Đề cương tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn hệ vi khuẩn nội cộng sinh (ENDOPHYTIC BACTERIAL) trong vùng rễ của cây lúa (Oryza Sativa L.)

Cây lúa được trồng hơn 7000 năm và là cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới (cung cấp lương thực cho hơn 50% dân số thế giới), đặc biệt là các dân tộc Châu Á, trong đó có Việt Nam. Việt Nam có hai vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Hồng ở phía Bắc và đồng bằng sông Cửu Long ở miền Nam. Hàng năm sản lượng của cả nước đạt 33 – 34 triệu tấn thóc, trong đó chỉ sử dụng khoảng 8 triệu tấn (tương đương 4 triệu tấn gạo sau khi xay xát) cho xuất khẩu, còn lại là tiêu thụ trong nước và bổ sung dự trữ quốc gia.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC - - ĐỀ CƯƠNG TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN HỆ VI KHUẨN NỘI CỘNG SINH (ENDOPHYTIC BACTERIAL) TRONG VÙNG RỄ CỦA CÂY LÚA (Oryza Sativa L.) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ NGỌC PHƯỢNG Niên khóa : 2012 – 2016 Tháng 6/2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC - - ĐỀ CƯƠNG TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN HỆ VI KHUẨN NỘI CỘNG SINH (ENDOPHYTIC BACTERIAL) TRONG VÙNG RỄ CỦA CÂY LÚA (Oryza Sativa L.) Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực TS NGUYỄN BẢO QUỐC NGUYỄN THỊ NGỌC PHƯỢNG Tháng 6/2015 MỤC LỤC CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây lúa trồng 7000 năm lương thực quan trọng giới (cung cấp lương thực cho 50% dân số giới), đặc biệt dân tộc Châu Á, có Việt Nam Việt Nam có hai vùng trồng lúa đồng sơng Hồng phía Bắc đồng sông Cửu Long miền Nam Hàng năm sản lượng nước đạt 33 – 34 triệu thóc, sử dụng khoảng triệu (tương đương triệu gạo sau xay xát) cho xuất khẩu, lại tiêu thụ nước bổ sung dự trữ quốc gia Nghề nông nghiệp nói chung nghề trồng lúa nước nói riêng góp phần giải số vấn đề an ninh lương thực – thực phẩm, thu nhập hộ gia đình, hạn chế khoảng chi phí nhập lúa gạo Tuy nhiên, sản xuất lúa bị ảnh hưởng yếu tố khác bao gồm tác động từ môi trường, sâu bệnh hại số tác nhân khác ốc, chuột, … Ngoài ra, thuốc diệt cỏ có chứa chất độc khơng tan nước nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng lúa sản xuất Endophytic loài sống cộng sinh mô thực vât, thường nấm vi khuẩn, chúng không gây hại đến vật chủ Những endophytic góp phần thúc đẩy tăng trưởng thực vật, chống lại tác nhân gây bệnh, ức chế nấm gây bệnh, cải thiện sức đề kháng chuyển hóa số chất độc khơng tan nước có thuốc diệt cỏ Để cải thiện suất chất lượng lúa sản xuất, người ta sử dụng hệ vi sinh vật nội cộng sinh (endophytic) vùng rễ lúa Ví dụ dịng vi khuẩn Bacillus, Enterobater, Micrococcus, Pseudomonas… Đó lí tơi thực đề tài “PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN HỆ VI KHUẨN NỘI CỘNG SINH (ENDOPHYTIC BACTERIAL) TRONG VÙNG RỂ CỦA CÂY LÚA (Oryza Sativa L.)” để nhằm xác định hệ vi khuẩn nội cộng sinh có lợi cho phát triển lúa đồng thời tạo bước tiến cho nghiên cứu sau 1.2 Yêu cầu đề tài - Phân lập hệ vi sinh vật vùng Endophytic rễ lúa Xác định chủng vi khuẩn cộng sinh vùng Endophytic rễ lúa Xác định chủng vi khuẩn có lợi phát triển lúa Chủ yếu chủng Pseudomonas spp 1.3 Nội dung thực - Khử trùng mẫu: làm mẫu Phân lập vi khuẩn vùng Endophytic rễ lúa Xác định lồi thuộc chủng vi khuẩn có lợi q trình phát triển - lúa (nhuộm Gram, test sinh hóa) Kiểm tra PCR khuếch đại vùng gen 16S rDNA với cặp mồi đặc hiệu sau giải trình tự, phân tích BLAST nhằm khẳng định xác chủng phân lập CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược lúa Lúa loài thực vật canh tác từ lâu đời, thuộc họ Poaceae, gồm hai lồi (Oryza sativa L Oryza glaberrima), có nguồn gốc vùng nhiệt đới cận đới khu vực đơng nam Châu Á Châu Phi Lồi Oryza sativa L lúa trồng Châu Á, Oryza glaberrima lúa trồng Châu Phi Các nhà khảo cổ học Mỹ cho lúa trồng xuất sớm cách khoảng – 10 nghìn năm Nhiều nhà khảo cổ học khác cho lúa trồng xuất cách 6000 năm, lúa trồng Châu Phi (Oryza glaberrima) xuất cách 3500 năm Còn số tác giả khác cho lúa trồng Châu Phi xuất muộn, sau công nguyên, cách khoảng 1800 – 1900 năm Về mặt phân bố lúa lồi thực vật có diện tích phân bố rộng, loài Oryza sativa phân bố kéo dài từ vĩ độ 35 độ Nam đến 50 độ Bắc 110 quốc gia Diện tích gieo trồng chiếm 10% diện tích đất nơng nghiệp giới (144 triệu ha) Lúa gạo trồng từ độ cao mực nước biển đến độ cao 3000 m so với mực nước biển Lúa gạo trồng nhiều loại đất khác đất chua, đất kiềm, đất nhiễm phèn Những dịng lúa chia thành nhóm sinh thái: Indica (ở vùng nhiệt đới cận nhiệt đới), Javanica (được trồng Indonesia) Japonica (vùng ơn đới) Có hai dịng canh tác nhiều Indica Japonica (Bùi Huy Đáp, 1999) Lúa trồng thân thảo, hệ thống rễ chùm, sống năm, có thời gian sinh trưởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng điều kiện sinh thái Thời gian trồng kéo dài từ 75 – 250 ngày Thân cao từ 70 – 150 cm, cao hơn, với mỏng, hẹp (2 – 2.5 cm) dài 50 – 100 cm Các hoa nhỏ tự thụ phấn mọc thành cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống, dài 30 – 50 cm Hạt loại thóc (hạt nhỏ, cứng loại ngũ cốc) dài – 12 mm dày – mm Cây lúa non gọi mạ Sau ngâm ủ, người ta gieo thẳng hạt lúa nảy mầm vào ruộng lúa cày, bừa kỹ qua giai đoạn gieo mạ ruộng riêng để lúa non có sức phát triển tốt, sau khoảng thời gian nhổ mạ để cấy ruộng lúa Sản phẩm thu từ lúa lúa Sau xát bỏ lớp vỏ thu sản phẩm gạo phụ phẩm cám trấu Gạo nguồn lương thực chủ yếu nửa dân số giới (chủ yếu châu Á châu Mỹ La Tinh), điều làm cho trở thành loại lương thực người tiêu thụ nhiều Lúa loài trồng ngắn ngày coi dài ngày Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm 1/10 diện tích đất trồng giới có 15 nước giới trồng lúa với diện tích hơn triệu ha, có tới 13 nước thuộc Châu Á Riêng Trung Quốc Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa 56% sản lượng lúa toàn cầu Ở nước khác Bangladesh, Indonexia, Thái Lan nước có diện tích trồng lúa lớn tổng diện tích trồng lúa tất nước Mĩ La tinh Châu Phi có diện tích trồng lúa gần diện tích trồng lúa Việt Nam, sản lượng lúa lại thấp Việt Nam từ – lần (Vương Đình Tuấn, 2000) 2.2 Tổng quan 2.2.1 Hệ vi sinh vật nội cộng sinh (Endophytic) vùng rễ lúa Endophytic nhóm nội cộng sinh, chúng nấm vi khuẩn, sống mô thực vật, không gây hại đến vật chủ Endophytic biết đến tảo địa y Các Endophytic góp phần thúc đẩy tăng trưởng vật chủ, cải thiện khả chịu đựng cây, chẳng hạn tress, hạn hán, , cải thiện sức đề kháng vật chủ, chống lại tán nhân gây bệnh Endophytic đem lại lợi ích cho vật chủ cách ngăn chặn hay chống lại vi sinh vật gây bệnh từ môi trường Sự kết hợp mô thực vật endophytic tạo thành “hiệu ứng rào cản”, sản xuất chất gây ức chế phát triển tác nhân gây hại Endophytic xác định nhiều cách, thường thông qua khuếch đại giải trình tự DNA Ngồi ra, cịn ni cấy môi trường chuyên biệt Tuy nhiên, số endophytic không sinh bào tử nuôi cấy, nên việc định hình thơng qua cấu trúc bào tử gặp nhiều khó khăn thách thức 2.2.2 Vi khuẩn Endophytic (Endophytic bacterial) vùng rễ lúa Vi khuẩn Endophytic vi khuẩn nội ký sinh thực vật tìm thấy hầu hết loài thực vật, chúng cư trú nội mô thực vật ký chủ chúng hình thành loạt mối quan hệ khác cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh… Hầu hết dạng nội ký sinh bắt đầu xuất từ vùng rễ hay bề mặt lá, nhiên, số loại ký sinh hạt Vi khuẩn Endophytic thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng suất đóng vai trị tác nhân điều hòa sinh học Vi khuẩn Endophytic sản xuất hàng loạt sản phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta khai thác tác nhân để ứng dụng y học, nơng nghiệp hay cơng nghiệp Ngồi cịn có tiểm loại bỏ chất gây nhiễm đất cách tăng cường khả khử độc thực vật làm cho đất trở nên màu mỡ thơng qua chu trình photphat cố định đạm Ngày có nhiều quan tâm việc phát triển ứng dụng tiềm công nghệ sinh học vi khuẩn endophytic để phát triển giống trồng có khả khử độc đồng thời có khả sản xuất sinh khối nhiên liệu sinh học Một số loại vi khuẩn endophytic thường gặp Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Enterobacter 2.3 Một số nghiên cứu giới Những tương tác có lợi thực vật – vi khuẩn thúc đẩy sức khỏe, phát triển trồng, vấn đề nhà nghiên cứu quan tâm Gần đây, họ nghiên cứu tiềm cho giải pháp nâng cao khả phân hủy sinh học chất gây ô nhiễm đất Hầu hết nghiên cứu tập trung vào vi khuẩn rễ (Lindow & Brandl, 2003; Kuiper et al., 2004; berg et al, 2005) Vi khuẩn Endophytic cư trú hệ sinh thái thích hợp tương tự chồi mầm thực vật, điều làm cho chúng trở thành tác nhân kiểm soát sinh học (Berg et al., 2005) Thật vậy, nhiều nghiên cứu vi khuẩn Endophytic có khả kiểm soát mầm bệnh thực vật (Sturz & Matheson, 1996; Duijff et al., 1997; Krishnamurthy & Gnanamanickam, 1997), côn trùng (Azevedo et al, 2000) tuyến trùng (Hallmann et al., 1997, 1998) Trong số trường hợp chúng đẩy mạnh tốc độ nẩy mầm hạt, thúc đẩy hình thành điều kiện bất lợi (Chanway, 1997) nâng cao khả tăng trưởng thực vật (Bent & Chanway, 1998) Vi khuẩn Endophytic cịn ngăn chặn mầm bệnh phát triển cách tổng hợp chất nội sinh trung gian, qua để tiếp tục tổng hợp chất chuyển hóa hợp chất hữu Nghiên cứu chế sản sinh chất chuyển hóa đa dạng sinh học vi khuẩn Endophytic phát loại thuốc để điều trị có hiệu bệnh người, thực vật động vật (Strobel et al., 2004) Cùng với việc sản xuất chất mới, nhiều vi khuẩn Endophytic cho thấy khả làm giảm chất ngoại sinh (xenobiotic) hay hoạt động vectơ mở đầu cho q trình Chúng có khả kháng kim loại nặng, kháng khuẩn làm giảm gốc hữu thông qua tiếp xúc với hợp chất thực vật đất nơi chúng cư trú Khả làm giảm chất xenobiotics nghiên cứu cẩn thận để cải tiến kỹ thuật khử độc thực vật (Siciliano et al., 2001; Barac et al., 2004; Germaine et al., 2004, 2006; Porteous-Moore et al., 2006; Ryan et al., 2007a) Bài nghiên cứu nhằm trình bày tổng quan ứng dụng tiềm vi khuẩn Endophytic, đặc biệt lĩnh vực khử độc thực vật nông nghiệp bền vững 2.4 Một số nghiên cứu Việt Nam Cao Ngọc Điệp cộng tiến hành đề tài “Phân lập nhận diện vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng (Plant Growth Promoting Rhizobacteria – PGPR) từ số loại rau ăn trồng thành phố Cần Thơ Đề tài phân lập nhận diện bốn dòng vi khuẩn (NBT625, NBT613, NPD721, NPD855) có khả cố định đạm, hịa tan lân cao dịng PBT622 có khả tổng hợp IAA cao đồng thời có khả ức chế vi sinh vật gây bệnh cho trồng, chúng chọn để đánh giá hiệu chúng rau ăn trồng chậu đồng nhằm tiến tới sản xuất phân sinh học cho rau xanh CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Đề tài thực từ tháng năm 2015 đến tháng 12 năm 2015 Các thí nghiệm tiến hành phịng thí nghiệm Bộ mơn Công nghệ Sinh học, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM 3.2 Vật liệu 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm Mẫu rễ lúa thu thập từ ruộng lúa địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu Các dụng cụ nghiên cứu: đĩa petri, bình xịt cồn, que cấy, ống đong loại, cốc thủy tinh loại, bình tam giác loại, micropipet, ống nghiệm, bình chứa mơi trường, cối nghiền mẫu, ống hút, găng tay, ống eppendorf, vật liệu nghiên cứu khác, v.v… 3.2.3 Thiết bị Kính hiển vi, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy, bếp nấu môi trường, máy lắc, nồi trùng, máy ly tâm, máy PCR, cân điện tử, điện di, thiết bị khác, v.v… 3.2.4 Hóa chất, thuốc thử mơi trường để phân lập vi khuẩn - Cồn 75%, NaClO 5%, NH4OH, nước cất Thuốc thử Kovacs, Methyl Red, dung dịch -naphtol 5% ethanol, dung dịch KOH 40% nước, Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride - - - - - 1% Môi trường MR – VP (mơi trường Clark – Club) • Peptone g/l • K2HPO4 g/l • Dextrose g/l Mơi trường Simmons citrate agar • NH4H2PO4 g/l • NaCl g/l • MgSO4 0.2 g/l • K2HPO4 g/l • Natri citrate g/l • Bromothymol blue 0.08 g/l • Agar 12.5 g/l Mơi trường MIU (Motility Indol Urea) • Tryptone 30 g/l • KH2PO4 g/l • NaCl g/l • Phenol red 1% 2.5 ml • Agar 4g (thạch mềm) Môi trường Yeast manitol agar (YEM) • Yeast extract 1g/l • Manitol 10g/l • K2PO4 0.5g/l • MgSO4 0.2g/l • NaCl 0.1g/l • CaCO3 1g/l • Agar 15g/l Môi trường dinh dưỡng (nutrient agar) • Pepton 5g/l • Chiết xuất từ thịt bị/ nấm men 3g/l • NaCl 5g/l • Agar 15g/l • Nước cất 1l - - Mơi trường Pseudomonas Isolation Agar • Pepton 20g/l • MgCl2 1.4g/l • K2SO4 10g/l • Irgasan 0.025g/l • Agar 13.6g/l Các dung dịch nhuộn Gram • Crystal Violet • Lugol • Fuchsin hay Safranin 3.2.5 Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR - TE Hóa chất dùng để khuếch đại DNA: Bufer, MgCl 2, dNTPs, Taq polymerase, - mồi, nước cất lần Dung dịch nạp 6X, ethidium bromide, agarose, dung dịch chạy điện di TAE (Tris HCl:acetate:EDTA) 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Thu nhận mẫu Dùng dao nhỏ cắt phần rễ lúa sau làm vùng đất bám bề mặt Bảo quản nhiệt độ 4oC phịng thí nghiệm 3.3.2 Chuẩn bị môi trường Các môi trường Yeast Manitol Agar, nito tự do, môi trường dinh dưỡng cân hoàn tan nước cất, trùng cách đun sơi Sau đó, mơi trường đưa vào hấp khử trùng 121oC 15 phút Các môi trường cho vào đĩa petri vô trùng 3.3.3 Khử trùng bề mặt mẫu Rễ rửa kỹ với nước cất vô trùng để loại bỏ lớp đất bám bề mặt Các mẫu sau khử trùng bề mặt với quy trình sau: rửa với cồn 75% phút, rửa NaClO 5% phút, cuối rửa lại lần với nước cất vơ trùng Sau đó, mẫu làm khô khăn giấy vô trùng 10 3.3.4 Phân lập nuôi cấy Mẫu vô trùng nghiền dung dịch đệm KH 2PO4 Pha lỗng lần sau cho 100dung dịch pha lỗng vào mơi trường YEM chuẩn bị sẵn, trang đến mẫu khô Nuôi cấy tủ ấm 30oC 24 để vi khuẩn phát triển Sau 24 giờ, quan sát hình dạng khuẩn lạc 3.3.5 Nhuộm Gram Phương pháp Hucker cải tiến - Lấy khuẩn lạc, cho giọt nước vào dàn mỏng lên lam kính Cố định vết - bôi cách hơ nhanh lửa đèn cồn, để khô Nhỏ lên giọt Crystal Violet chờ phút rửa thuốc nhuộm - nước cất vô trùng dùng giấy thấm khô Nhuộm lại dung dịch Lugol phút, rửa nước, thấm khô Tẩy cồn - khoảng 30 giây (cho đến vừa thấy màu), rửa nước, thấm khô Nhuộm bổ sung dung dịch Fuchsin hay Safranin – phút, rửa nước, để - khơ khơng khí Quan sát kính hiển vi vật kính dầu 100X 3.3.6 Khảo sát số đặc tính sinh hóa  Phản ứng Methyl Red (MR) Nguyên tắc: phản ứng dùng để phân biệt loại vi khuẩn hình thức biến dưỡng glucose - Loại 1: lên men thật mạnh đường glucose tạo chất acid cuối bền - cho phản ứng MR (+) Loại 2: lên men glucose thành chất trung gian không bền Các chất biến thành chất trung tính cuối (chất acetoin) cho phản ứng MR (-) Môi trường thuốc thử: - Môi trường MR – VP (môi trường Clark – Lubs, dạng môi trường đông khơ) Thuốc thử Methyl Red: • Methyl Red 0.02g • Ethanol 95% 50ml • Nước cất 50ml 11 Phương pháp cấy: cấy vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa ml môi trường MR – VP, ủ 24 – 28 37oC, thêm giọt thuốc thử Methyl Red lắc Đọc kết quả: - Phản ứng (+): mơi trường có màu đỏ - Phản ứng (-): mơi trường có màu vàng  Phản ứng Voges Proskauer (VP) Nguyên tắc: có loại vi khuẩn biến dưỡng đường glucose thành chất trung tính acety-methyl-carbinol hay acetoin, chất bị oxy hóa mơi trường kiềm kết hợp với -naphtol phức chất có màu hồng đỏ Môi trường thuốc thử: - Môi trường MR – VP (môi trường Clark – Lubs) Thuốc thử: dung dịch -naphtol 5% ethanol, dung dịch KOH 40% nước Phương pháp cấy: cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa ml môi trường MR – VP ủ 37oC 24 – 28 Sau thời gian ủ thêm vào 1.8 ml -naphtol 5% (hay 15 giọt 1ml môi trường) 0.6 ml KOH 40% nước (hay 10 giọt ml môi trường) lắc để yên – 10 phút Đọc kết quả: phản ứng (+) có màu hồng đỏ xuất Vài loại vi khuẩn cho phản ứng (+) chậm yếu nên cần phải hơ nhẹ vừa nóng (để ống nghiệm nghiêng) xuất màu  Phản ứng Simmons citrate Nguyên tắc: số vi khuẩn có khả sử dụng citrate nguồn carbon môi trường tổng hợp vô Khi citrate biến dưỡng đến giai đoạn cuối CO2, có cân ion (có phóng thích NH 3) mơi trường bị kiềm hóa chuyển từ màu xanh sang màu xanh dương đậm Môi trường: môi trường thạch Simmons citrate (dạng đông khô) điều chế theo thể thạch nghiêng, thành phần môi trường có chứa thị màu xanh bromothymol 12 Phương pháp cấy: cấy vi khuẩn thạch nghiêng, ý cấy từ khuẩn lạc vi khuẩn môi trường đặc, khơng nên cấy từ mơi trường lỏng cho phản ứng (+) giả Ủ ống môi trường 37oC 18 – 24 Đọc kết quả: - Phản ứng (+): vi khuẩn mọc mặt thạch nghiêng với đổi màu sang màu - xanh dương hồn tồn, chút hay khơng Phản ứng (-): vi khuẩn không mọc mặt thạch không đổi màu môi trường  Phản ứng Indol Nguyên tắc: số vi khuẩn có khả phân giải tryptophan mơi trường thành indol Nhân pyrol indol kết hợp với p-dimethylamino benzaldehyde thuốc thử Kovacs tạo thành phức chất dạng quinon màu đỏ tía mặt thống môi trường Môi trường thuốc thử: - Môi trường: Tryptophan water gồm 15 tryptone lít nước cất, pH = 7.3, phân phối vào ống nghiệm, hấp khử trùng 121oC 15 phút Môi trường kết hợp: MIU (Motility-Indol-Urea) Thuốc thử Kovacs: • p- dimethylamino benzaldehyde 10g • Amyl butanol 150 ml • HCl đậm đặc 50 ml Lưu ý: thuốc thử đựng chai nâu ln đậy kín, thuốc thử đổi màu nâu sẫm đổ bỏ Phương pháp cấy: - Đối với môi trường nước tryptone: dùng que cấy lấy vi khuẩn cần kiểm tra cho - vào ống nghiệm chứa môi trường nước peptone Nếu dùng môi trường MIU: dùng que cấy lấy vi khuẩn đâm thẳng vào mặt thạch đường dài ¾ chiều sâu thạch Ủ 37 oC 18 – 24 Sau thời gian ủ, nhỏ – giọt thuốc thử Kovacs vào môi trường Đọc kết quả: 13 - Phản ứng (+): vòng màu đỏ sẫm xuất bề mặt môi trường - Phản ứng (-): bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng thuốc thử  Phản ứng catalase Nguyên tắc: nhằm xác định có mặt enzyme catalase số vi sinh vật hô hấp kỵ khí tùy ý Catalase giúp vi sinh vật kỵ khí khơng bị ngộ độc mơi trường có oxy khơng khí hình thành chất H2O2 Catalase xúc tác phản ứng: H2 O2 H2 O + O Thuốc thử: - Hydrogen peroxide 30% (superoxal) giữ lạnh chai sẫm màu, tránh sáng Dung dịch đệm phosphate (M/15), pH = 7.0 Phương pháp thử: - Thử lame: dùng kim cấy lấy tâm khuẩn lạc khiết (18 – 20 ủ môi trường thích hợp) đặt lên lame kính sạch, nhỏ giọt H 2O2 30% lên Việc dùng kim khuyên cấy trộn lẫn H 2O2 vào vi sinh vật không - khiết Thử ống nghiệm: nhỏ trực tiếp 1ml H 2O2 30% lên dòng vi sinh vật cấy dày mặt thạch nghiêng (không dùng mơi trường thạch máu) Quan sát - bóng khí xuất tức ghi nhận kết Phương pháp lamelle: dùng kim cấy lấy tâm khuẩn lạc lên lam kính, nhỏ giọt H2O2 0.5% lên đậy lại lamelle Theo dõi bóng khí bị giữ lại lamelle Đọc kết quả: - Catalase (+): tạo O2, bóng khí xuất tức (hoặc vịng 10 giây) - Catalase (-): khơng tạo O2, khơng có bóng khí  Phản ứng Oxydase Ngun tắc: nhằm xác định có mặt enzyme cytocrom oxydase vi khuẩn Đây nhóm enzyme cuối vận chuyển e - đến oxy phân tử để tạp thành nước chuỗi hô hấp Giống vi khuẩn thuốc thử: 14 - Vi khuẩn kiểm tra nuôi môi trường thạch đến phát triển thành - khuẩn lạc Thuốc thử: Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1% (dung dịch không màu) Đọc kết quả: để xác định hoạt tính oxydase có cách: - Cách 1: người ta nhỏ vài giọt dung dịch Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1% (trong nước) lên khuẩn lạc mọc đĩa thạch Khuẩn lạc vi sinh vật có hoạt tính oxydase bị nhuộm đỏ sau 10 – - 30 phút chuyển thành đen Cách 2: nhỏ vài giọt thuốc thử lên giấy lọc Dùng que cấy lấy vi khuẩn cần kiểm tra bơi lên giấy lọc có tẩm dung dịch thuốc thử phản ứng oxydase Phản ứng (+) tạo màu đỏ tím vịng 10 – 30 phút 3.3.7 Tách chiết DNA (theo L Suang et al, có chỉnh sửa) DNA tách từ vi khuẩn sử dụng Genomic kit (GeniSpin, Biosyntech Sdn Bhd, Malaysia.) Cho khuẩn lạc vào tube có chứa 100 µl đệm TE Tiếp tục cho 100 µl (10 mg mL-1) lysozyme vào ủ 10 phút 30°C Sau tiến hành ly tâm phút 4000 vòng nhiệt độ phịng loại dịch Cho 25 µl dung dịch proteinase K (15 mg ml-1) Tiến hành vortex để trộn ủ 55°C Sau ly giải, 25 µl RNase A (25 mg mL-1) thêm vào ủ phút nhiệt độ phòng để loại bỏ RNA Sau loại bỏ RNA, tiến hành vortex ủ 70°C 10 phút 200 µl ethanol 70% thêm vào hỗn hợp vortex Tồn mẫu sau ly tâm 8000 vòng/phút nhiệt độ phòng rửa lại lần ethanol Cuối kết tủa DNA 50 µl đệm TE (TrisEDTA) lưu trữ -20°C sử dụng 3.3.8 Khuếch đại trình tự 16S rDNA PCR Sử dụng cặp mồi xuôi 5’-GAGTTTGMTCCTGGCTCA-3’ mồi ngược 5’TACGGYTACCTTACGACT-3’ (Bioneer, USA) lấy từ vi khuẩn Escherichia coli 15 (Embley and Stackebrant, 1994) Quá trình khuếch đại thực việc sử dụng Eppendorf AG, máy chu kỳ nhiệt 22331 (Hamburg) Hỗn hỗn 50 µl gồm 0.2 units Taq polymerase, 20pmol mồi xuôi, 20pmol mồi ngược, 1.25mM dNTPs, 10x dung dịch đệm PCR, µg/ml DNA mẫu 29.8 µl nước PCR Đối chứng âm gồm tất ngoại trừ DNA mẫu Tương tự, đối chứng dương bao gồm tất DNA mẫu nhận biết Pseudomonas putida sử dụng dựa phân tích 16S rDNA Hỗn hợp phản ứng phải chịu điều kiện tối ưu gồm: ban đầu biến tính nhiệt độ 94°C phút, biến tính 94°C khoảng 45 giây, mồi bắt cặp 43°C khoảng phút, chuỗi kéo dài phản ứng 72°C khoảng 1.5 phút cuối kéo dài 72°C khoảng phút Các chu kỳ biến tính, bắt cặp, kéo dài lặp lại khoảng 35 chu kỳ Sản phẩm khuếch đại tách gel agarose 1% (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) dung dịch đệm 1X TAE nhuộm ethidium bromide (Sambrook et al., 1989) 3.3.9 Làm sản phẩm PCR Sản phẩm PCR làm việc sử dụng Kit chuẩn QIAquick PCR (Qiagen, Germany) Sản phẩm khuếch đại tách gel agarose 1% (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) dung dịch đệm 1X TAE nhuộm ethidium bromide (Sambrook et al., 1989) 3.3.10.Giải trình tự Chuỗi trình tự kiểm tra điều chỉnh cần thiết cách sử dụng chương trình Pro Chromas vùng bảo tồn Chuỗi trình tự gen 16S rDNA so sánh với chuỗi trình tự sở liệu việc sử dụng chương trình BLAST website NCBI (http://www.ncbi.nih.gov) nhằm xác định tương đồng với trình tự sở liệu ngân hàng gen (Shayne et al., 2003) Cây di truyền mô tả phương pháp Maximum likelihook Phân tích mồi việc sử dụng chương trình MEGA4 cho 100 lần lặp lại thực để xác định ước lượng tin cậy cho hình học to-po 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THỜI GIAN DỰ KIẾN 4.1 Kết - Phân lập hệ vi sinh vật vùng endophytic rể lúa Xác định dịng vi khuẩn Psedomonas spp có lợi cho phát triển - lúa Xác định thêm vài dòng khác Mircococcus, Bacillus, Enterobacter, 4.2 Thời gian Thời gian dự kiến hoàn thành đề tài vào khoảng thời gian từ tháng năm 2015 đến tháng 12 năm 2015 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Ngọc Đệ, 2008, Giáo trình lúa, Trường Đại học Cần Thơ Lương Thị Hồng Hiệp Cao Ngọc Điệp, 2011, Phân lập nhận diện vi khuẩn nội sinh Cúc Xuyên Chi kỹ thuật PCR, Tạp chí khoa học, 18a 168-176 Ngô Thanh Phong, 2012, Phân lập tuyển chọn vi khuẩn cố định Pseudomonas spp bón cho lúa cao sản vùng đồng sông Cửu Long, Trường Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp, Trần Thị Giang Nguyễn Thị Quyên, 2014, Phân lập nhận diện vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) từ số loại rau ăn trồng Thành phố Cần Thơ, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 35: 65-73 Bộ môn Công nghệ Sinh học, 2013, Thực hành Sinh học vi sinh, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh Pham Quang Hung and K Annapurna, 2004, isolation and characterization of endophytic bacteria in soybean (glycinesp.), 12: 92-101 Mbai FN, Magiri E.N, Matiru V.N, Ng’ang’a J, Nyambati V.C.S., 2013, Isolation and Characterisation of Bacterial Root Endophytes with Potential to Enhance Plant Growth from Kenyan Basmati Rice, American International Journal of Contemporary Research, Vol No 17 Van Thi Phuong Nhu and Cao Ngoc Diep, 2014, Isolation, characterization and phylogenetic analysis of endophytic bacteria in rice plant cultivated on soil of Phu Yen province (Vietnam), American Journal of Life Sciences, 2(3): 117-127 Robert P Ryan, Kieran Germaine, Ashley Franks, David J Ryan & David N Dowling, 2007, Bacterial endophytes: recent developments and applications, minireview, FEMS Microbiol Lett 278(2008) 1–9 Tài liệu Internet https://duybiotech.wordpress.com/tag/endophytic-bacteria/ http://en.wikipedia.org/wiki/Endophyte 18 19 ... - - ĐỀ CƯƠNG TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN HỆ VI KHUẨN NỘI CỘNG SINH (ENDOPHYTIC BACTERIAL) TRONG VÙNG RỄ CỦA CÂY LÚA (Oryza Sativa L.) Giáo vi? ?n hướng dẫn Sinh vi? ?n thực TS NGUYỄN... khuẩn Bacillus, Enterobater, Micrococcus, Pseudomonas… Đó lí tơi thực đề tài “PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN HỆ VI KHUẨN NỘI CỘNG SINH (ENDOPHYTIC BACTERIAL) TRONG VÙNG RỂ CỦA CÂY LÚA (Oryza Sativa L.)? ??... định hệ vi khuẩn nội cộng sinh có lợi cho phát triển lúa đồng thời tạo bước tiến cho nghiên cứu sau 1.2 Yêu cầu đề tài - Phân lập hệ vi sinh vật vùng Endophytic rễ lúa Xác định chủng vi khuẩn cộng