Tiểu luận: Phương pháp định lượng protein

Để hạn chế những biến đổi có thể xảy ra đối với protein, mẫu nên được thu nhận nhanh nhất có thể và đặt ngay vào môi trường cách ly ở nhiệt độ thấp (từ 0 đến 4 o C). Điều này là tối quan trọng, đặc biệt khi protein được cách li để tiến hành các phân tích sâu hơn (ví dụ như điện di), môi trường cách ly bao gồm những chất ngăn ngừa sự tạp nhiễm của vi khuẩn (VD: 0,1 mM sodium azide), bảo vệ protein khỏi những chất tạo phức (VD: Cu, …) như (VD: Ethylenediaminetetraacetic acid 2 mM), ngăn chặn các thoái hóa protein do các protease nội sinh (VD: phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 mM).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM KHOA KĨ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN GVHD: Ts PHAN NGỌC HỊA TP HỒ CHÍ MINH, ngày 11/12/2011 MỤC LỤC KHUYẾN NGHỊ CĂN BẢN CHO Q TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 2.1 2.1.1 Lĩnh vực áp dụng 2.1.2 Ưu điểm hạn chế 2.2 Nguyên tắc chung 2.3 Định lượng nitơ tổng 2.3.1 Vơ hóa mẫu (trong tủ Hotte) 2.3.2 Cất đạm (trong máy cất đạm) 2.3.3 Chuẩn độ 2.4 Tổng quan Định lượng nitơ phi protein PHƯƠNG PHÁP BIURET 3.1 Nguyên tắc chung 3.2 Ưu điểm hạn chế 10 3.3 Định lượng protein phương pháp so màu, có mặt thiol 10 3.4 Định lượng protein phương pháp so màu với can thiệp TCA 10 3.5 Định lượng protein phương pháp so màu mẫu giàu lipid 10 3.6 Định lượng protein phương pháp so màu, có mặt đường khử 10 3.7 Định lượng protein phương pháp so màu, có mặt DNA 10 PHƯƠNG PHÁP LOWRY 11 4.1 Nguyên tắc chung 11 4.2 Ưu điểm hạn chế 11 PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT THUỐC NHUỘM (DYE-BINDING) 12 5.1 Nguyên tắc chung 12 5.2 Phương pháp Bradford 12 5.2.1 5.3 Phương pháp Udy 13 5.3.1 5.4 Nguyên tắc 12 Nguyên tắc 13 Ưu điểm hạn chế phương pháp liên kết thuốc nhuộm 13 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TNBS (TNBS- SPECTROPHOTOMETRIC) 13 6.1 Nguyên tắc 13 6.2 Ưu điểm hạn chế 13 PHƯƠNG PHÁP HẤP THU TIA CỰC TÍM (ULTRAVIOLET ABSORPTION) 14 7.1 Nguyên tắc chung 14 7.2 Ưu điểm hạn chế 14 7.3 Lĩnh vực áp dụng 14 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY) 15 8.1 Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Column Chromatography) 15 8.1.1 Nguyên tắc 15 8.1.2 Các bước tiến hành tổng quát 16 8.1.3 Ưu điểm hạn chế 16 8.2 Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography) 17 8.2.1 Nguyên tắc 17 8.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High-Performance Liquid Chromatography – HPLC) 18 8.3.1 Nguyên lí 18 8.3.2 Ưu điểm hạn chế 19 8.4 Phương pháp sắc ký lực – hấp phụ (Affinity Chromatography) 19 8.4.1 Nguyên tắc 19 PHƯƠNG PHÁP DUMAS 20 9.1 Nguyên tắc 20 9.2 Ưu điểm hạn chế 20 Tài liệu tham khảo 20 Danh mục hình Hình 1.phức hợp protein-đồng Hình đo cường độ màu sắc 540 nm Hình đo cường độ màu 750 nm 11 Hình phản ứng nhuộm màu với Coomassie Brilliant