Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch kháng haemophilus influenzae type b virus viêm gan b trong vắcxin 5 thành phần (DTwP hib hepb) trên động vật thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG -o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH KHÁNG HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B VÀ VIRUS VIÊM GAN B TRONG VẮCXIN THÀNH PHẦN (DTwP – HiB – HepB) TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM Giảng viên hướng dẫn : PSG.TS Nguyễn Văn Duy ThS Nguyễn Sỹ Tuấn Sinh viên thực hiện: Võ Nguyễn Phương Linh Mã số sinh viên: 57131167 Khánh Hòa, tháng 7/2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH KHÁNG HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B VÀ VIRUS VIÊM GAN B TRONG VẮCXIN THÀNH PHẦN (DTwP – HiB – HepB) TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM GVHD: PGS.TS Nguyễn Văn Duy ThS Nguyễn Sỹ Tuấn SVTH: Võ Nguyễn Phương Linh MSSV: 57131167 Khánh Hòa, tháng 7/2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thực cá nhân tơi với hướng dẫn PGS TS Nguyễn Văn Duy ThS Nguyễn Sỹ Tuấn sở lý thuyết học thí nghiệm thực tế Viện Vắc xin Sinh phẩm y tế Các số liệu kết nghiên cứu đồ án trung thực chưa công bố cơng trình khác Đồ án tham khảo tư liệu sử dụng thông tin đăng tải danh mục tài liệu tham khảo Sinh viên thực Võ Nguyễn Phương Linh i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình học tập luận văn tốt nghiệp này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Lãnh đạo tập thể thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Môi trường tận tâm giảng dạy, truyền thụ kiến thức quý báu tạo điều kiện giúp đỡ cho tơi suốt q trình học tập Ban Giám đốc Viện Vắc xin Sinh phẩm y tế cho phép tạo điều kiện tốt để giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài PGS TS Nguyễn Văn Duy, giảng viên Viện Công nghệ sinh học Môi trường, truyền đạt kiến thức, trực tiếp hướng dẫn tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài ThS Nguyễn Sỹ Tuấn, người hướng dẫn trực tiếp, giúp đỡ, định hướng tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian nghiên cứu CN Trần Ngọc Nhơn, Dược sĩ Trần Ngọc Liên anh chị Phòng Kiểm định Phịng Chăn ni động vật thí nghiệm giúp đỡ, động viên, góp ý tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành đề tài Cuối tơi xin gửi tới gia đình, bạn bè lời cảm ơn sâu sắc giúp đỡ động viên tơi thời gian thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn chúc người vui vẻ, hạnh phúc! Nha Trang, tháng năm 2019 Sinh viên thực Võ Nguyễn Phương Linh ii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Vắc xin phối hợp thành phần bạch hầu, uốn ván, ho gà, viêm gan B, viêm phổi/màng não HiB (Vắc xin DTwP-HepB-HiB) Liên minh toàn cầu Vắc xin Tiêm chủng (GAVI) hỗ trợ cho Việt Nam để sử dụng Chương trình Tiêm chủng mở rộng (CTTCMR) miễn phí cho trẻ tuổi từ tháng 06/2010 đến Tuy nhiên lượng vắc xin GAVI tài trợ từ năm 2015 giảm dần đến ngưng hoàn toàn vào năm 2020 Việt Nam phải tự đảm bảo nguồn vắc xin thay Trước tình hình tháng 