Kết ảnh chụp thể vùi (OB) kính hiển vi với độ phóng đại 600X cho thấy rõ (Hỉnh 3.4), thể vùi (OB) có hình dạng hình khối khơng rõ thể hoạt động (virion) bên trong, có kích thước 150 x 350nm Thể hoạt động (virion) NPV chụp hiển vi điện tử (TEM) Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (Hà Nội), thể hoạt động (virion) với độ phóng đại 25.000X chủng TL.1a có dạng hình trụ với kích thước 44,7 nm x 341nm Kết quan sát tương tự với kết công bố nhiều tác giả công bố, kích thước thể vùi (OB) thường nằm khoảng 240 x 400nm thể hoạt động (virion) từ 40- 70 x 320- 450nm 3.2 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm NPV tế bào nhân nuôi 3.2.1 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 3.2.1.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang - Xác định mơi trường thích hợp ni nhân tế bào Trong số loại mơi trường thí nghiệm, sinh khối tế bào phát triển tốt môi trường Ex-Cell 420-14491C, sau ngày nuôi nhân mật độ tế bào đạt tới 1,394x 1010 tế bào/ml Đến ngày sau nuôi nhân, mật độ tế bào đạt cao tới 1,884 x 1010 tế bào/ml, 10 NSNN, mật độ tế bào đạt 1,630 x 1010 tế bào/ml 11 - Xác định nhiệt độ thích hợp ni nhân tế bào Với hàm lượng tế bào ban đầu 0,5 x 1010 tế bào/ml nuôi nhân mức nhiệt độ 24, 26, 28 290C Sau ngày nhân nuôi, mật độ tế bào công thức nhiệt độ 280C đạt mức cao số công thức thí nghiệm, đạt tới 3,708 x 1010 tế bào/ml A C B D Hình 3.6 Tế bào sâu khoang sau ngày nuôi nhân mức nhiệt độ khác A: 240C; B: 260C, C: 280C D: 290C - Điều kiện pH mơi trường thích hợp ni nhân tế bào Thí nghiệm với mức pH khác nhau, kết điều kiện pH 6,8 mật độ tế bào sinh khối đạt cao nhất, tới 1,504 x 1010 tế bào/ml sau ngày ni nhân, cịn mức pH khác mật độ tế bào đạt thấp Thời điểm sau ngày, mật độ tế bào đạt mức cao tất mức pH, cao pH= 6,8 với mật độ tế bào đạt 2,125 x 1010 tế bào/ml pH= 6,6 mật độ tế bào đạt 1,954 x 1010 tế bào/ml Đến thời điểm sau ngày, công thức pH 6,8 mật độ tế bào đạt 1,241 x 1010 tế bào/ml, đó, cơng thức với mức pH khác thấp cách có ý nghĩa - Xác định tỷ lệ huyết FBS bổ sung vào môi trường nhân tế bào Nhân nuôi tế bào với mức bổ sung FBS khác nhau, sau ngày mật độ tế bào đạt từ 0,713- 0,937 x 1010 tế bào/ml, tương tự công thức đối chứng không bổ sung FBS Đến ngày sau, tất công thức bổ sung FBS đạt mật độ tế bào cao so với đối chứng cách có ý nghĩa, từ 1,079- 2,165 x 1010 tế bào/ml, với tỷ lệ bổ sung 25% đạt cao tới 2,165 x 1010 tế bào/ml Sau 10 ngày, công thức bổ sung 25% hàm lượng tế bào đạt tới 3,271 x 1010 tế bào/ml - Mật độ tế bào ni nhân điều kiện thích hợp Tiến hành đợt thí nghiệm ni nhân tế bào theo thông số tối ưu xác định (Bảng 3.11) Kết 2,018- 2,791 x 1010 tế bào/ml Sau ngày đạt từ 2,941- 3,150 x 1010 tế bào/ml Hàm lượng tế bào đạt cao sau ngày nuôi nhân, từ 4,025- 5,750 x 1010 tế bào/ml cao thử nghiệm lần (tháng 11/2016) mật độ tế bào đạt tới 12 5,750 x 1010 tế bào/ml, cao hẳn so với mật độ tế bào đạt nuôi nhân tế bào sâu khoang điều kiện tối ưu riêng rẽ Đến thời điểm ngày sau nhân nuôi hàm lượng tế bào biểu giảm rõ rệt, từ 1,990- 2,675 x 1010 tế bào/ml Có thể sau sinh khối tế