Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích hệ miễn dịch của cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l ) vùng đồng bằng sông cửu long trên đối tượng cá tra tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÊ THỊ BẠCH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.) VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÁ TRA Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC TP Cần Thơ – Năm 2020 Cơng trình hồn thành tại: + Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Học viện Khoa học Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam + Trường Đại học Catholique de Louvain, Bỉ + Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: … Người hướng dẫn khoa học 2: … Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 20… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Ngành thủy sản Việt Nam gần phát triển mạnh mẽ giữ vai trò quan trọng xuất Tuy nhiên, đôi với việc phát triển ni trồng thủy sản dịch bệnh bùng phát mạnh mẽ gây thiệt hại đáng kể Việc sử dụng thuốc hóa chất gây nhiều trở ngại cho nghề nuôi kháng thuốc vi khuẩn ngày nhiều, ô nhiễm môi trường nuôi, tồn lưu thuốc cá thương phẩm ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng rào cản cho doanh nghiệp Việt Nam xuất thủy sản Để hạn chế dịch bệnh việc sử dụng thuốc hóa chất ni trồng thủy sản, số giải pháp nhiều người quan tâm áp dụng mơ hình ni thủy sản Trong đó, sử dụng thảo dược để thay kháng sinh, tăng cường hệ miễn dịch cho vật nuôi kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm thủy sản hướng cho ngành thủy sản Với khác biệt lớn khí hậu, từ vùng gần xích đạo tới giáp vùng cận nhiệt đới, với phân hóa cao địa hình góp phần tạo nên đa dạng hệ sinh thái nói chung hệ thực vật nói riêng Việt Nam Bên cạnh đó, Việt Nam quốc gia có y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại thảo dược điều trị bệnh tăng cường sức khoẻ Đây nguồn hợp chất thiên nhiên vô quý báu cần nghiên cứu mặt hóa học khảo sát hoạt tính sinh học để tìm hoạt chất sử dụng làm thuốc phục vụ cho đời sống, hướng nghiên cứu nhiều nhà khoa học quan tâm Cây Cỏ sữa lớn (Euphorbia hirta L.), theo Đơng y có nhiều tác dụng Ngoài ra, theo kết sàng lọc ban đầu tác dụng tăng cường hệ miễn dịch cá tra 20 loài dược thảo, Cỏ sữa lớn thể hoạt tính tốt Tuy nhiên, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Việt Nam chưa nhiều Do đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học khả kích thích hệ miễn dịch Cỏ sữa lớn vùng Đồng sông Cửu Long đối tượng cá tra” thực nhằm đóng góp thêm hiểu biết thành phần hóa thực vật tác dụng sinh học loài Cỏ sữa lớn Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu Cỏ sữa lớn nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học, làm sở khoa học cho nghiên cứu để tạo sản phẩm ứng dụng thủy sản nói riêng hay sống nói chung Các nội dung nghiên cứu luận án Sàng lọc lồi dược thảo có hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra; Phân lập hợp chất từ toàn Cỏ sữa lớn thu hái thành phố Cần Thơ; Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phương pháp vật lý hóa học; Đánh giá hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra, hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxi hóa hiệu bảo vệ tế bào MIN6 khỏi ER stress cao chiết số hợp chất phân lập NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng quan tập hợp nghiên cứu nước quốc tế vấn đề:  Đặc điểm thực vật, thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Euphorbia  Đặc điểm thực vật, công dụng dân gian, thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Cỏ sữa lớn (Euphorbia hirta L.)  