Blue G-250 13 Hình cột sắc ký lọc gel 15 Hình sắc ký trao đổi ion 17 Hình tương tác protein với pha tĩnh pha động 18 Hình veggies cap 20 Hình quy trình Phương Pháp Dumas 20 KHUYẾN NGHỊ CĂN BẢN CHO Q TRÌNH PHÂN TÍCH Để hạn chế biến đổi xảy protein, mẫu nên thu nhận nhanh đặt vào môi trường cách ly nhiệt độ thấp (từ đến 4oC) Điều tối quan trọng, đặc biệt protein cách li để tiến hành phân tích sâu (ví dụ điện di), môi trường cách ly bao gồm chất ngăn ngừa tạp nhiễm vi khuẩn (VD: 0,1 mM sodium azide), bảo vệ protein khỏi chất tạo phức (VD: Cu, …) (VD: Ethylenediaminetetraacetic acid mM), ngăn chặn thối hóa protein protease nội sinh (VD: phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 mM) Protein cần phân riêng tinh chế, nhằm múc đích tách riêng biệt protein, dạng đồng nhóm protein phù hợp cho q trình phân tích sâu hơn, từ nguyên liệu ban đầu Có nhiều biện pháp phân riêng tinh chế protein, cụ thể như: o Chiết (Etraction) o Deproteination o Lọc (Filtration) o Ly tâm (Centrifugation) o Kết tủa muối (Salting-Out) o Thẩm tách thẩm tách điện (Dialysis & Electrodialysis) o Lọc phương pháp sắc ký ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 2.1 Tổng quan 2.1.1 Lĩnh vực áp dụng Phương pháp Kjeldahl kỹ thuật quan trọng phân tích thực phẩm, sử dụng tham chiếu để so sánh với phương pháp khác 2.1.2 Ưu điểm hạn chế 2.1.2.1 Ưu điểm - Sai số không vượt 1% - Khả lặp lại kết tốt - Dễ thao tác - Phân tích tất loại protein thực phẩm 2.1.2.2 Hạn chế - Yêu cầu lượng mẫu lớn - Thời gian phân tích dài - Độ phân giải thấp tính chọn lọc khơng cao 2.2 Ngun tắc chung Sự khác biệt chủ yếu giữ phương pháp Kjeldahl chất xúc tác sử dụng q trình vơ hóa mẫu, kỹ thuật cất đạm chuẩn độ Tuy có khác chung phương pháp Kjeldahl bao gồm năm bước: a) Chuẩn bị mẫu cân mẫu b) Bổ sung chất phản ứng c) Vô hóa mẫu d) Cất đạm e) Chuẩn độ Khối lượng mẫu lấy biến động từ 0,2 đến 2,0g, phụ thuộc vào lượng protein mẫu đem kiểm nghiệm Đối với mẫu lượng protein nằm khoảng – 25%, lượng mẫu tối ưu cần lấy 0,5 – 1,0g Trong trình tiến hành cần thêm vào mẫu nhóm chất với chức khác q trình vơ hóa mẫu: a) Sulfuric acid: tác nhân oxy hóa hợp chất hữu thành CO2, H2O, bẻ gãy chuyển hóa hợp chất chứa nitơ thành khí NH3 tự do, sau liên kết với NH3 tạo thành muối (NH4)2SO4 b) Muối (K2SO4, Na2SO4): cần thiết cho trình nâng cao nhiệt độ q trình vơ hóa c) Các chất xúc tác đẩy nhanh q trình oxy hóa: bao gồm kim loại: Hg, Cu, Se; oxide: CuO, HgO, P2O5, TiO2; peroxide: Hg2O2; muối: CuSO4, Hg2SO4 Thủy ngân oxide thủy ngân chất xúc tác oxy hóa hiệu nhiên, gây nhiễm mơi trường, nguy hiểm cho người đặc biệt tạo phức hợp với NH3, gây khó khăn cho trình cất đạm sau Để phân tách phức hợp amoniac – thủy ngân, nitrate nitrite, dung dịch natri thiosulfate salicylic thêm vào Tuy khả xúc tác hơn, q trình vơ hóa mẫu chậm so với thủy ngân đồng thân thiện với môi trường nên chúng sử dụng