bào phát triển nhanh đạt đỉnh cao mật độ vào thời điểm ngày sau nuôi nhân làm thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, không đáp ứng nhu cầu phát triển sinh khối dẫn tới mật độ tế bào giảm thấp nhanh Hình ảnh tế bào sau ngày ni nhân thể qua Hình 3.8 Bảng 3.11 Mật độ tế bào thu nhân nuôi in vitro điều kiện thích hợp Đợt thí nghiệm Mật độ tế bào (x 1010 tế bào/ml) sau ngày nhân nuôi ngày (10/2016) 2,055 b 2,302 b 2,941 a 4,025 ab 2,675 a (11/2016) 2,791 a 2,809 a 3,150 a 5,750 a 2,475 a (12/2016) 2,018 b 2,415 b 3,051 a 4,987 a 1,990 b Ghi chú: Trong hàng, giá trị kèm chữ khác sai khác có ý nghĩa độ tin cậy P ≤ 0,05 600X 200X Hình 3.8: Tế bào sâu khoang sau nuôi nhân ngày quan sát kính hiển vi có độ phóng đại 600X 200X Với kết nghiên cứu điều kiện thích hợp để ni nhân tế bào sâu khoang nêu trên, khẳng định: hồn tồn nuôi nhân tế bào sâu khoang điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sử dụng môi trường Excell 42014419C nhiệt độ 280C, pH=6,8 tỷ lệ FBS bổ sung 25% Khi nuôi nhân tế bào sâu khoang điều kiện thích hợp, mật độ tế bào đạt cao nhất, từ 4,025 đến 5,750 x 1010 tế bào/ml sau ngày nhân nuôi 13 3.2.1.2 Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mơ phịng thí nghiệm - Nhân sinh khối tế bào theo phương pháp tĩnh lắc bình 250ml Ni nhân tế bào với lượng 150ml bình lọc khuẩn 250ml theo phương pháp tĩnh lắc (tốc độ 50 vịng/phút), mơi trường Ex-Cell 405 có bổ sung 25% FBS nhiệt độ 280C pH 6,8 Xác định nuôi nhân tế bào theo phương pháp tĩnh, mật độ tế bào đạt từ 3,17- 3,445 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân số lượng tế bào tăng từ 6,26- 6,89 lần so với mật độ tế bào ban đầu Mật độ tế bào trung bình đạt tương ứng 3,247 x 1010 tế bào/ml 6,49 lần Nuôi nhân theo phương pháp lắc với tốc độ 50 vòng/phút liên tục 24 giờ, mật độ tế bào đạt từ 4,58- 4,879 x 1010 tế bào/ml hệ số nhân số lượng tế bào đạt từ 9,16- 9,76 lần so với mật độ tế bào ban đầu Trung bình lần thí nghiệm, mật độ tế bào đạt 4,752 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân tế bào đạt 9,50 lần Bảng 3.12 Mật độ tế bào sâu khoang nuôi nhân theo phương pháp tĩnh lắc bình lọc khuẩn 250ml Lần thí Mật độ Phương pháp tĩnh Phương pháp lắc ban đầu Mật độ tế bào HS nhân Mật độ tế bào HS nhân (x 1010 tb/ml) (x 1010 tb/ml) (lần) (x 1010 tb/ml) (lần) 0,5 3,445 a 6,89 4,580 b 9,16 0,5 3,337 b 6,67 4,780 ab 9,56 0,5 3,129 c 6,26 4,590 a 9,18 0,5 3,170 c 6,34 4,595 b 9,19 0,5 3,270 cb 6,54 4,587 b 9,17 0,5 3,133 c 6,27 4,879 a 9,76 TB 0,5 3,247 6,49 4,752 9,50 nghiệm CV (%) 3,192 - 6,219 - LSD0,05 0,616 - 0,494 - Ghi chú: tb: Tế bào; HS: Hệ số nhân; TB: Mật độ tế bào trung bình; Trong cột, giá trị kèm chữ khác sai khác có ý nghĩa độ tin cậy P ≤ 0,05 14 A B Hình 3.7: A: Nhân tế bào theo phương pháp lắc; B: Nhân theo phương pháp tĩnh - Phát triển sinh khối tế bào theo phương pháp lắc bình lít Ni nhân tế bào với lượng 750ml mơi trường bình lọc khuẩn Erlemeeyer Flask dung tích 1,0 lít với mơi trường Excell 420-14419C loại mơi trường rẻ tiền Schneider S9895 Grace Tại thời điểm ngày sau nuôi nhân, nuôi nhân theo phương