Tổng quan miễn dịch CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 Mẫu thực vật, hóa chất thiết bị 2.1.1 Mẫu thực vật Dựa vào kết khảo sát kinh nghiệm dân gian hộ nông dân nuôi trồng thủy sản vùng ĐBSCL kết hợp với lược khảo tài liệu, 20 loài thực vật chọn để tiến hành khảo sát hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra Toàn Cỏ sữa lớn (Euphorbia hirta L.) thu hái vào cuối tháng năm 2016 thành phố Cần Thơ Tên khoa học TS Đặng Minh Quân - Bộ môn Sinh, Khoa Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ giám định mẫu tiêu lưu trữ 2.1.2 Hóa chất thiết bị  Hóa chất Bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254 mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck) Silica gel pha thường silica gel pha đảo RP-18 Sắc ký lọc gel: Sephadex LH-20 (GE Healthcare) Dung môi triển khai cột: n-hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH, MeOH chưng cất lại trước sử dụng  Thiết bị  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ghi máy Bruker Avance 500 Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam máy AV-600, Bruker BioSpin Inc., Billerica, MA, USA, Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản  Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS đo máy: SCIEX X500 QTOF Viện Hóa học TPHCM Viện Cơng nghệ Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam máy MicroTOF, Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, USA, Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản  Phổ UV-Vis đo máy Jasco V-730; Độ quay cực đo thiết bị ADP 440; Nhiệt độ nóng chảy đo máy Stuart Scientific SMP3 Các phân tích thực Bộ mơn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp điều chế 20 loại cao tổng Đối với 20 mẫu thực vật, lấy 100 g bột nguyên liệu khô nghiền nhỏ loại, thực trình ngâm dầm trực tiếp dung mơi ethanol (5 lần × 24 lần) Dịch chiết ethanol gộp chung lại cất loại dung môi áp suất thấp thu cao chiết ethanol tổng tương ứng 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) sắc ký cột (CC) 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc định danh Cấu trúc hợp chất xác định cách kết hợp phương pháp phổ nghiệm đại phổ tử ngoại (UV-Vis), phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-, 13 C-NMR, DEPT) hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) đồng thời kết hợp phân tích, so sánh tài liệu tham khảo 2.2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2.4.1 Hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Nguồn cá thí nghiệm: Cá tra (50 ± gram/con) chuyển phịng thí nghiệm từ trại giống Vĩnh Long Cá đem trại thực nghiệm trữ bể composite có sục khí liên tục, cho ăn thức ăn cơng nghiệp theo nhu cầu cá hóa hai tuần trước tiến hành thí nghiệm Trước bố trí thí nghiệm, cá kiểm tra ngẫu nhiên hình dạng, kí sinh trùng, vi khuẩn Bố trí thí nghiệm: Tế bào bạch cầu (5×106 tế bào/mL) thu từ thận máu ngoại vi cá tra dựa theo phương pháp Boyum (1968) Pierrard et al (2012) Ficoll Paque PLUS (1.077 g/mL, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) sử dụng để phân lập tế bào bạch cầu Tế bào thu đuợc nuôi môi trường L-15 (pH 7.4, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) có bổ sung 5% huyết thai bò (fetal bovine serum-FBS, Invitrogen), 1% Hepes 20 mM 1% kháng sinh streptomycin/penicillin 10 000 UI (Invitrogen) ni 28ºC Thí nghiệm bao gồm nghiệm thức bổ sung cao chiết (tế bào bạch cầu thu từ thận từ máu ngoại vi bổ sung loại cao chiết nồng độ 10 100 μg/mL) nghiệm thức đối chứng (tế bào bạch cầu thu từ thận từ máu ngoại vi bổ sung DMSO 1%), nghiệm thức lặp lại lần Sau 24 bổ sung cao chiết, tiến hành phân tích tiêu miễn dịch: xác định hoạt tính lysozyme, bổ thể tổng kháng thể 2.2.