Nghiên Cứu Phân Tích Và Đánh Giá Một Số Thành Phần Hóa Học Chính Trong Dược Liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - N T H NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CHÍNH TRONG DƯỢC IỆU VÀ SẢN PHẨM CHỨA HÀ THỦ Ô ĐỎ (FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON) TẠI VIỆT NAM UẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC H Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - N T H NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CHÍNH TRONG DƢỢC IỆU VÀ SẢN PHẨM CHỨA HÀ THỦ Ô ĐỎ (FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON) TẠI VIỆT NAM Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 9440112.03 UẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC N ƣời ƣớ dẫ k oa ọc: PGS.TS Tạ T PGS.TS P ƣơ T ảo T iệ T ƣơ XÁC NHẬN NCS ĐÃ CHỈNH SỬA THEO QUYẾT NGHỊ CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN Chủ tịch hội đồng đánh giá Người hướng dẫn khoa học Luận án Tiến sĩ PGS.TS Nguyễn Văn Ri H Nội - 2019 PGS.TS Tạ Thị Thảo ỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác iả N T H ỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này, nhận giúp đỡ tận tình nhiều cá nhân tập thể, thầy giáo, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Cho phép tơi bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới: PGS.TS Tạ Thị Thảo - Trưởng mơn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội PGS.TS Phương Thiện Thương - Trưởng Khoa Hóa Phân tích Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài viết Luận án Em xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích, cho em kiến thức quý giá trình thực Luận án Em xin bày tỏ lỏng biết ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Phòng Sau đại học tạo điều kiện, giúp đỡ em suốt thời gian em học tập hoàn thành Luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Dược liệu đồng nghiệp cơng tác khoa Hố phân tích - Tiêu chuẩn Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu hỗ trợ tơi q trình thực Luận án thông qua Đề tài nghiên cứu cấp Viện Dược liệu “Ứng dụng hệ HPLC-UV/FLD nghiên cứu định lượng số hoạt chất dược liệu Đương qui Trung Quốc, Đương qui Nhật bản, Xuyên khung, Bạch chỉ, Hà thủ ô đỏ” năm 2017-2018 Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Gia đình người thân chia sẻ, động viên tơi có đủ nghị lực, tâm hoàn thành Luận án Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn ghi nhận hỗ trợ, động viên, khích lệ tơi hồn thành Luận án Quý thầy, Cô, Cơ quan, Bạn bè Gia đình Hà Nội, ngày tháng Học viê N T H năm 2019 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 12 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 15 1.1 Tổng quan Hà thủ ô đỏ 15 1.1.1 Cây Hà thủ ô đỏ 15 1.1.2 Dược liệu Hà thủ ô đỏ 16 1.1.3 Thành phần hóa học 16 1.1.4 Công dụng tác dụng dược lý Hà thủ ô đỏ 20 1.2 Phân tích định lượng số thành phần hóa học Hà thủ đỏ 21 1.2.1 Một số phương pháp phân tích sắc ký thường áp dụng phân tích thành phần hóa học Hà thủ ô đỏ 22 1.2.2 Các phương pháp phân tích Dược điển 27 1.2.3 Các nghiên cứu xác định thành phần hóa học Hà thủ ô đỏ 29 1.3 Nghiên cứu phân loại nguồn gốc mẫu ứng dụng phương pháp thống kê đa biến 41 1.3.1 Cơ sở lý thuyết 41 1.3.2 Một số nghiên cứu phân loại nguồn gốc mẫu 42 1.4 Kết luận phần tổng quan 44 Chƣơng 2: THỰC NGHIỆM 47 2.1 Đối tượng nghiên cứu 47 2.1.1 Mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ 47 2.1.2 Mẫu sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ 50 2.2 Hoá chất, thiết bị 51 2.2.1 Chất chuẩn 51 2.2.2 Các hoá chất khác 53 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 53 2.3 Phương pháp nghiên cứu 54 2.3.1 Tối ưu hoá điều kiện hệ thống sắc ký 54 2.3.2 Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu 57 2.3.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 61 2.3.4 Xử lý số liệu thực nghiệm 63 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1 Phát triển phương pháp HPLC/UV để định lượng số thành phần hóa học có dược liệu Hà thủ đỏ Việt Nam 68 3.1.1 Lựa chọn điều kiện phân tích HPLC/UV 68 3.1.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn 79 3.1.3 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ 82 3.1.4 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 88 3.1.5 Qui trình phân tích định lượng THSG, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ phương pháp HPLC/UV 94 3.1.6 Kết luận phương pháp HPLC/UV xây dựng 95 3.2 Xây dựng phương pháp định lượng số thành phần dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam HPLC/FL 96 3.2.1 Lựa chọn điều kiện phân tích HPLC/FL 97 3.2.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 97 3.2.3 Qui trình phân tích định lượng THSG, RES, PC, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ phương pháp HPLC/FL 111 3.2.4 So sánh phương pháp HPLC/FL xây dựng với phương pháp đối chiếu HPLC/UV 112 3.2.5 Kết luận phương pháp HPLC/FL xây dựng 115 3.3 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời số thành phần dược liệu Hà thủ đỏ Việt Nam TLC/SD 116 3.3.1 Lựa chọn điều kiện phân tích TLC/SD 116 3.3.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 121 3.3.3 Qui trình phân tích định lượng THSG, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ phương pháp TLC/SD 128 3.3.4 So sánh phương pháp TLC/SD xây dựng với phương pháp HPLC/UV đối chiếu 129 3.3.5 Kết luận phương pháp TLC/SD xây dựng 132 3.4 Ứng dụng phân tích đánh giá chất lượng phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ 132 3.4.1 Phân tích hàm lượng hoạt chất dược liệu sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ phương pháp HPLC/FL 132 3.4.2 Bước đầu phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ dựa hàm lượng hoạt chất định lượng 137 KẾT LUẬN 140 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 143 TÀI LIỆU THAM KHẢO 144 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây rễ củ Hà thủ ô đỏ 15 Hình 1.2 Dược liệu Hà thủ đỏ 16 Hình 1.3 Một số hợp chất stilben có dược liệu Hà thủ ô đỏ 17 Hình 1.4 Một số hợp chất anthraquinon có dược liệu Hà thủ đỏ 19 Hình 1.5 Sơ đồ thể ảnh hưởng lực rửa giải đến tách pic chất HPLC 23 Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống thiết bị hệ thống HPLC 23 Hình 2.1 Một số mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ dùng nghiên cứu 49 Hình 2.2 Một số mẫu sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ dùng nghiên cứu 50 Hình 2.3 Cơng thức cấu tạo hợp chất dùng nghiên cứu 51 Hình 2.4 Sơ đồ khảo sát phương pháp xử lý mẫu dược liệu Hà thủ đỏ 58 Hình 3.1 Phổ UV-VIS chất định phân 68 Hình 3.2 SKĐ HPLC/UV ứng với điều kiện sắc ký lựa chọn 72 Hình 3.3 SKĐ HPLC/UV so sánh nhiệt độ lò cột 76 Hình 3.4 SKĐ HPLC/UV phân tích THSG, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ với điều kiện sắc ký lựa chọn 78 Hình 