pháp lắc với môi trường Excell 420-14419C đạt tới 4,08 x 1010 tế bào/ml, với môi trường Schneider S9895 đạt 2,97 x 1010 tế bào/ml, môi trường Grace đạt 2,37 x 1010 tế bào/ml Trong đó, công thức nuôi nhân theo phương pháp tĩnh, mật độ tế bào thu tương ứng với loại môi trường đạt 3,14, 2,62 2,15 x 1010 tế bào/ml 3.2.2 Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang tế bào nuôi nhân 3.2.2.1 Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm NPV - Xác định mật độ tế bào thích hợp Khi nhiễm với số lượng thể vùi 0,1 x 108 OB/ml mật độ tế bảo khác Sau ngày lây nhiễm với mật độ tế bào 1,0 2,0 x 108 tế bào/ml số lượng thể vùi đạt 1,08 1,21 x 108 OB/ml, với cơng thức có mật độ tế bào cao 3,0 x 108 tế bào/ml số lượng thể vùi hình thành đạt tới 1,68 x 108 OB/ml Sau ngày, với công thức 1,0 2,0 x 108 tế bào/ml, số lượng thể vùi tương ứng 1,14 1,45 x 108 OB/ml, nhiễm mật độ tế bào 3,0 x 108 tế bào/ml, số lượng thể vùi đạt tới 2,47 x 108 OB/ml Sau ngày lây nhiễm tế bào có mật độ 1,0 2,0 x 10 tế bào/ml số lượng thể vùi đạt 1,01 1,27 x 10 OB/ml (tương ứng), với mật độ tế bào 3,0 x 108 tế bào/ml, số thể vùi đạt tới 2,43 x 108 OB/ml 15 - Xác định nồng độ virus thích hợp Lây nhiễm virus theo số MOI khác với mật độ tế bào cho lây nhiễm 1,0 x 108 tế bào/ml Sau ngày nhiễm theo số MOI= 0,5, số thể vùi hình thành tới 0,97 x 108 OB/ml, với số MOI 0,1 0,3 đạt 0,62 0,78 x 108 OB/ml (tương ứng) Sau ngày lây nhiễm theo số MOI 0,1 0,3 cho hàm lượng thể vùi hình thành đạt tương ứng 1,47 1,25 x 10 OB/ml, cao hẳn so với số MOI lây nhiễm 0,5 Sau ngày lây nhiễm, tương ứng với số MOI 0,1; 0,3 0,5 số thể vùi đạt 1,08, 0,53 0,37 x 108 OB/ml - Xác định thời gian ủ lây nhiễm virus thích hợp Khi nhiễm vi rút theo số MOI 0,1 sinh khối tế bào có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml Kết số lượng thể vùi hình thành sau ngày lây nhiễm đạt 0,72 x 108 OB/ml Sau ngày, số thể vùi đạt cao tới 1,53 x 108 OB/ml Nhưng sau số lượng thể vùi hình thành lại giảm dần, 1,13 x 108 OB/ml vào thời điểm sau ngày 0,95 x 108 OB/ml sau 10 ngày lây nhiễm - Xác định mơi trường thích hợp cho lây nhiễm Thí nghiệm với loại mơi trường khác với dịch tế bào sâu khoang có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml lây nhiễm theo số MOI 0,1 với môi trường pH 7,0 nhiệt độ 280C Kết sau ngày nhiễm, mơi trường Excell 420-14419C có số thể vùi hình thành cao tới 1,316 x 108 OB/ml, môi trường Schneider S9895 đạt 1,142 x 108 OB/ml Cịn với mơi trường TC-100- T3160 IPL-41, số thể vùi hình thành đạt mức thấp, tương ứng đạt 0,980 0,925 x 108 OB/ml Sau ngày, số thể vùi hình thành công thức sử dụng môi trường Excell 420-14419C cho số thể vùi đạt cao tới 2,014 x 108 OB/ml, với môi trường Schneider S9895 đạt 1,835 x 108 OB/ml, môi trường TC-100- T3160 đạt 1,422 x 108 OB/ml thấp môi trường IPL-41 đạt 1,341 x 108 OB/ml Đến thời điểm sau ngày, số lượng thể vùi hình thành sử dụng mơi trường Excell 420-14419C 1,290 x 108 OB/ml, với môi trường Schneider S9895 đạt 0,205 x 108 OB/ml Các môi trường TC-100- T3160 IPL-41 đạt 0,192 x 108 OB/ml 16 - Xác định nhiệt độ thích hợp cho lây