nhiều (đã phê duyệt ISO AOAC) Hiệu thân thiện với môi trường xúc tác CuSO4 Qua trình vơ hóa mẫu sử dụng để chuyển hóa nitơ hợp chất hữu thành ion amoni Sự có mặt sulfuric acid làm hạn chế nhiệt độ vơ hóa (nhiệt độ sơi sulfuric acid 338oC, muối K2SO4 Na2SO4 thêm vào nhằm tăng điểm sôi hỗn hợp, giảm thời gian phân hủy hợp chất hữu cơ, tạo điều kiện phân hủy hợp chất khó vơ hóa Nhiệt độ sơi hỗn hợp tăng gần tuyến tính với tỷ lệ K2SO4/H2SO4 (g/mL), đạt 383oC vơi tỷ lệ 1:1, tỷ lệ 2:1 nhiệt độ đạt 450oC K2SO4 không thêm vào để tăng nhiệt độ sơi hỗn hợp mà cịn hấp thu bớt lượng H2SO4 để tạo thành KHSO4 Trong thực phẩm cịn bào gồm hợp chất kháng vơ hóa nitrate, nitrite, alkaloid, pyridine, chinoline derivative, triazole, pyrazolone, aminopyrine antipyrine Để q trình vơ hóa dễ dàng hơn, ta cần bổ sung chất crom, kẽm, sắt (IV) sulfate, salicylic acid đường sucrose Những mẫu có chất béo với protein khó vơ hóa dễ tạo bọt so với mẫu giàu protein, carbohydrate Để ngăn chặn tạo bọt boiling rod hoăc chip sử dụng, thêm vài giọt hydrogen peroxide octanol, dùng chất tạo nhũ đặc biệt chống tạo bọt Trong điều kiện bình thường, chất chống tạo bọt bỏ qua áp dụng làm nóng hai giai đoạn Ở giai đoạn đầu, mẫu đốt thành tro, phải tiến hành cẩn thận nâng nhiệt mẫu lên đến 200oC Giai đoạn hai, nâng nhiệt mẫu đến 420oC, bao gồm thời gian cần thiết để mẫu vơ hồn tồn Sau khống hóa hồn thành, phải làm lạnh nhiệt độ mẫu đến nhiệt độ phòng Theo nguyên tắc, protein định lượng cách xác định lượng nitơ tổng nitơ phi protein, từ tính nitơ protein Định lượng nitơ protein ta nhân kết với hệ số định (VD: 6,25 hàm lượng Nitơ protein 16% , hàm lượng cao ổn định) Nitơprotein = Nitơtổng – Nitơphi protein Hệ số cho nhóm thực phẩm định Cụ thể như: 2.3 Định lượng nitơ tổng  Nguyên tắc tiến hành: 2.3.1 Vơ hóa mẫu (trong tủ Hotte)  Ở nhiệt độ cao, tác dụng H2SO4 hợp chất chứa nitơ bị phân hủy bị oxy hóa thành CO2, H2O, NH3 NH3 kết hợp H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 2.3.2 Cất đạm (trong máy cất đạm)  Đuổi NH3 khỏi muối dung dịch NaOH  (NH4)2SO4 + NaOH  Na2SO4 + NH3 + H2O  Lượng NH3 lôi máy Parmas, sau dẫn đến erlen có chứa sẵn lượng thừa H2SO4 xác định xác nồng độ NH3 kết hợp H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4  NH3 + H2SO4 dư  (NH4)2SO4 + H2SO4 dư 2.3.3 Chuẩn độ  Chuẩn độ lượng acid dư dung dịch NaOH qua tính lượng Nitơ có mẫu  NaOH + H2SO4  Na2SO4 + H2O  Tính toán kết 2.4 Định lượng nitơ phi protein  Nguyên tắc tiến hành  Dùng dung môi chiết rút tất dạng nitơ phi protein  Do dịch chiết cịn lẫn vài loại protein, ta cần dùng chất kết tủa protein hòa tan q trình chiết rút  Kết tủa Protein tiến hành theo nhiều cách phổ biến ta dùng TCA 10%, Pb(CH3COO)2 10 – 15%, CuSO4 10% hỗn hợp với NaOH 10% với tỉ lệ 1:1  Lọc kết tủa protein  Vơ hóa dung dịch phi protein  Cất đạm  Chuẩn độ  Tính tốn kết PHƯƠNG PHÁP BIURET 3.1 Ngun tắc chung  