3.5 Đường chuẩn định lượng THSG, EM PS phương pháp HPLC/UV 81 Hình 3.6 Ảnh hưởng dung môi chiết đến hàm lượng THSG, EM PS 83 Hình 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết THSG, EM, PS (n=3) 84 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất chiết THSG, EM, PS 85 Hình 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ thể tích dung môi chiết/khối lượng dược liệu đến hiệu suất chiết THSG, EM, PS 86 Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian chiết số lần chiết hồi lưu đến hiệu suất chiết THSG, EM, PS 86 Hình 3.11 Phương pháp xử lý mẫu Hà thủ ô đỏ phân tích định lượng THSG 87 Hình 3.12 Phương pháp xử lý mẫu Hà thủ đỏ phân tích định lượng EM,PS 87 Hình 3.13 SKĐ HPLC/UV đánh giá tính đặc hiệu THSG 88 Hình 3.14 SKĐ HPLC/UV đánh giá tính đặc hiệu EM PS 88 Hình 3.15 Qui trình phân tích định lượng THSG EM, PS dược liệu Hà thủ ô đỏ phương pháp HPLC/UV 95 Hình 3.16 Đường chuẩn định lượng THSG, RES PC phương pháp HPLC/FL 98 Hình 3.17 Đường chuẩn định lượng EM PS phương pháp HPLC/FL 101 Hình 3.18 SKĐ HPLC/FL đánh giá tính đặc hiệu EM PS 103 Hình 3.19 SKĐ HPLC/FL đánh giá tính đặc hiệu THSG, RES PC 103 Hình 3.20 Qui trình phân tích định lượng THSG, RES, PC EM, PS dược liệu Hà thủ ô đỏ phương pháp HPLC/FL 111 Hình 3.21 Đường hồi qui so sánh kết phân tích hàm lượng THSG, EM PS HPLC/UV HPLC/FL 114 Hình 3.22 SKĐ TLC so sánh HDM rửa giải khác 116 Hình 3.23 SKĐ TLC/SD phân tích THSG, EM, PS dược liệu Hà thủ ô đỏ với HDM5 117 Hình 3.24 Đường chuẩn định lượng THSG, EM PS phương pháp TLC/SD 119 Hình 3.25 SKĐ TLC/SD phân tích THSG Hà thủ đỏ 122 Hình 3.26 SKĐ TLC/SD phân tích EM PS Hà thủ ô đỏ 122 Hình 3.27 Qui trình phân tích định lượng THSG, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ phương pháp TLC/SD 128 Hình 3.28 Đường hồi qui so sánh kết phân tích hàm lượng THSG, EM, PS phương pháp TLC/SD HPLC/UV 131 Hình 3.29 Hàm lượng THSG, EM, PS, RES, PC mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ 133 Hình 3.30 Đồ thị HCA phân tích mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ 137 Hình 3.31 Đồ thị PCA phân tích mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ 138 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Chỉ tiêu định lượng hoạt chất dược liệu Hà thủ ô đỏ số Dược điển 28 Bảng 1.2 Một số phương pháp phân tích định lượng hoạt chất Hà thủ ô đỏ đối tượng liên quan 39 Bảng 2.1 Thông tin mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ dùng cho nghiên cứu 47 Bảng 2.2 Thông tin mẫu Hà thủ ô đỏ chế dùng cho nghiên cứu 50 Bảng 2.3 Các thông số khảo sát tối ưu hoá điều kiện hệ thống sắc ký 55 Bảng 2.4 Điều kiện phân tích MS 56 Bảng 2.5 Điều kiện khảo sát nhiệt độ chiết 59 Bảng 2.6 Điều kiện khảo sát tỷ lệ thể tích dung mơi chiết/khối lượng dược liệu 60 Bảng 2.7 Điều kiện khảo sát thời gian chiết số lần chiết 61 Bảng 3.1 Chương trình dung mơi rửa giải 70 Bảng 3.2 Thông số đánh giá pic chất định phân điều kiện rửa giải khác 71 Bảng 3.3 Bảng phân tích liệu phổ MS số pic 72 Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH pha động (sử dụng acid formic) đến thông số pic chất định phân 75 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thể tích mẫu tiêm vào cột đến thông số pic chất định phân 77 Bảng 3.6 Điều kiện HPLC/UV tối ưu phân tích THSG, EM PS dược liệu Hà thủ ô đỏ 78 Bảng 3.7 Khoảng nồng độ xây dựng đường chuẩn THSG, EM, PS phương pháp HPLC/UV 80 Bảng 3.8 LOD, LOQ đường chuẩn THSG, EM PS phương pháp HPLC/UV 81 Bảng 3.9 Thông số đặc trưng THSG, EM, PS theo phương pháp HPLC/UV 89 Bảng 3.10 Tính thích hợp hệ thống THSG, EM PS phương pháp HPLC/UV 89 Bảng 5.1 Độ lặp lại ngày khác ngày THSG, EM PS phương pháp TLC/SD Ngày THSG N Diện tích Lượng cân pic mẫu thử (mAU.s) (g) EM Hàm lượng Diện tích pic (%) (mAU.s) PS Lượng cân Hàm lượng Diện tích pic Lượng cân Hàm lượng mẫu thử (g) (mg/g) (mAU.s) mẫu thử (g) (mg/g) 6189,1 0,5008 1,79 3100,7 1,0051 1,10 2254,2 1,0051 0,53 6289,3 0,5125 1,78 3218,8 1,0191 1,11 2286,4 1,0191 0,52 6118,5 0,5094 1,76 3209,5 1,0209 1,12 2293,2 1,0209 0,53 6167,7 0,5043 1,78 3386,3 1,1021 1,13 2300,1 1,1021 0,52 6300,4 0,5167 1,77 3588,9 1,1718 1,10 2312,4 1,1718 0,52 6328,8 0,5236 1,76 3290,2 1,1182 1,09 2297,6 1,1182 0,52 Ngày 6221,5 0,5003 1,79 3384,1 1,1118 1,06 2294,6 1,1118 0,53 6060,8 0,5002 1,77 3267,2 1,0201 1,07 2289,5 1,0201 0,53 6189,4 0,5108 1,77 3099,5 1,0109 1,09 2277,3 1,0109 0,52 6008,7 0,5040 1,75 3388,1 1,1176 1,11 2299,5 1,1176 0,54 6335,0 0,5111 1,79 3546,5 1,1910 1,10 2321,2 1,1910 0,53 6509,8 0,5302 1,78 3226 1,0272 1,11 2258,3 1,0272 0,52 30 PHỤ LỤC 6: Kết xây dựng thẩm định phương pháp HPLC/FL phân tích EM, PS, THSG, RES, PC Hà thủ ô đỏ 6.1 Đường chuẩn EM, PS 31 32 33 6.2 Đường chuẩn THSG, PC, RES 34 35 36 37 6.3 Tính thích hợp hệ thống EM, PS 38 39 40 6.4 Tính thích hợp hệ thống THSG, RES, PC 41 42 43 Bảng 6.1 Kết phân tích độ lặp lại ngày khác ngày THSG, RES, PC, EM PS phương pháp HPLC/FL Lượng n Ngày Ngày cân mẫu thử (g) Diện tích pic Hàm lượng Diện tích pic Hàm lượng Diện tích pic Hàm lượng Lượng cân mẫu (mAU.s) (mg/g) (mAU.s) (%) (mAU.s) (mg/g ) thử (g) PC RES THSG EM PS Diện tích pic Hàm lượng Diện tích pic Hàm lượng (mAU.s) (mg/g) (mAU.s) (mg/g) 0,5116 202266 0,115 17645728 1,87 102607 0,061 1,0001 18740202 1,094 1192444 0,527 0,5087 211612 0,121 17451876 1,86 103698 0,062 1,0003 18890901 1,091 1157677 0,533 0,5100 215660 0,123 17684609 1,88 105640 0,063 1,0003 18900080 1,090 1146545 0,532 0,5002 202918 0,118 17437047 1,89 101966 0,062 1,0006 18999902 1,102 1154539 0,530 0,5032 207594 0,120 17356001 1,87 104232 0,063 1,0005 18901082 1,090 1129780 0,527 0,5007 201399 0,117 17177421 1,86 105360 0,064 1,0002 18976785 1,102 1154876 0,531 0,5006 199638 0,116 17358657 1,88 103693 0,063 1,0000 19202921 1,116 1196214 0,527 0,5112 209137 0,119 17443355 1,85 104208 0,062 1,0003 19000283 1,108 1167323 0,530 0,5012 208492 0,121 17194575 1,86 98874 0,060 1,0005 19300091 1,113 1199840 0,522 0,5060 203531 0,117 17452577 1,87 103148 0,062 1,0003 19308729 1,117 1163638 0,531 0,5100 213906 0,122 17496475 1,86 102286 0,061 1,0007 18920291 1,106 1186172 0,525 0,5004 202999 0,118 17259426 1,87 98716 0,060 1,0002 18876587 1,094 1109840 0,530 44 ... lượng mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ Ở Việt nam có số nghiên cứu phân tích thành phần hóa học dược liệu Hà thủ đỏ số loại dược liệu chi với Hà thủ ô đỏ [10,12] Nghiên cứu [12] thực nghiên cứu định...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - N T H NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CHÍNH TRONG DƢỢC IỆU VÀ SẢN PHẨM CHỨA... 1.2.1 Một số phương pháp phân tích sắc ký thường áp dụng phân tích thành phần hóa học Hà thủ đỏ 22 1.2.2 Các phương pháp phân tích Dược điển 27 1.2.3 Các nghiên cứu xác định thành phần