nhiễm Lây nhiễm virus theo số MOI 0,1 dịch tế bào sâu khoang có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml Sau ngày lây nhiễm nhiệt độ 26 ± 0,50C, số lượng thể vùi đạt 1,08 x 108 OB/ml, nhiệt độ 28 ± 0,50C đạt 1,15 x 108 OB/ml số thể vùi đạt tới 1,31 x 108 OB/ml 30 ± 0,50C Nhưng sau ngày, số thể vùi đạt cao lại nhiệt độ 28 ± 0,50C tới 1,85 x 108 OB/ml, với nhiệt độ 26 ± 0,50C 30 ± 0,50C số lượng thể vùi đạt tương ứng 1,37 x 108 1,58 x 108 OB/ml Đến sau lây nhiễm, số thể vùi hình thành nhiệt độ 28 ± 0,50C đạt tới 0,714 x 108 OB/ml, nhiệt độ 26 ± 0,5 30 ± 0,50C số thể vùi đạt 0,692 0,687 x 108 OB/ml (tương ứng) - Xác định pH môi trường thích hợp cho lây nhiễm Lây nhiễm với số lượng thể vùi 0,1 x 108 OB/ml dịch tế bào có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml Kết sau ngày, số lượng thể vùi hình thành cao nhất, tới 0,44 x 108 OB/ml điều kiện môi trường pH 7,0 Sau ngày, số lượng thể vùi hình thành lên tới 2,17 x 108 OB/ml pH = 7,0 1,94 x 108 OB/ml pH = 6,5, pH 6,0 7,5 số thể vùi đạt tương ứng 1,78 1,85 x 108 OB/ml Sau ngày, với pH= 7,0 số thể vùi đạt cao 1,83 x 108 OB/ml, tiếp đến pH = 6,5 đạt 0,83 x 108 OB/ml, pH 6,0 7,5 số thể vùi đạt 0,62 0,71 x 108 OB/ml (tương ứng) Như vậy, điều kiện thích hợp lây nhiễm NPV mật độ tế bào 1,0 x 108 tế bào/ml theo số MOI 0,1, thời gian ủ lây nhiễm ngày mơi trường Excell 420-14419C có pH = 7,0 nhiệt độ 280C 3.2.2.2 Mức độ phát triển sinh khối tế bào hình thành thể vùi trình lây nhiễm NPV Sau ngày, lây nhiễm với số MOI = 0,1, số lượng thể vùi đạt 1,17 x 108 OB/ml tăng gấp 11,7 lần với ban đầu, công thức số MOI 0,3 0,5 số lượng thể vùi đạt tương ứng 1,25 1,41 x 108 OB/ml, với mức tăng tương ứng 41,67 28,2 lần so với số lượng ban đầu (Bảng 3.20) Sau ngày lây nhiễm với số MOI 0,1; 0,3 0,5 mật độ tế bào giảm 108,4; 88,7 76,9 lần, cịn số lượng thể vùi hình thành tăng tương ứng 158,0; 41,0 25,4 lần (Bảng 3.20) 17 Sau ngày, tương ứng với công thức số MOI 0,1; 0,3 0,5 mật độ tế bào 0,280, 0,256 0,264 x 106 tế bào/ml Đồng thời, số lượng thể vùi tương ứng với công thức lây nhiễm đạt 1,28; 1,10 1,13 x 108 OB/ml (Bảng 3.20) Bảng 3.20 Mật độ tế bào sâu khoang số thể vùi hình thành sau ngày lây nhiễm NPV theo số MOI khác Công Sau nhiễm ngày Sau nhiễm ngày Sau nhiễm ngày thức Tế bào Thể vùi Tế bào Thể vùi Tế bào Thể vùi thí (x 107 tế (x 108 (x 106 tế (x 108 (x 106 tế (x 108 nghiệm bào/ml) OB/ml) bào/ml) OB/ml) bào/ml) OB/ml) MOI 0,1 0,716 b 1,17 b 1,084 1,58 a 0,280 1,28 a MOI 0,3 0,551 c 1,25 b 0,887 1,23 b 0,256 1,10 b MOI 0,5 0,508 c 1,41 a 0,769 1,27 b 0,264 1,13 b Đ/C 1,203 a - 1,206 - 1,180 - CV (%) 2,551 0,458 1,673 0,393 6,428 4,251 LSD0,05 0,634 0,134 0,541 0,093 0,724 0,364 Ghi chú: Đ/C: Đối chứng dịch tế bào, không nhiễm NPV OB: Thể vùi; Trong cột, giá trị kèm chữ khác sai khác có ý nghĩa độ tin cậy P ≤ 0,05 3.2.2.3 Mức độ gây chết sâu khoang hình thành thể vùi NPV nhân tế bào sâu khoang • Hiệu gây chết sâu NPV nhân tế bào sâu Khi lây nhiễm NPV tạo từ lây nhiễm tế bào, hiệu lực trừ sâu khoang đạt 27,71% sau ngày, 41,56% sau ngày, đạt cao tới 76,27% sau ngày đạt 