Phương pháp Biuret dựa hình thành phức màu xanh tím có độ hấp thu cực đại bước sống 540nm đồng liên kết amide dung dịch kiềm mạnh Cường độ màu tỷ lệ thuận với số liên kết peptide chuỗi Hình 1.phức hợp protein-đồng Hình đo cường độ màu sắc 540 nm 3.2 Ưu điểm hạn chế Ưu điểm: đơn giản, nhanh chóng Hạn chế: o Độ nhạy o Dễ bị nhiễu mẫu protein chứa thiol, DNA, saccharide chất béo  Phản ứng Biuret trải qua số CẢI BIẾN sau 3.3 Định lượng protein phương pháp so màu, có mặt thiol Các thiol (β-mercaptoethanol, β-mercaptoethylamine, glutathione) ngăn chặn hầu hết trường hợp cách thêm vào chất phản ứng Biuret chalate với EDTA Tuy nhiên mẫu có dithiothreitol (DTT), ta cần thêm vào iodoacetamide trước thêm chất phản ứng 3.4 Định lượng protein phương pháp so màu với can thiệp TCA Phương pháp dựa việc kết tủa protein cách thêm vào trichloacetic (nồng độ – 25%) tùy thuộc vào thành phần protein, phân tách kết tủa khỏi dịch mẫu phương pháp lọc, giải kết tủa dung dịch muối KOH, xác định protein với phản ứng Biuret 3.5 Định lượng protein phương pháp so màu mẫu giàu lipid Mẫu với tỷ lệ lipid/protein phospholipid/protein cao có độ đục cao khó tiến hành xác định so màu Vì trước tiến hành phản ứng so màu cần phải tách lipid khỏi mẫu hỗn hợp trích ly (VD: acetone:petroleum ether 1:1) Mẫu khơng chứa lipid hòa tan vào muối natri deoxycholate 10% NaOH Sau xử lí mẫu với chất phản ứng Biuret 3.6 Định lượng protein phương pháp so màu, có mặt đường khử Đường khử có khả làm gây trở ngại phản ứng Biuret Do đó, H2O2 thêm vào để oxy hóa đường khử Ngồi ra, tăng thêm 10 lần nồng độ chất phản ứng Biuret 3.7 Định lượng protein phương pháp so màu, có mặt DNA Độ hấp thu tia cực tím phức hợp Protein – đồng dung dịch đồng sulfate nhạy gấp 10 – 15 lần so với phản ứng Biuret tiêu chuẩn Có thể định lượng xác định protein dung dịch loãng (0,01 – 0,1 mg/mL) Ellman (1962), đề xuất phương án đo độ hấp thu phức hợp protein – đồng 263nm, sử dụng đồng sulfate 0,04% dung dịch NaOH 2N lựa chọn bước 10 sóng trường hợp mẫu protein có chứa DNA bị giới hạn, khả hấp thu cao DNA Và đó, Itzhaki Gill (1964) phát triển thủ tục dựa đo độ hấp thu 310 nm, an tồn sử dụng với mẫu nồng độ DNA đạt 0,7 mg/mL hỗn hợp phản ứng cuối PHƯƠNG PHÁP LOWRY 4.1 Nguyên tắc chung Phương pháp phát triển Lowry (1951) dựa sở phản ứng màu thuốc thử Folin-Ciocalteau với liên kết peptide protein, peptide acid amin thơm (tyrosine, tryptophan,histidine) mơi trường kiềm thích hợp Phản ứng tiến hành qua hai giai đoạn bản: a) Phản ứng Biuret: ion đồng (Cu2+) tạo phức với protein có hai liên kết peptide b) Khử phosphomolybdic acid (thuốc thử Folin): khử Folin phực hợp protein đồng thành molybdenum blue có độ hấp thu cực đại 750 nm Hình đo cường độ màu 750 nm Thuốc thử Folin-Ciocalteau có phản ứng với số chất hóa học khác amino acid tự do, hợp chất thiol, saccharide, lipid, fatty acid, amin, EDTA,… nguyên nhân gây nhiễu cho trình định lượng phương pháp Lowry Để loại bỏ hạn chế tác động chất gây nhiễu trên, kỹ thuật phải trải qua trình bổ sung bao gồm: nâng nhiệt trước sau cho thuốc thử Folin, thêm perhydrate, chloramine-T, SDS, trích với dung mơi hữu để loại bỏ lipid 4.2 Ưu điểm hạn chế Ưu điểm: độ nhạy cao (gấp 100 lần so với Biuret gấp 10 lần so với đo quang phổ) 11 Hạn chế: dễ bị nhiễu xác định protein phân tử không chứa vòng thơm PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT THUỐC NHUỘM (DYE-BINDING) Kỹ thuật khuyến nghị chủ yếu dùng cho phân tích protein sữa để phân tích định kỳ sản phẩm thực phẩm có hàm lượng protein thấp như: bia, rượu vang, nước ép rau quả, … 5.1 Nguyên tắc chung Cơ sở phương pháp, phản ứng, điều kiện cụ thể, với thuốc nhuộm có chứa nhóm sulfunic acid (– SO3H), nhóm chức đặt biệt nhóm chuỗi bên arginine, lysine, histidine tạo màu dung dịch thuốc nhuộm, cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein thực phẩm Thuốc nhuộm hữu liên kết với protein liên kết ion, tĩnh điện, van der Waals Phản ứng tối ưu môi trường acid mạnh, tạo phức tan khơng tan Vì nồng độ protein dễ dàng xác định thông qua đo cường độ màu dung dịch thuốc nhuộm trước sau thêm protein, sau tách riêng phức hợp protein-thuốc nhuộm không tan phương pháp lọc ly tâm Một số thuốc nhuộm như: Amido Black 10B, Coomassie Brilliant Blue G-250, Orange G, and Acid Orange 12 sử dụng phổ biến phân tích thực phẩm Trong hai phương pháp sử dụng phổ biến để phân tích hàm lượng protein thực phẩm Bradford Udy 5.2 Phương pháp Bradford 5.2.1 Nguyên tắc Được phát triển Bradford (1976), thuốc nhuộm sử dụng Coomassie Brilliant Blue G-250 tạo phức với protein môi trường kiềm yếu Có thể tạo kết tủa nhiệt độ thấp (0oC) sử dụng TCA nhiệt độ phịng, hay dùng muối calci phosphate để đơng tụ protein 12 Hình phản ứng nhm màu với Coomassie Brilliant Blue G-250 5.3 Phương pháp Udy 5.3.1 Nguyên tắc Được phát triển Udy (1971), thuốc nhuộm dùng Acid Orange 12 để kết tủa phức protein – thuốc nhuộm 5.4 Ưu điểm hạn chế phương pháp liên kết thuốc nhuộm Ưu điểm: phương pháp nhanh đơn giản, thuận tiện cho việc sử dụng thường xuyên, nhạy (nhạy lơn Lowry – lần), tốn Màu thường phát triển chưa đến phút bền 0,5 – h Ít bị nhiễu muối, chất đệm chất khử phương pháp Lowry Không cần phải thao tác khéo léo sử dụng hóa chất ăn mòn phương pháp Kjeldahl Hạn chế: loại thuốc nhuộm có lực khác số protein tinh khiết phản ứng liên kết khác nhau, tùy thuộc vào cấu trúc chúng Hầu phương pháp phải điều chỉnh với loại protein cho lần áp dụng Do phương pháp không áp dụng để định lượng protein tổng kiểm nghiệm tổng quát PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TNBS (TNBS-SPECTROPHOTOMETRIC) 6.1 Nguyên tắc TNBS (2,4,6-trinitrobenzene 1-sulfonic acid) phản ứng với nhóm amino amino acid, peptide protein điều kiện kiềm nhẹ (pH đến 9) phản ứng kết thúc giảm pH 6.2 Ưu điểm hạn chế Độ nhạy cao vài lần so với phương pháp hấp thu tia cực tím, ưu điểm có tính cụ thể cao, bị ảnh hưởng chất gây nhiễu 13 PHƯƠNG PHÁP HẤP THU TIA CỰC TÍM (ULTRAVIOLET ABSORPTION) 7.1 Nguyên tắc chung Các protein có chứa acid amin thơm, đặc biệt tyrosine tryptophan thể kiểm nghiệm thành công với kỹ thuật hấp thu tia cực tím Để hạn chế hấp thu acid nucleic, cần pha lỗng mẫu đến nồng độ thích hợp để xác định mật độ quang 260nm 280nm o Kalcker (1947) đề xuất công thức đơn giản để tính tốn nồng độ protein từ xét nghiệm đo phổ, phương trình ơng có dạng: Pc (mg/mL) = 1,45 D280 + 0,74 D260 o Whitaker Graham (1980) đề xuất phương pháp trực tiếp để định lượng protein dựa khác độ hấp thu, phương trình có dạng: Pc (mg/mL) = (A235 to A280) 2.51 Ưu điểm phương pháp bị nhiễu acid nucleotic 7.2 Ưu điểm hạn chế Ưu điểm: nhanh đơn giản Hạn chế : Kết khơng xác với dung dịch có 20% acid nucleotic dung dịch bị đục 7.3 Lĩnh vực áp dụng Phương pháp đặt biệt khuyến nghị áp dụng để phân tích loạt mẫu có hàm lượng protein tương đối thấp nồng độ muối amoni cao khiến phương pháp khác trở nên không hiệu Thông qua định lượng protein, phương pháp dùng để kiểm tra mức độ thủy phân protein 14 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY) Phương pháp sắc ký thường dùng để tinh protein, sau protein tinh phân tích định lượng thông qua phương pháp khác vi dụ đo qua phổ 8.1 Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Column Chromatography) Hình cột sắc ký lọc gel Phương pháp sắc ký điện di sử dụng thành công để phân tách trực tiếp protein khỏi thành phần khác dịch chiết thực phẩm Nó sử dụng kỹ thuật giúp tiện lợi cho việc phân đoạn sơ peptide trước chúng phân tích sâu cách lập đồ TLC (sắc ký mỏng) peptide, sắc ký cột trao đổi ion, điện di mao quản phương pháp khác 8.1.1 Nguyên tắc Kỹ thuật cho phép phân tách loại protein cở sở đặc điểm khác loại protein hình dạng kích thước Các hạt sử dụng để nhồi cột mang lỗ có kích thước khác Những phân tử nhỏ bên lẫn hạt, phân tử lớn bên ngồi hạt Vì vậy, phân tử có kích thước lớn cột chảy nhanh ngồi trước Phân tử có kích thước trung bình, vào bên hạt rời khỏi cột vị trí giữa; cịn phân tử nhỏ phải qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sau Các phân tử protein nhỏ có nhiều khả thâm nhập vào tất lỗ; vậy, thời gian chạy qua cột dài thời gian hồi lưu muộn Ngược lại, phân tử protein kích thước lớn có thời gian hồi lưu (chạy qua toàn cột) sớm 15 Đối với loại cột, phân đoạn sắc ký thu nồng độ muối khác thời gian hồi lưu khác để thu loại protein quan tâm nghiên cứu Các phân đoạn có hoạt tính protein quan tâm cao tích lũy tiến hành tinh bổ sung 8.1.2 Các bước tiến hành tổng quát Mẫu nạp vào đầu cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer khơng tan có tính hydrate hóa cao dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide Sephadex, Sepharose, Bio-gel loại gel phổ biến thị trường có sẵn hạt có lỗ với đường kính chuẩn 100µm (0.1mm) Độ tinh sản phẩm protein tăng lên phân đoạn protein chạy qua nhiều cột sắc ký khác Thông thường cột sắc ký đơn lẻ không đủ để tinh loại phân tử protein mong muốn dù q trình sắc ký lặp lặp lại nhiều lần, thay vào người ta thường phải áp dụng chuỗi bước kỹ thuật để thu phân đoạn chứa lượng lớn loại protein cần quan tâm nghiên cứu 8.1.3 Ưu điểm hạn chế Ưu điểm: phương pháp sắc kỹ lọc gel tương đối đơn giản, cột gel kết hợp dòng chảy qua quang phổ kế hệ thống máy vi tính theo dõi q trình, phương pháp thuận tiện hữu ích Hạn chế: phương pháp lọc gel, thời gian lưu acid amin, protein có chứa vịng thơm cột kéo dài, mà không bị phân tách theo thứ tự trọng lượng phân tử 16 8.2 Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography) Hình sắc ký trao đổi ion 8.2.1 Nguyên tắc Tại điểm pH trừ điểm đẳng điện, protein có mang điện tích tương ứng với điểm pH Dựa vào điện tích thực chúng điểm pH định, ta phân tách hỗn hợp protein Phương pháp gọi phương pháp sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp này, pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử (protein) mang điện tích trái 17 dấu với chúng Cụ thể, hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình gọi sắc ký trao đổi ion dương, tương tác với phân tử mang điện tích dương Ngược lại, hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi sắc ký trao đổi ion âm, tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion pha động, ion phân tử protein tương tác với hạt mang điện tích Hình tương tác protein với pha tĩnh pha động 8.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High-Performance Liquid Chromatography – HPLC) 8.3.1 Nguyên lí HPLC dựa tách biệt thành phần hỗn hợp cột tương đối ngắn (15 – 30cm) chứa đầy vi hạt silica (3 – 10 μm), biến đổi hóa học để có lớp phủ bề mặt với nhóm chức khác Nguyên tắc hoạt động giống phương pháp sắc ký cột với pha động pha lỏng Kỹ thuật sắc ký áp dụng sắc ký lỏng cao áp: a) sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực pha động b) sắc ký pha đảo: pha tĩnh phân cực pha động thực phẩm, hầu hết phân tích thực theo sắc ký pha đảo (reversed-phase chromatography – RFC) Sự tách thu protein RFC thường thực cách rửa giải với tăng nồng độ hợp chất hữu acetonitril, methanol, tetrahydrofuran, isopropanol Pha động thường chứa lượng thấp trifluoroacetic phosphoric acid Với vai trò 18 proton hóa nhóm silanol cịn lại chất hỗ trợ silic, nhóm carboxyl chất rửa giải, hình thành cặp ion với nhóm amino mang điện tích chất tách 8.3.2 Ưu điểm hạn chế Ưu điểm: hiệu cao so với phương pháp sắc ký khí thể rõ phân tích hợp chất hữu Các acid amin, peptide, protein cần hòa tan dung mơi thích hợp dansyl chloride, 2,4-dinitrophenol, fluorescamine, o-phthalaldehyde Phân tích tiến hành nhiệt độ phịng, khơng cần phân hủy chuyển hóa thành dẫn xuất dễ bay Đối với RFC, cho kết tách biệt hoàn tồn chất , dung mơi sử dụng độc hại Hiệu tách tính chọn lọc cao Hạn chế: phương pháp RFC, khó dự đốn thời gian lưu hợp chất chưa xác định rõ ràng, nói chung thời gian lưu tăng theo kích thước độ kỵ nước phân tử Tuy nhiên peptide, protein óc kích thước lớn hơn, số lượng vị trí kị nước bề mặt phân tử trở nên chiếm ưu 8.4 Phương pháp sắc ký lực – hấp phụ (Affinity Chromatography) Tách tính chế loại protein đặc thù thường tiêu tốn thời gian không hiệu Phương pháp sắc ký lức không vấp phải hạn chế Nó q trình cụ thể cho hấp phụ chọn lọc sinh học sau phục hồi hợp chất từ phối tử cố định 8.4.1 Nguyên tắc Kỹ thuật dựa lực cao nhiều protein với nhóm hóa học chuyên biệt thực hành, cột điền đầy nhựa sắc ký lực, sau phủ lớp protein lên, thành phần có lực với nhựa bị giữ lại, thành phần kèm vượt qua cột mà không bị cản trở Thành phần bị giữ lại tạo phức hợp tách rửa cách điều chỉnh độ pH thêm dung dịch muối, cột tái sử dụng 8.4.2 Ưu điểm hạn chế Có độ chuyên biệt cao nói phần mở đâu, điều ưu điểm phương pháp, nhiên áp dụng với chất chưa xác định rõ ràng 19 PHƯƠNG PHÁP DUMAS Baptiste Dumas (giữa kỹ 19) đề xuất phương pháp, phương pháp hoàn chỉnh (1980) với đời máy phân tích nitơ (CNAs) Lĩnh vực ứng dụng: Nhà máy sữa, nhà máy ngũ cốc, bột mỳ, thịt cá, thức ăn chăn nuôi, thức ăn sẵn, nước uống, sản phẩm thuỷ sản… 9.1 Nguyên tắc Tài liệu tham khảophương pháp Dumas trải qua giai đoạn vô Tương tự phương pháp Kjeldahl, hóa mẫu buồng đốt (Mẫu đốt cháy Oxy tinh khiết có xúc tác chromium III oxide ) sinh CO2, H2O, N2, N2O,… Bộ lọc Lecosorb để hấp thu CO2, lọc Anhydrone1)đểMethods loại nước of H2O Cu nhiệt cao khử NO2 thành N cuối Dòng Analysis of độ Food Components and Additives, edited có khí N2 vào hệ GC, phát đầu dị TCD bythống Semih Ưtles, Ege University, Department of Food Engineering, Izmir, Turkey 2) Food Chemistry & Analysis, Professor David B Min ,Food Science & Technology 60 3) Food Analysis Laboratory Manual, Second Edition, edited by S Hình veggies cap Suzanne Nielsen ,Purdue University ,West Lafayette, IN, USA 4) Kỹ Thuật sinh hóa, Phạm Thị Ánh Hồng, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM Hình quy trình Phương Pháp Dumas 9.2 Ưu điểm hạn chế Ưu điểm: khả lặp lại kết tốt, nhanh chóng hạn chế: thiết bị đắc tiền 20 21 ... 10 3.4 Định lượng protein phương pháp so màu với can thiệp TCA 10 3.5 Định lượng protein phương pháp so màu mẫu giàu lipid 10 3.6 Định lượng protein phương pháp so... tắc, protein định lượng cách xác định lượng nitơ tổng nitơ phi protein, từ tính nitơ protein Định lượng nitơ protein ta nhân kết với hệ số định (VD: 6,25 hàm lượng Nitơ protein 16% , hàm lượng. .. protein, phương pháp dùng để kiểm tra mức độ thủy phân protein 14 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY) Phương pháp sắc ký thường dùng để tinh protein, sau protein tinh phân tích định lượng thơng qua phương