02/2019, Viện Vắc xin Sinh phẩm y tế (IVAC) thức Bộ Y tế giao nhiệm vụ phát triển vắc xin thành phần để chủ động nguồn vắc xin nội lực thay vắc xin nhập ngoại trở nên cần thiết, cấp bách Một nội dung nghiên cứu phát triển vắc xin thành phần (tên thương mại IVACPENTA) IVAC, đánh giá tính sinh miễn dịch kháng nguyên Haemophilus influenzae (HiB) viêm gan B (HepB) vắc xin IVACPENTA động vật thí nghiệm yêu cầu bắt buộc để xác định tính tương thích chúng phối hợp với kháng nguyên giải độc tố bạch hầu (D), giải độc tố uốn ván (T) nước cốt vi khuẩn ho gà bất hoạt (wP) Đề tài thực với mục tiêu: “Đánh giá khả tạo đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B kháng thể kháng HiB động vật thí nghiệm vắc xin IVACPENTA (vắc xin thành phần DTwP-HiB-HepB) từ đánh giá tính tương thích miễn dịch kháng nguyên viêm gan B HiB vắc xin IVACPENTA” Viện Vắc xin Sinh phẩm y tế (IVAC) nghiên cứu phát triển Đánh giá tạo thành kháng thể HBsAb chuột nhắt trắng thực cách miễn dịch cho nhóm chuột (mỗi nhóm con), vắc xin IVACPENTA vắc xin viêm gan B mẫu chuẩn quốc gia, chuột nhóm tương ứng nhận lượng kháng nguyên HBsAg (viêm gan B) µg (1/4); 1,25 µg (1/16); 0,3125 µg (1/64); 0,0781 µg (1/256) 0,0195 µg (1/1024) Sau 28 ngày thu huyết miễn dịch chuẩn độ hiệu giá kháng thể viêm gan B (HBsAb) kít HBsAb hãng Diagnostic Bioprobes Srl – Italy Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch kháng nguyên HepB HiB thực iii hai nhóm thỏ, nhóm 10 con, thỏ nhận liều vắc xin cách 21 ngày IVACPENTA COMBE-FIVE (vắc xin thương mại lưu hành CTTCMR) Huyết máu (trước tiêm) huyết miễn dịch sau mũi tiêm 20 ± ngày thu thập Kháng thể HBsAb huyết thỏ xác định kít HBsAb hãng Diagnostic Bioprobes Srl – Italy; kháng thể HiB xác định phản ứng ELISA với kháng nguyên gắn phiến HBO – HSA cộng hợp kháng thể dê kháng thỏ Kết nghiên cứu đạt được: Thành phần viêm gan B vắc xin IVACPENTA tạo đáp ứng kháng thể HBsAb chuột nhắt trắng tương đương vắc xin viêm gan B mẫu chuẩn quốc gia, đạt yêu cầu công hiệu theo tiêu chuẩn dự kiến Thành phần viêm gan B vắc xin IVACPENTA tạo đáp ứng miễn dịch cao thỏ yếu so với vắc xin COMBE-FIVE: sau mũi tiêm hiệu giá kháng thể HBsAb trung bình nhân (GMT) đạt: 6939,03 ± 4673,07 mIU/ml tỷ số hiệu giá kháng thể HBsAb trung bình nhân (RGMT) sau liều tiêm thứ ba so với sau liều tiêm thứ tăng 4,8 lần; vắc xin COMBE-FIVE GMT đạt 7242,42 ± 11801,59 mIU/ml RGMT tăng 11,38 lần Thành phần kháng nguyên HiB vắc xin IVACPENTA tạo đáp ứng miễn dịch thỏ không khác biệt đáng kể so với vắc xin COMBE-FIVE, sau liều tiêm, hiệu giá kháng thể kháng HiB trung bình nhân (GMT) đạt 118,54 ± 30,53 U/ml RGMT tăng 97,16 lần so với máu nền, vắc xin COMBEFIVE, GMT đạt 127,09 ± 44,59 U/ml RGMT tăng 98,52 lần Những kết chứng minh khía cạnh sinh miễn dịch hai thành phần kháng nguyên HepB HiB vắc xin IVACPENTA tỏ tương thích với thành phần kháng nguyên lại D, T wP Đây sở quan trọng xác định công thức qui trình phối hợp vắc xin IVACPENTA để tạo vắc xin đạt u cầu tính an tồn công hiệu theo tiêu chuẩn Tổ chức Y tế giới (WHO) iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN iii MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH DO VI KHUẨN HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B VÀ VIRUS VIÊM GAN B 1.1.1 Bệnh vi khuẩn Haemophilus influenzae type B 1.1.1.1 Tác nhân gây bệnh .4 1.1.1.2 Kháng nguyên polysaccharide vỏ Haemophilus influenzae type B (cPRP) .6 1.1.1.3 Dịch tễ học lâm sàng .7 1.1.2 Bệnh viêm gan siêu vi B 1.1.2.1 Tác nhân gây bệnh .8 1.1.2.2 Dịch tễ học lâm sàng 10 1.2 VẮC XIN PHÒNG BỆNH 12 1.2.1 Vắc xin phòng bệnh vi khuẩn Haemophilus influenzae type B 12 v 1.2.2 Vắc xin phòng viêm gan B 13 1.2.3 Vắc xin phối hợp thành phần phát triển vắc xin IVACPENTA Viện Vắc xin Sinh phẩm y tế 15 1.3 PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA) XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ TRONG HUYẾT THANH MIỄN DỊCH .17 1.3.1 Nguyên tắc 17 1.3.2 Kỹ thuật ELISA trực tiếp 19 1.3.3 Kỹ thuật ELISA gián tiếp 20 1.3.4 Kỹ thuật ELISA sandwich 22 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 23 2.2 VẬT LIỆU 23 2.2.1 Động vật thí nghiệm 23 2.2.2 Vắc xin sinh phẩm 23 2.2.3 Dung dịch hóa chất 24 2.2.4 Thiết bị chuyên dụng 24 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1 Nguyên tắc chung .25 2.3.2 Đánh giá đáp ứng kháng thể viêm gan B (HepB) 25 2.3.2.1 Đáp ứng kháng thể viêm gan B chuột nhắt 25 2.3.2.2 Đáp ứng kháng thể viêm gan B thỏ .28 2.3.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch Haemophilus influenzae type B (HiB) 30 2.3.3.1 Gây miễn dịch cho thỏ thu huyết 30 vi 2.3.3.2 Phương pháp chuẩn độ kháng thể kháng Haemophilus influenzae type B (HiB) .30 2.3.3.3 Đánh giá kết 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ KHÁNG VIÊM GAN B TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG VÀ TRÊN THỎ CỦA VẮC XIN IVACPENTA .34 3.1.1 Đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B chuột 34 3.1.2 Đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B thỏ vắc xin IVACPENTA so sánh với vắc xin COMBE-FIVE .39 3.2 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ KHÁNG H INFLUENZAE TYPE B (HIB) TRÊN THỎ CỦA VẮC XIN IVACPENTA SO SÁNH VỚI VẮC XIN COMBE-FIVE 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn H influenzae nhuộn Gram kính hiển vi quang học Hình 1.2 Khuẩn lạc H influenzae mơi trường thạch socola Hình 1.3 Công thức cấu tạo đơn phân Ribose Phosphate cấu tạo nên phân tử PRP Hình 1.4 Hình ảnh kính hiển vi điện tử (nhuộm âm bản) dạng hình thể số lượng tương đối tiểu thể vi rút viêm gan B ml huyết tương bệnh nhân mang vi rút viêm gan B mạn tính Hình 1.5 Mơ hình virus viêm gan B (tiểu thể Dane) mơ hình dạng tiểu thể mang kháng ngun HBsAg 10 Hình 1.6 Sơ đồ thực kĩ thuật ELISA trực tiếp 19 Hình 1.7 Sơ đồ thực kĩ thuật ELISA gián tiếp 21 Hình 2.1 Sơ đồ phân phối mẫu chuẩn huyết chuột phiến ELISA chuẩn độ hiệu giá kháng thể HBsAb 27 Hình 2.2 Sơ đồ gây miễn dịch thỏ thu huyết miễn dịch kháng viêm gan B H influenzae type B 28 Hình 2.3 Sơ đồ phân phối mẫu chuẩn huyết thỏ phiến ELISA chuẩn độ hiệu giá kháng thể HBsAb 29 Hình 2.4 Sơ đồ ELISA định lượng kháng thể kháng HiB 32 Hình 3.1 So sánh hiệu giá kháng thể HBsAb trung bình nhân (GMT) chuột vắc xin IVACPENTA vắc xin mẫu chuẩn viêm gan B (REF) nồng độ HBsAg miễn dịch tương ứng 37 Hình 3.2 Hiệu giá kháng thể kháng viêm gan B (HBsAb) trung bình nhân sau mũi tiêm vắc xin IVACPENTA COMBE-FIVE 41 viii mức thấp Thỏ có kháng thể cao thỏ số 13 (3,53 U/ml) Sự diện kháng thể kháng HiB thường xuyên xảy người hay động vật máu nóng đáp ứng chéo nhóm vi khuẩn khơng gây bệnh tồn tự nhiên hầu họng thể Đó vi khuẩn mang cấu trúc kháng nguyên vỏ polysaccharide Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae… Hiệu giá kháng thể sau tiêm vắc xin IVACPENTA Hiệu giá kháng thể kháng HiB trung bình nhân (GMT) sau mũi tiêm thứ đạt 23,62 ± 15,41 U/ml [7,67 U/ml – 60,47 U/ml]; sau mũi tiêm thứ đạt 62,39 ± 31,08 U/ml [18,41 U/ml – 116,66 U/ml] sau mũi tiêm thứ đạt 118,54 ± 30,53 U/ml [80,92 U/ml – 180,60 U/ml] Hiệu giá kháng thể sau tiêm vắc xin COMBE-FIVE Hiệu giá kháng thể kháng HiB trung bình nhân (GMT) sau mũi tiêm thứ đạt 18,51 ± 13,38 U/ml [2,92 U/ml – 47,16 U/ml]; sau mũi tiêm thứ đạt 44,91 ± 33,38 U/ml [16,55 U/ml – 102,29 U/ml] sau mũi tiêm thứ đạt 127,09 ± 44,59 U/ml [78,52 U/ml – 218,49 U/ml] Như vậy, sau tất mũi tiêm, tất thỏ có đáp ứng kháng thể kháng HiB tăng cao gấp nhiều lần so với kháng thể Hiệu giá kháng thể tăng tương ứng với mũi tiêm xảy loại vắc xin, hiệu giá kháng thể mũi tiêm sau cao mũi tiêm trước thể thỏ hiệu giá kháng thể trung bình nhân (GMT) sau mũi tiêm (Hình 3.4) 47 127,09 140,00 (U/ml) 118,54 120,00 100,00 80,00 62,39 60,00 44,91 23,62 40,00 20,00 1,22 18,51 1,29 0,00 Máu Sau mũi (T2) Sau mũi (T3) IVACPENTA Sau mũi (T4) COMBE-FIVE Hình 3.4 Hiệu giá kháng thể kháng HiB trung bình nhân (GMT) trước sau tiêm vắc xin IVACPENTA COMBE-FIVE Tỷ số hiệu giá kháng thể trung bình nhân (RGMT) mũi tiêm so với kháng thể tăng cao lần từ sau thỏ tiêm mũi tiêm thứ khoảng tuần Cụ thể sau: - Sau liều tiêm thứ RGMT (T2/T0) = 19,36 lần (IVACPENTA) 14,35 lần (COMBE-FIVE) - Sau liều tiêm thứ hai RGMT (T3/T0) = 51,14 lần (IVACPENTA) 34,81 lần (COMBE-FIVE) - Sau liều tiêm thứ ba RGMT (T4/T0) = 97,16 lần (IVACPENTA) 98,52 lần (COMBE-FIVE) 48 Nếu so sánh tỷ số hiệu giá kháng thể trung bình nhân mũi tiêm nhận thấy có tỷ số hiệu giá kháng thể trung bình nhân mũi tiêm thứ ba mũi tiêm thứ RGMT (T4/T2) đạt ≥ lần, mức có ý nghĩa đáp ứng kháng thể vắc xin (Hình 3.5) 120 (Lần) 97,16 100 98,52 80 51,14 60 40 19,36 34,81 20 14,35 RGMT (T2/T0) RGMT (T3/T0) IVACPENTA RGMT (T4/T0) COMBE-FIVE Hình 3.5 Tỷ số hiệu giá kháng thể kháng HiB trung bình nhân (RGMT) mũi tiêm so với máu So sánh đáp ứng kháng thể kháng HiB vắc xin IVACPENTA COMBE-FIVE hiệu giá kháng thể trung bình nhân (GMT) tỷ số hiệu giá kháng thể trung bình nhân (RGMT) đáp ứng kháng thể kháng HiB khơng có khác biệt vắc xin IVACPENTA vắc xin đối chứng COMBE-FIVE lưu hành chương trình tiêm chủng mở rộng Việt Nam 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Kết nghiên cứu đáp ứng miễn dịch kháng Haemophilus influenzae virus viêm gan B vắc xin thành phần (DTwP-HiB-HepB) có tên thương mại IVACPENTA động vật đạt được: Thành phần viêm gan B vắc xin IVACPENTA tạo đáp ứng kháng thể HBsAb chuột nhắt trắng tương đương vắc xin viêm gan B mẫu chuẩn quốc gia, đạt yêu cầu công hiệu theo tiêu chuẩn dự kiến Thành phần viêm gan B vắc xin IVACPENTA tạo đáp ứng miễn dịch cao thỏ yếu so với vắc xin COMBE-FIVE: sau mũi tiêm hiệu giá kháng thể HBsAb trung bình nhân (GMT) đạt: 6939,03 ± 4673,07 mIU/ml tỷ số hiệu giá kháng thể HBsAb trung bình nhân (RGMT) sau liều tiêm thứ ba so với sau liều tiêm thứ tăng 4,8 lần; vắc xin COMBE-FIVE GMT đạt 7242,42 ± 11801,59 mIU/ml RGMT tăng 11,37 lần Thành phần kháng nguyên HiB vắc xin IVACPENTA tạo đáp ứng miễn dịch thỏ không khác biệt đáng kể so với vắc xin COMBE-FIVE, sau liều tiêm, hiệu giá kháng thể kháng HiB trung bình nhân (GMT) đạt 118,54 ± 30,53 U/ml RGMT tăng 97,16 lần so với máu nền; vắc xin COMBEFIVE, GMT đạt 127,09 ± 44,59 U/ml RGMT tăng 98,52 lần Những kết chứng minh khía cạnh sinh miễn dịch hai thành phần kháng nguyên viêm gan B HiB vắc xin IVACPENTA tỏ tương thích với thành phần kháng nguyên lại D, T wP Đây sở quan trọng xác định cơng thức qui trình phối hợp vắc xin IVACPENTA để tạo vắc xin đạt u cầu tính an tồn cơng hiệu theo tiêu chuẩn Tổ chức Y tế giới 50 KIẾN NGHỊ Tiếp tục thực đánh giá độ ổn định đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B kháng HiB lơ vắc xin IVACPENTA Theo dõi kháng thể tồn lưu kháng viêm gan B kháng HiB miễn dịch thỏ sau mũi tiêm vắc xin IVACPENTA vòng năm 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam tái lần thứ năm, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2016), Cẩm nang cho cán y tế viêm gan B Lê Văn Bé (2003), “Nghiên cứu hỗn hợp vắc xin bốn thành phần Bạch hầu – Ho gà - Uốn ván – Viêm màng não (DPT-HIB) dạng nước”, Tạp chí Y học dự phòng tập XIII, số (63): 82-84 Lê Văn Bé (2013), “Nhìn lại chặng đường cung cấp vắc xin cho chương trình Tiêm chủng mở rộng Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế”, Tạp chí Y học dự phịng tập XXIII, số (144): 10-12 Lê Văn Hiệp (2006), Vắc xin học vấn đề bản, Nhà xuất Y học, Hà Nội Nguyễn Thị Kê (2001), Nghiên cứu sản xuất vắc xin cộng hợp HiB để sản xuất vắc xin DTP – HiB hấp phụ Báo cáo đề tài cấp bộ, Bộ Y Tế Lê Văn Phủng (2007), “Haemophilus”, In: Lê Huy Chính (ed.), Vi sinh vật Y học Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Thị Oanh (2007), “Các virus viêm gan”, In: Lê Huy Chính (ed.), Vi sinh vật Y học Nhà xuất Y học, Hà Nội TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Briere EC, Jackson M, Shah SG, Cohn AC, Anderson RD, MacNeil JR, Coronado FM, Mayer LW, Clark TA, Messonnier NE (2012) “Haemophilus influenzae Type b Disease and Vaccine Booster Dose Deferral, United States, 1998-2009” Pediatrics 130(3): 414–420 10 Dodd D (2003), “Benefits of Combination Vaccines: Effective Vaccination on a Simplified Schedule”, The American journal of managed care: 6-12 52 11 Do SH (2015), “Epidemiology of Hepatitis B and C Virus Infections and Liver Cancer in Vietnam”, Euroasian Journal of Hepatogastroenterology (1): 49– 51 12 Gerlich WH (2013), “Medical Virology of Hepatitis B: how it began and where we are now”, Virology Journal 10 (1): 239 13 Gessner BD (2002), “Worldwide Variation in the Incidence of Haemophilus influenzae Type b Meningitis and Its Association with Ampicillin Resistance”, European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 21 (2): 79-87 14 Lavanchy D (2008) “Chronic viral hepatitis as a public health issue in the world” Best Practice & Research Clinical Gastroenterology 22 (6): 991– 1008 15 Nguyen VT (2010), “Hepatitis B infection in Vietnam: current issues and future challenges”, Asia Pacific Journal of Public Health 24 (2): 361–373 16 Nyambat B, Dang DA, Nguyen HA, Mai TQ, Rani M, Slack MP, Kilgore PE (2011), “Rapid assessment of HiB disease burden in Vietnam”, BMC Public Health 2011, 11:260 17 Peltola H (2000), “Worldwide Haemophilus influenzae Type b Disease at the Beginning of the 21st Century: Global Analysis of the Disease Burden 25 Years after the Use of the Polysaccharide Vaccine and a Decade after the Advent of Conjugates”, Clinical Microbiology Reviews 13 (2): 302–317 18 Pittman M (1931), “Variation and type specificity in the bacterial species Haemophilus influenzae”, Journal of Exprienmental Medicine 53: 471-492 19 Sell SH, Merrill RE, Doyne EO, Zimsky EP Jr (1972), “Longterm sequelae of Hemophilus influenzae meningitis”, Pediatrics 49 (2): 206–211 20 Venkatakrishnan B, Zlotnick A (2016), “The Structural Biology of Hepatitis B Virus: Form and Function”, Annual Review of Virology (1): 429–451 53 21 Watt JP, Levine OS, Santosham M (2003) “Global reduction of HiB disease: what are the next steps? Proceedings of the meeting: Scottsdale, Arizona, September 22-25, 2002”, The Journal of Pediatrics 143 (6): 163-187 22 Watt JP, Wolfson LJ, O’Brien KL, Henkle E, Deloria-Knoll M, McCall N, Lee E, Levine OS, Hajjeh R, Mulholland K, Cherian T (2009), “Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children younger than years: global estimates” The Lancet 374 (9693): 903–911 23 WHO (2006) “WHO Position Paper on Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines” Weekly Epidemiological Record 81 (47): 445–452 24 WHO (2011), Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae, 2nd edition 25 Zamenhof S, Leidy G, Fitzgerald PL, Alexander HE, Chargaff E (1953), “Polyribophosphate, the type-specific substance of Hemophilus influenzae, type b” J Biol Chem 203: 695–704 26 Zarei AE, Almehdar HA, Redwan EM (2016), “Hib Vaccines: Past, Present, and Future Perspectives”, Journal of Immunology Research: 1-18 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 27 http://ydvn.net/contents/view/24357.vi-trung-haemophilus-influenzae.htm 28 http://tiemchungmorong.vn/vi/content/vi-khuan-hib-nguyen-nhan-hang-daugay-viem-phoi-viem-mang-nao.html 29 http://weldonbiotech.com/wp-content/uploads/2018/04/SAB.CE-InsertRev.4-0713-Eng.pdf 30 http://www.wpro.who.int/vietnam/topics/hepatitis/factsheet/vi/ 31 https://www.historyofvaccines.org/timeline/all 32 http://tiemchungmorong.vn/vi/content/thanh-qua.html 54 PHỤ LỤC Phụ lục CHUẨN BỊ DUNG DỊCH ĐỂ CHUẨN ĐỘ KHÁNG THỂ KHÁNG HIB Dung dịch đệm PBS 10X, pH = 7,2 Để pha 2000 ml dung dịch đệm PBS 10X, pH = 7,2 cần: - Cân 160,3 g NaCl; 35,58 g Na2HPO4.2H2O; 8,16 g KH2PO4 cho vào bình thủy tinh Duran 2000 ml - Hòa tan nước cất, lắc cho tan - Bổ sung nước cất vào chai cho đủ 2000 ml - Điều chỉnh pH = 7,2 Dung dịch đệm Cacbonate 50mM, pH = 9,6 Để pha 1000 ml dung dịch đệm Cacbonate 50mM, pH = 9,6 cần: - Cân 1,59 g Na2CO3 ; 2,39 g NaHCO3; 0,1 g Thimerosal cho vào bình thủy tinh Duran 1000 ml - Hòa tan nước cất, lắc cho tan - Bổ sung nước cất vào chai cho đủ 1000 ml - Điều chỉnh pH = 9,6 Dung dịch đệm Sodium acetate, pH = 5,5 Để pha 1000 ml dung dịch đệm Sodium acetate, pH = 5,5 cần: - Cân 90,2 g Sodium acetate khan cho vào bình thủy tinh Duran 1000 ml - Hịa tan nước cất, lắc cho tan - Bổ sung nước cất vào bình cho đủ 1000 ml - Điều chỉnh pH = 5,5 Dung dịch PBS 1X Để pha dung dịch PBS 1X cần: - Đong 100 ml PBS 10X, pH = 7,2 cho vào bình thủy tinh Duran 1000 ml - Bổ sung nước cất vào bình cho đủ 1000 ml Dung dịch đệm rửa ELISA (PBS – 0,05% Tween 20) Để pha 1000 ml đệm rửa ELISA cần: - Đong 1000 ml PBS 1X cho vào bình thủy tinh Duran 1000 ml - Dùng micropipet loại bỏ 500 μl PBS 1X, bổ sung 500 μl Tween 20 cho vào bình Dung dịch khóa phiến (PBS – 1% BSA) Để pha 500 ml dung dịch khóa phiến cần: - Cân g BSA cho vào bình thủy tinh Duran 1000 ml - Đong 500 ml PBS 1X cho vào bình - Sử dụng máy khuấy từ để BSA tan hết Dung dịch pha lỗng mẫu (Diluent) Để pha 500 ml dung dịch khóa phiến cần: - Cân g BSA cho vào bình thủy tinh Duran 1000 ml - Đong 500 ml PBS 1X cho vào bình - Sử dụng máy khuấy từ để BSA tan hết Dung dịch đệm cộng hợp (PBS – 0,5% Tween 20 – 0,5% SK) Để pha 100 ml dung dịch đệm cộng hợp cần: - Cân 0,5 g Skim Milk cho vào bình thủy tinh Duran - Đong 100 ml PBS 1X cho vào bình - Dùng micropipet loại bỏ 500 μl PBS 1X, bổ sung 500 μl Tween 20 cho vào bình Duran Cộng hợp kháng thể dê kháng thỏ Để pha 12 ml cộng hợp kháng thể dê kháng thỏ (dùng cho phiến LISA) cần: - Đong 12 ml đệm cộng hợp cho vào ống Fancol - Dùng micropipet loại bỏ 20 μl đệm cộng hợp, sau cho thêm 20 μl cộng hợp kháng thể dê kháng thỏ cho vào ống Fancol 10 TMB/Ethanol Để pha 10 ml TMB Ethanol cần: - Cân 60 mg TMB cho vào bình thủy tinh - Đong 10 ml Ethanol 96% cho vào bình - Dùng giấy bạc bọc xung quanh bình để tránh dung dịch tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mạnh 11 Pha chất Để pha chất dùng cho phiến ELISA cần: - Dùng pipet lấy ml nước cất cho vào ống Fancol - Dùng micropipet lấy ml đệm acetate, pH = 5,5 cho vào ống Fancol - Dùng micropipet lấy 167 μl TMB/Ethanol cho vào ống Fancol - Dùng micropipet lấy μl H2O2 cho vào ống Fancol 12 Acid Sulfuric 1N Để pha 1000 ml Acid Sulfuric N cần: - Đong 1000 ml nước cất cho vào bình thủy tinh Duran - Dùng pipet loại bỏ 54 ml nước cất - Đong 54 ml Acid Sulfuric từ từ rót Acid Sulfuric vào bình nước cất Phụ lục Thành phần kit định lượng HBsAb hãng Dia.Pro Phiến ELISA 96 giếng Phiến có kích thước 8x12 giếng phủ với HBsAg tinh khiết bất hoạt nhiệt với hai loại subtype (ad ay) có nguồn gốc từ người lưu trữ túi có chất hút ẩm Các mẫu chuẩn mẫu chuẩn; 2,0 ml/mẫu Có nguồn gốc từ huyết tương dương tính HBsAb chuẩn độ theo tiêu chuẩn WHO để kháng HBsAg, khoảng: CAL1 = mIU/ml // CAL2 = 10 mIU/ml // CAL3 = 50 mIU/ml // CAL4 = 100 mIU/ml // CAL = 250 mIU/ml Chứa protein huyết người; 5% BSA; 10 mM đệm phosphate pH 7,4 +/- 0,1; 0,09% natri azide 0,1% Kathon GC làm chất bảo quản Mẫu chuẩn có màu xanh lam Đệm rửa cô đặc (Washing buffer 20X) 1x60 ml/chai Dung dịch đậm đặc 20X Sau pha loãng, dung dịch rửa chứa 10 mM đệm phosphate pH 7,0 +/0,2; 0,05% Tween 20 0,1% Kathon GC Enzyme cộng hợp 1x16 ml/lọ Dung dịch chứa HBsAg tinh khiết bất hoạt hai loại subtype ad ay, gắn HRP; 5% BSA; 10 mM đệm Tris pH 6,8 +/- 0,1; 0,3 mg/ml gentamicine sulphate 0,1% Kathon GC làm chất bảo quản Dung dịch có màu đỏ Cơ chất 1x16 ml/lọ Chứa dung dịch đệm citrat-phosphate 50 mM pH 3,53,8; 4% dimethylsulphoxide; 0,03% tetramethyl-benzidine (TMB) 0,02% hydro peroxide (H2O2) Acid sunfuric H2SO4 0,3 M 1x15 ml/lọ Chứa dung dịch H2SO4 0,3 M Dung dịch pha loãng mẫu (Diluent) 1x8 ml Dung dịch đệm Tris 10 mM pH 7,4 +/- 0,1 Có chứa 0,09% natri azide làm chất bảo quản Huyết đối chứng lọ Dạng bột đông khô Chứa protein huyết bào thai bò, kháng thể kháng HBsAg người hiệu chuẩn mức 50 ± 10% WHO mIU/ml 0,3 mg/ml gentamicine sulphate 0,1% Kathon GC làm chất bảo quản Giấy bạc gói phiến 10 Hướng dẫn sử dụng Phụ lục Thành phần 0,5 ml vắc xin IVACPENTA Giải độc tố uốn ván tinh chế (PT) Lf Giải độc tố bạch hầu tinh chế (PD) 15 Lf Nước cốt ho gà toàn tế bào bất hoạt (PM) 15 IOU Kháng nguyên bề mặt HBsAg viêm gan B (HepB) 12,5 μg Kháng nguyên HiBx cộng hợp 11 μg AlPO4 1,5 ml NaCl 4,25 ml Thiomersal 0,0275 ml Phụ lục Thông số xác định thí nghiệm đạt chuẩn sử dụng kit xác định HBsAb hãng Dia.Pro Thông số Yêu cầu Giếng trắng < 0,100 OD 450 nm CAL1 = WHO mIU/ml < 0,200 OD 450 nm sau làm trắng CAL2 = 10 WHO mIU/ml OD 450 nm cao OD 450 nm hiệu chuẩn mIU/ml + 0,100 CAL5 = 2500 WHO mIU/ml > 1,500 OD 450 nm Huyết đối chứng (Control Serum) OD 450 nm = OD 450 nm CAL 50 mIU/ml ± 10% Hệ số biến thiên < 30% cho hiệu chuẩn mIU/ml Giếng trắng < 0,100 OD 450 nm ... B (HepB) 25 2.3.2.1 Đáp ứng kháng thể viêm gan B chuột nhắt 25 2.3.2.2 Đáp ứng kháng thể viêm gan B thỏ .28 2.3.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch Haemophilus influenzae type B (HiB) ... b? ?nh nhân HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B HBcAg Hepatitis B core antigen Kháng nguyên lõi virus viêm gan B HBeAg Hepatitis B e antigen Kháng nguyên e virus viêm gan B HBsAg Hepatitis B. .. antigen Kháng nguyên b? ?? mặt virus viêm gan B HepB Hepatitis B Vaccine Vắc xin viêm gan B virus viêm gan B HiB Haemophilus influenzae type B xi HIV Human Immunodeficiency Virus Virus gây suy giảm miễn