62,13% sau 10 ngày lây nhiễm Với NPV tạo từ sâu theo phương pháp truyền thống, hiệu lực trừ sâu khoang đạt thấp hẳn so với NPV tạo từ tế bào, đạt 19,28% sau ngày, 36,36% sau ngày, 64,41% sau ngày đạt 54,27% sau 10 ngày • Số lượng thể vùi hình thành NPV nhân tế bào sâu khoang Kết đánh giá, xác định sử dụng nguồn NPV tạo từ sâu non, cá thể sâu chết có số lượng thể vùi hình thành trung bình 200,3 thể vùi/sâu Khi sử dụng nguồn NPV nhân sinh khối từ tế bào, số lượng thể vùi hinh thành đạt 241,1 OB/sâu, gấp 1,2 lần so với nguồn NPV tạo từ sâu 18 3.2.2.4 Hiệu lực trừ sâu khoang chủng TL.1a nhân tế bào sâu Nhằm khẳng định lại lần hiệu lực gây chết sâu khoang chủng NPV chọn lọc qua thu thập đồng ruộng phân lập phịng thí nghiệm Kết quả, sau ngày, hiệu lực trừ sâu chủng NPV đạt từ 27,33 - 43,33%, chủng TL.1a từ sâu có hiệu lực cao đạt 43,33%, TL.2a TL.3a có hiệu lực trừ sâu thấp, đạt 27,33% 35,00% (tương ứng) Trong đó, chủng TL.1a nhân tế bào đạt 38,63% (Bảng 3.23) Sau ngày, hiệu lực gây chết sâu khoang TL.1a nhân tế bào đạt tới 52,89% Hiệu lực trừ sâu chủng TL.1a, TL.2a TL.3a nhân từ sâu đạt tỷ lệ sâu chết tương ứng 46,0, 37,33 46,67% (Bảng 3.23) Sau 10 ngày, hiệu lực trừ sâu TL.1a nhân tế bào đạt cao tới 80,47%, sử dụng virus nhân từ sâu TL.1a, TL.2a T.3a đạt hiệu trừ sâu khoang đạt tương ứng 78,67, 69,0 76,67% Kết thí nghiệm chứng minh tính ổn định hiệu lực phòng trừ sâu khoang qua đợt đánh giá chủng TL.1a tuyển chọn sau phân lập Chủng virus sử dụng để nghiên cứu phát triển chế phẩm trừ sâu khoang Bảng 3.23 Hiệu lực trừ sâu khoang chủng TL.1a nhân sinh khối tế bào sâu Số thể vùi Số sâu khoang Hiệu lực gây chết sâu khoang trước nhiễm thí nghiệm ngày sau nhiễm (%) (OB/ml) (con) 10 ngày TL.1a từ tế bào 1,50 x 108 150 38,63 b 52,89 a 80,47 a TL.1a từ sâu 1,50 x 108 150 43,33 a 46,00 b 78,67 a TL.2a từ sâu 1,50 x 108 150 27,33 d 37,33 c 69,00 b TL.3a từ sâu 1,50 x 108 150 35,00 c 46,67 b 76,67 a Đối chứng 1,50 x 108 150 - - - CV (%) 4.43 2.99 2.99 LSD 0,05 3.1921 2.7271 4.5457 Chủng NPV Ghi chú: OB: Thể vùi; Trong cột, giá trị kèm chữ khác sai khác có ý nghĩa độ tin cậy P ≤ 0,05 19 3.3 Nghiên cứu tinh thể vùi NPV sâu khoang tạo chế phẩm dạng bột thấm nước 3.3.1 Tinh thể vùi NPV sâu khoang Khi sử dụng từ 2- lần nước cất vô trùng số lượng thể vùi thu lại từ 1,04 1,80 x 108 OB/ml, với tỷ lệ thu hồi đạt 37,14- 64,29% số thể vùi ban đầu trước tinh Nếu thực lần (gồm lần nước cất xen kẽ với lần SDS), lượng thể vùi thu hồi cao tới 2,71 x 108 OB/ml, tỷ lệ thu hồi thể vùi 96,79% lượng thể vùi ban đầu (Bảng 3.26) Khi sử dụng lần, gồm: lần SDS 0,1% xen kẽ với lần nước cất, số lượng thể vùi đạt 2,10 x 108 OB/ml, đạt tỷ lệ thu hồi 85,71% Thực lần, gồm: lần SDS xen kẽ với lần nước cất, số lượng thể vùi thu hồi lại 2,35 x 108 OB/ml, tương đương với tỷ lệ thu hồi 83,93% (Bảng 3.26) Bảng 3.26 Số lượng thể vùi sâu khoang tỷ lệ thu hồi sau tinh theo phương pháp khác Công Phương pháp tinh Số lượng thể vùi Tỷ lệ thu thức thể vùi NPV sâu khoang (x 108 OB/ml) hồi (%) lần nước cất 1,04 37,14 lần nước cất 1,50 53,57 lần nước cất 1,80 64,29 lần: nước cất - SDS 2,33 83,21 lần: nước cất- SDS- nước cất 2,71 96,79 lần: SDS- nước cất- SDS- nước cất 2,40 85,71 lần: nước cất- SDS- nước cất- SDS- nước cất 2,35 83,93 Ghi chú: SDS: Sodium Dodecyl Sulfate; OB: Thể vùi 200X Hình 3.8: Thể vùi NPV sâu khoang sau tinh quan sát kính hiển vi với độ phóng đại 200X 600X 20 600X Theo Huda et al (2012), Lynn (2002), Nazli et al (2012) SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) tác nhân tạo sủi, hiệu việc tinh thể vùi từ dịch NPV SDS có tác dụng giúp cân sinh lý tế bào, không gây phá vỡ vỏ protein thể vùi chống thể vùi kết mảng Thể vùi NPV sau tinh thể rõ quan sát kính hiển vi với độ phóng đại 200X 600X (Hình 3.8) Phân tích trình tự gen kỹ thuật PCR với mẫu NPV sâu khoang nhân tế bào (ký hiệu SplNPV từ 2-5) mẫu NPV từ sâu non chết (SplNPV 6), so sánh với trình tự gen SplNPV công bố nước Kết quả, mẫu phân tích có trình tự gen hồn tồn tương tự nhau, thuộc loài Spodoptera litura Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV sâu khoang), giống Alphabaculovirus, họ Baculoviridae với độ tương đồng 100% so sánh trình tự gen NPV ngân hàng GenBank nhánh với trình tự gen NPV sâu khoang Ấn Độ 3.3.2 Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước Đã tạo loại sản phẩm dạng bột thấm nước có số thể vùi 2,0 x 109 OB/gam, liều lượng 500 gam/ha nhằm số thể vùi 1,0 x 1012 OB/ha để phòng trừ sâu khoang Bao gồm: chế phẩm khơng có axit Boric (ký hiệu NPV-1 WP) chế phẩm có bổ sung thêm 0,5% axit Boric (ký hiệu NPV-2 WP) Thành phần phụ gia tạo dạng bột thấm nước hai chế phẩm virus nhân đa diện NPV bao gồm 60% bột tan 40% kaoin Sản phẩm có độ ẩm từ 10-12%, pH từ 6,8- 7,0 với nồng độ phun 0,1% (Hình 3.14) Hình 3.14 Đóng gói chế phẩm NPV sau tạo dạng sử dụng 3.3.3 Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang chế phẩm tạo 3.3.3.1 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang điều kiện phịng thí nghiệm Hiệu lực phịng trừ sâu khoang phịng thí nghiệm chế phẩm NPV-1 WP đạt 81,23%, chế phẩm NPV-2 WP hiệu lực đạt 87,14% Trong đó, đối chứng sử dụng 500 sâu chết NPV theo phương pháp truyền thống đạt 46,95% 21 3.3.3.2 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang nhà lưới Hiệu lực trừ sâu khoang rau bắp cải nhà lưới sau ngày phun, chế phẩm NPV-1 WP đạt 81,13%, với chế phẩm NPV-2 WP đạt 82,92% chế phẩm Nếu sử dụng 500 sâu chết bệnh nghiền lọc phun cho 1ha với nồng độ 5% theo phương pháp cũ, hiệu lực trừ sâu đạt 47,68% Số lượng thể vùi hình thành cá thể sâu chết sau phun chế phẩm NPV-1 WP đạt tới 1,13 x 109 OB/10 sâu, chế phẩm NPV-2 đạt 1,12 x 109 OB/10 sâu Trong đó, phun dịch sâu chết bệnh số lượng thể vùi đạt 1,01 x 108 OB/10 sâu 3.3.3.3 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang ngồi đồng ruộng • Hiệu lực phịng trừ sâu khoang bắp cải Thí nghiệm diện hẹp Vân Nội (Đông Anh, Hà Nội) vụ Thu Đông 2017 Kết sau phun 10 ngày, hiệu trừ sâu chế phẩm NPV-1 WP đạt 80,51% chế phẩm NPV-2 WP có hiệu lực đạt 82,29% Trong đó, cơng thức sử dụng chế phẩm sâu chết nghiền lọc hiệu đạt 45,20% (Bảng 3.30) Bảng 3.30 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang chế phẩm NPV bắp cải đồng ruộng Vân Nội (Hà Nội) Công Thành phần thức chế phẩm Liều lượng Mật độ sâu trước Hiệu lực (%) phun phun (con/m2) 7NSP 10NSP CT NPV-1 WP 500 gam 2,6 73,42 80,51 a CT NPV-2 WP 500 gam 2,8 73,45 82,29 a CT Sâu nghiền (đ/c 1) 500 sâu 2,4 24,94 45,20 b CT Nước lã (Đ/c 2) - 2,8 - - CV (%) - - 26,863 16,482 LSD - - 20,468 22,518 Ghi chú: NSP: Ngày sau phun Đ/c: Đối chứng Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang chế phẩm NPV-1 với liều lượng khác Vân Nội (Hà Nội) vụ Đông Xuân 2018- 2019 Kết sau ngày, với liều lượng 400, 500 600 gam/ha tương ứng với số lượng thể vùi 0,8; 1,0 1,2 x 1012 OB/ha cho hiệu lực trừ sâu đạt 64,58, 71,67 77,78% (tương ứng), hiệu lực thuốc hoá học Aba Fax 3.6EC đạt tới 82,29% 22 Sau ngày phun, hiệu lực trừ sâu ứng với liều lượng 400, 500 600 gam/ha đạt 81,75, 73,44; 75,63, thuốc hoá học đạt 81,90% Sau 10 ngày, sử dụng 400 gam/ha, hiệu lực trừ sâu đạt 76,47%, với liều lượng 500 600 gam/ha đạt hiệu tương ứng 80,30 80,95%, Trong đó, thuốc hố học hiệu lực cịn 70,77% • Hiệu lực phòng trừ sâu khoang đậu tương Thí nghiệm phun NPV1 WP với lượng 400 gam/ha, hiệu trừ sâu đạt 77,18% sau phun ngày, đến 7NSP đạt 81,63% 90,76% vào 10NSP Phun 500 gam/ha, sau ngày hiệu trừ sâu đạt 84,81%, đến 10NSP hiệu đạt 96,92% Phun 600 gam/ha, đạt 89,2% vào 5NSP, đạt 97,56% vào 7NSP 98,04% vào 10NSP Trong đó, thuốc trừ sâu Aba- Fax 3.6EC sử dụng với liều lượng 200 gam/ha hiệu lực đạt 96,8 96,89% tương ứng thời điểm 10NSP (Bảng 3.33) Bảng 3.33 Hiệu lực trừ sâu khoang chế phẩm NPV-1 WP phun với liều lượng khác đậu tương đồng ruộng Mỹ Thành (Hà Nội) Công Loại thuốc thức Liều Sâu trước lượng phun (gam/ha) (con/m2) 400 2,63 Hiệu lực ngày sau phun (%) NSP 7NSP 10NSP 77,18c 81,63 c 90,76 c NPV1 WP NPV1 WP 500 2,40 84,81 b 96,92 b 96,92 b NPV1 WP 600 2,39 89,20 a 97,56 a 98,04 a Aba Fax 3.6EC 200 2,81 73,40 c 96,80 b 96,89 b Đối chứng Nước lã 2,42 - - - CV(%) - 25,948 18,924 10,016 LSD - 12,822 9,554 5,578 Ghi chú: NSP: Ngày sau phun Thí nghiệm phịng trừ sâu khoang đậu tương diện rộng, không nhắc lại với qui mơ diện tích 1,0 Hợp tác xã Mỹ Thành (huyện Mỹ Đức, Hà Nội) vụ Xuân 2018 Khi sử dụng với liều lượng 500 gam/ha chế phẩm NPV-1 WP, hiệu lực trừ sâu đạt 73,44% vào thời điểm 5NSP đạt 91,15% vào 10NSP Trong sử dụng thuốc Aba Fax 3.6EC thời điểm tương ứng đạt 75,33% 75,6% Qua theo dõi, chế phẩm NPV-1 WP không gây chết sâu hại khác loài bắt mồi ăn thịt ruộng Thể chuyên tính chế phẩm với sâu khoang cần phải phát triển chế phẩm NPV sâu hại khác để phối trộn với NPV sâu khoang, nhằm tạo sản phẩm có phổ rộng để phịng trừ lúc nhiều lồi sâu hại 23 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Xác định NPV tác nhân sinh học thường phát sinh đồng ruộng với mức độ phổ biến từ 26,67- 48,89%, tỷ lệ sâu khoang chết NPV từ 14,2221,67% Đã phân lập tuyển chọn chủng NPV (gồm TL.1a, TL.2a TL.3a), TL.1a có hoạt lực gây chết sâu khoang tới 80,09% khả hình thành thể vùi tới 2,9 x 108 OB/10 sâu 1.2 Hồn tồn nhân sinh khối tế bào sâu khoang với điều kiện thích hợp mơi trường Ex-Cell 420-14491C có bổ sung 25% FBS pH 6,8 nhiệt độ 280C Nhân nuôi tế bào điều kiện thích hợp, mật độ tế bào đạt từ 4,0255,750 x 1010 tế bào/ml thời điểm ngày sau nhân Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang với lượng 150ml môi trường Excell 420-14419C bình 250ml theo phương pháp lắc đạt mật độ 4,580- 4,879 x 1010 tế bào/ml, với lượng 750ml bình lít theo phương pháp lắc đạt 4,08 x 1010 tế bào/ml 1.3 Xác định điều kiện thích hợp lây nhiễm phát triển sinh khối NPV tế bào nuôi nhân mật độ tế bào 1,0 x 108 tế bào/ml theo số MOI 0,1, thời gian ủ lây nhiễm ngày môi trường Excell 14420-14491C có pH = 7,0 nhiệt độ 280C Lây nhiễm NPV tế bào có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml theo số MOI 0,1 đạt 1,58 x 108 OB/ml hình thành sau ngày (mức độ tăng 158 lần so với ban đầu) Hiệu lực gây chết sâu khoang NPV tạo tế bào đạt 76,27% thể vùi hình thành tới 241,1 OB/sâu 1.4 Tinh thể vùi NPV sâu khoang phương pháp ly tâm lần (2 lần nước cất xen kẽ lần SDS) lắc với tốc độ 1500 vòng/phút thời gian phút/lần, số lượng thể vùi thu 2,71 x 108 OB/ml với tỷ lệ thu hồi đến 96,79% 1.5 Bước đầu tạo chế phẩm dạng bột thấm nước NPV-1 WP NPV-2 WP chứa 2x 109 OB/gam với phụ gia gồm 60% bột tan 40% kaolin Ngoài đồng ruộng, sử dụng 500 gam/ha chế phẩm NPV-1 WP, hiệu trừ sâu khoang bắp cải đạt 80,51%, NPV-2 WP đạt 82,29%, sử dụng NPV-1 WP đậu tương đạt 91,15% Đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu sản xuất sinh khối NPV với qui mô lớn công nghệ nuôi nhân tế bào để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học sử dụng kết phục vụ nghiên cứu, giảng dạy, đạo phòng trừ sâu khoang sản xuất 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Lê Thanh Hải Hà, Lê Văn Trịnh, Hà Thị Thu Thuỷ (2017) Nghiên cứu kỹ thuật nuôi nhân Invitro tế bào sâu khoang (S litura) phục vụ sản xuất chế phẩm virus NPV Tạp chí Khoa học Viện Đại học Mở Hà Nội Số 33 (07/2017) 32- 38 Lê Thanh Hải Hà, Lê Văn Trịnh, Nguyễn Thị Nga (2017) Phân lập đánh giá hiệu lực gây chết sâu khoang vi rút NPV (Nucleo polyhedrosis virus) Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn Số 23/2017 58- 63 Lê Thanh Hải Hà, Lê Văn Trịnh (2019) Nghiên cứu tinh thể vùi Nucleo polyhedrosis virus (NPV) tạo dạng chế phẩm Tạp chí khoa học Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh Số 14 (2) 12- 20 Lê Thanh Hải Hà, Hồng Đình Hoà, Lê Văn Trịnh, Nguyễn Thị Như Quỳnh (2020) Hiệu phòng trừ sâu khoang chế phẩm NPV phát triển từ tế bào nhân ni Tạp chí Bảo vệ thực vật Số 1/2020 5-11 ... khoa học tiềm khả nhân sinh khối NPV tế bào nuôi nhân, làm sở cho vi? ??c phát triển chế phẩm sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại nước ta, vi? ??c thực đề tài: ? ?Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV). .. phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) tế bào, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Vi? ??t Nam - Bổ sung dẫn liệu khoa học mức độ phổ biến NPV sâu khoang hại bắp... điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV tế bào nuôi nhân - Thử nghiệm phát triển chế phẩm virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang dạng bột thấm