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn Cỏ sữa lớn Khả kháng khuẩn mẫu thử (cao chiết chất phân lập từ Cỏ sữa lớn) xác định dựa khả ức chế phát triển chủng vi khuẩn thể qua hình thành vịng vơ khuẩn xung quanh giếng thạch tạo đĩa petri nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Khả kháng khuẩn mẫu thử kháng sinh (Vancomycin HCl Cefixim) tiến hành năm chủng vi khuẩn gây bệnh thủy sản: Aeromonas hydrophila-N, Aeromonas dhakensis-D, Aeromonas hydrophila-D, Aeromonas dhakensis-W, Vibrio parahaemolyticus đươ ̣c cung cấ p từ Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2, thành phố Hồ Chí Minh 2.2.4.3 Phương pháp đánh giá khả kháng oxi hóa Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa thơng qua khả trung hịa gốc tự DPPH, ABTS•+ chọn sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết chất phân lập từ Cỏ sữa lớn Ngoài ra, phương pháp đánh giá khả kháng oxi hóa tế bào MIN6 tiến hành 2.2.4.4 Hoạt tính bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress Thapsigargin (TG) µM dùng để gây chết tế bào Tác dụng cao chiết hay chất phân lập bảo vệ tế bào khỏi chết đánh giá cách so sánh thống kê tỷ lệ sống nhóm tế bào xử lý với TG sau xử lý thêm với cao chiết hay chất phân lập so với nhóm xử lý với TG Tỷ lệ sống tế bào đánh giá phương pháp so màu dựa hoạt tính enzyme dehydrogenase CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sàng lọc đối tượng nghiên cứu theo định hướng hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra Dựa vào kết khảo sát kinh nghiệm dân gian hộ nông dân nuôi trồng thủy sản kết hợp với lược khảo tài liệu, 20 loài thực vật thu hái từ tỉnh khác vùng ĐBSCL tiến hành sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra Bảng 3.1 Danh sách cao chiết ethanol tổng thu STT Tên thực vật Tên khoa học mẫu thực vật Địa điểm thu mẫu Bộ phận nghiên cứu Hiệu suất điều chế cao (%) Dây vác Cayratia trifolia (L.) Domin Sóc Trăng Phần mặt đất 7.51 Rau sam Portulaca oleracea L Vĩnh Long Toàn 5.73 Tỏi Allium sativum L Củ 6.87 Cần Thơ Húng quế Ocimum basilicum L Cần Thơ Bình bát nước Annona reticulata L Sóc Trăng Cỏ sữa lớn Euphorbia hirta L Gừng Rau má Sài đất 10 Diệp hạ châu Sầu đâu Zingiber officinale Rosc Centella asiatica (L.) Urb Wedelia chinensis (Osbeck) Merr Phyllanthus amarus L 11 12 13 14 Ổi Trầu không Mướp đắng Phần mặt đất 5.15 Lá 13.71 Cần Thơ Toàn 8.38 Cần Thơ Củ 5.65 Hậu Giang Toàn 5.41 Cần Thơ Toàn 5.76 Sóc Trăng Phần mặt đất 6.29 Cần Thơ Lá 8.84 Psidium guajava L Vĩnh Long Lá 10.41 Piper betle L Hậu Giang Lá 5.47 Momordica charantia L Houttuynia cordata Thunb Vĩnh Long Lá 5.98 Vĩnh Long Phần mặt đất 8.93 Azadirachta indica A Juss 15 Giấp cá 16 Mắc cỡ Mimosa pudica L Cần Thơ Phần mặt đất 6.28 17 Tía tơ Perilla frutescen (L.) Britt Cần Thơ Phần mặt đất 5.42 18 Cỏ lợn Ageratum conyzoides L Hậu Giang Phần mặt đất 8.40 19 Rau dệu Alternanthera sessilis (L.) A DC Cần Thơ Phần mặt đất 6.10 20 Cỏ mực Eclipta prostrata (L.) L Cần Thơ Phần mặt đất 5.07 cứt Hợp chất steroid 14 Hợp chất khác 1' HO OH OH O O 6' O 6" H3 C HO 1" O HO OH Eup18: 1'-O-benzyl-rutinoside 3.5 Kết đánh giá hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra Tế bào bạch cầu phân lập từ thận cá tra, ni mơi trường L-15 có bổ sung cao chiết Cỏ sữa lớn nồng độ 10 µg/mL 100 µg/mL bổ sung hợp chất phân lập nồng độ 10 µg/mL 50 µg/mL Sau 24 bổ sung mẫu thử, tiến hành phân tích tiêu: lysozyme, bổ thể, tổng kháng thể để đánh giá ảnh hưởng Cỏ sữa lớn lên đáp ứng miễn dịch tế bào bạch cầu cá tra Kết phân tích cho thấy nghiệm thức sau 24 bổ sung cao tổng, cao MeOH cao n-hexane Cỏ sữa lớn nồng độ 100 µg/mL có hoạt tính lysozyme tăng cao đáng kể so với đối chứng Trong đó, tăng cao nghiệm thức bổ sung cao MeOH (tăng khoảng lần so với đối chứng) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (p