Nghiên cứu phương pháp chế biến và một số tác dụng sinh học của vị thuốc phụ tử Sapa

Việc nghiên cứu lại cây thuốc mới này là thực sự cần thiết nhằm lựa chọn phương pháp chế biến phù hợp, xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm để đưa vào sử dụng an toàn, hiệu quả.

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẾ BIẾN VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VỊ THUỐC PHỤ TỬ SAPA PHÙNG HỒ BÌNH1 - NGUYỄN TRỌNG THƠNG2 BÙI HỒNG CƯỜNG3 Trường ĐH Dược Hà Nội Trường ĐH Y Hà Nội Cty Traphaco CS I ĐẶT VẤN ÐỀ Phụ tử - vị thuốc quý đầu vị y dược học cổ truyền (YDHCT): "Sâm, nhung, quế, phụ" Hiện nay, nguồn thuốc sử dụng nước chủ yếu nhập khơng thức từ Trung Quốc nên khơng có tiêu chuẩn chất lượng gây tâm lý lo ngại giới thầy thuốc YDHCT Vì vậy, nhiều thầy thuốc khơng sử dụng Nhân dân Sa Pa, Bắc Hà (tỉnh Lao Cai) trồng sử dụng ô đầu phụ tử làm thuốc từ nhiều năm trước Song, theo kinh nghiệm riêng nên không đảm bảo an toàn Năm 1970- 1990, GS.TS Phạm Thanh Kỳ CS nghiên cứu cách hệ thống thực vật, chế biến, hoá học số tác dụng sinh học vị thuốc phụ tử Aconitum fortunei Hemsl [1] Sau chiến tranh biên giới (1979), phụ tử bị triệt phá giống hoàn toàn Nhân dân địa phương phục hồi lại giống phụ tử không rõ nguồn gốc Việc nghiên cứu lại thuốc thực cần thiết nhằm lựa chọn phương pháp chế biến phù hợp, xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm để đưa vào sử dụng an toàn, hiệu II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu nghiên cứu - Mẫu ô đầu phụ tử thu hái thị trấn Sapa vào tháng năm 2001, 2002 Ðã GS Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học Aconitum carmichaeli Debx Họ Ranunculaceae - Phụ tử thu hoạch tháng 9/2001, bỏ củ (ô đầu), thu lẩy củ nhánh (phụ tử) phơi khô Phương pháp nghiên cứu a) Chế biến - Trên sở phương pháp chế biến Trung Quốc [2,3] chế giảm độc phụ tử, tiến hành chế biến ngâm phụ tử dung dịch muối MgCl2 NaCl đến hết vị tê với thời gian ngâm khác Sau đó, phụ tử thái thành phiến, luộc đến chín đều, phơi sấy khơ b) Ðịnh tính định lượng alcaloid: - Chuẩn bị mẫu: Kiềm hoá alcaloid NH4 OH, chiết ether, làm khan nước Na2SO4 , bốc đến khơ, cắn Hồ tan cắn dung dịch (dd) H2SO4 tiến hành phản ứng - Ðịnh tính alcaloid phản ứng hố học với thuốc thử: TT Dragendoff, TT Bouchardat, TT Mayer, Dd Resorcin - Ðịnh tính alcaloid sắc ký lớp mỏng (SKLM) Chất hấp phụ: Silicagel G; Dung môi khai triển: Cloroform/Methanol (9/1); Thuốc thử: Dragendorff - Ðịnh lượng alcaloid toàn phần mẫu nghiên cứu (MNC) theo phương pháp DĐVN III [4] c) Nghiên cứu thăm dò số tác dụng sinh học Dựa vào kết định tính, định lượng alcaloid trên, chọn MNC để thử tác dụng tim ếch lập; chọn mẫu có tác dụng tốt để thử độc tính cấp xác định LD50 + Thử tác dụng tim ếch cô lập theo phương pháp Straub Bột thô MNC chiết ethanol, tới cắn Cắn hồ tan dd Ringer để có nồng độ khác Dùng dd để nuôi tim ếch từ nồng độ thấp đến cao Mỗi lô thử thuốc tiến hành tim ếch Ghi hoạt động tim máy ghi nhịp tim Ðo tần số biên độ tim phút đầu kể từ bắt đầu thử thuốc Thuốc có tác dụng cường tim tốt đồng thời tăng biên độ tần số mà không gây loạn nhịp tim Ðánh giá tác dụng thuốc cách so sánh tần số biên độ tim ếch trước (I) với sau (II) thử thuốc độ tin cậy 95% + Thử độc tính cấp MNC theo đường uống Chuột nhắt trắng trọng lượng 18-22g giống chia lô Mỗi lô, cho chuột uống theo liều khác Theo dõi tình trạng chuột số chuột chết 72 giờ, xác định LD50 theo phương pháp Kaber III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Chế biến + Phương pháp 1: Công thức: Phụ tử (khô) 100g, Dung dịch MgCl2 30% 120g; Nước 90ml Mẫu : ngâm đến hết vị tê, thời gian ngâm 14 ngày, mẫu NN1 Mẫu 2: ngâm 150 ngày, phụ tử hết vị tê, mẫu ND1 + Phương pháp 2: Công thức: Phụ tử (khô) 100g; Dung dịch MgCl2 30% 120g; NaCl 90g; Nước 180ml Mẫu : ngâm đến hết vị tê, thời gian ngâm 12 ngày, mẫu NN2 Mẫu 2: ngâm 150 ngày, phụ tử hết vị tê, mẫu ND2 Sau giai đoạn ngâm, phụ tử thái thành phiến, luộc đến chín đều, phơi sấy khơ Cả mẫu khơng cịn vị tê Ðịnh tính định lượng alcaloid - Ðịnh tính alcaloid phản ứng hố học: Kết tất mẫu: PTS, NN1, NN2, ND1, ND2, Dịch ngâm NN1, Dịch ngâm NN2, Dịch ngâm ND1, Dịch ngâm ND2 cho phản ứng dương tính với thuốc thử: TT Dragendoff, TT Bouchardat, TT Mayer, Dd Resorcin - Ðịnh tính alcaloid sắc ký lớp mỏng (SKLM) Kết ghi bảng Bảng Tất phân tích alcaloid MNC phụ tử SKLM Số TT 100.Rf 15 23 32 Aconitin Vết alcaloid sắc ký đồ PTS NN1 NN2 ND1 V ++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ ++ ND2 V ++ 38 +++ +++ V V V 65 V V V 69 ++ V V V 75 ++ V V 88 V V V V 99 V V V V Ðịnh lượng alcaloid toàn phần MNC Kết ghi bảng V ++ V V Bảng Hàm lượng alcaloid toàn phần MNC phụ tử TT Mẫu nghiên cứu PTS NN1 NN2 ND1 ND2 Hàm lượng alcaloid (%) 0,70 0,42 0,39 0,16 0,19 Nhận xét: - Tất MNC phụ tử cho phản ứng dương tính với thuốc thử chung alcaloid dd Resorcin chứng tỏ MNC có alcaloid aconit - Trên sắc ký đồ, thấy mẫu phụ tử sống có vết (Rf = 0,38) tương đương vết aconitin chuẩn, mẫu ngâm cịn vết aconitin khơng rõ ràng - Hàm lượng alcaloid toàn phần: Mẫu phụ tử sống cao nhất, mẫu ngâm 150 ngày giảm nhiều, mức quy định DĐTQ (0,2%) [3]; mẫu ngâm ngắn ngày có hàm lượng cao mức quy định Nghiên cứu thăm dò số tác dụng sinh học MNC Chọn MNC NN1, NN2 để thử tác dụng tim ếch cô lập; chọn mẫu có tác dụng tốt để thử độc tính cấp xác định LD50 a) Thử tác dụng tim ếch lập Kết thí nghiệm ghi bảng Bảng Tác dụng dịch chiết MNC (NN1 & NN2) nồng độ khác tim ếch cô lập Mẫu NC NN1 NN2 Nồng độ (g/l) 2,0 Tần số (lần/phút) n 4,0 10,0 20,0 5 40,0 2,0 trước (I) sau (II) 32,2 ±10,1 32,2 ±2,9 35,2 ±3,2 38,4 ±5,9 32,3 ±10,1 33,6 ±5,8 36,6 ±4,1 39,6 ±0,53 53,2 ±2,6 47,2 ±8,9 42,0 ±11,5 47,6 ± 7,9 Biên độ (cm) P P trước (I) sau (II) > 0,05 2,40 ±0,82 2,56 0,88 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 1,78 ±0,62 2,06 ±0,57 1,62 ±0,41 1,9 ±0,52 2,38 ±0,55 2,18 ±0,53 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,01 1,78 ±0,28 2,30 ±0,10 < 0,01 > 0,05 15,52 1,55 ±0,45 > 0,05 4,0 10,0 5 20,0 32,2 ±4,3 34,6 ±10,7 33,2 ±6,7 33,6 ±5,1 44,0 ±14,6 36,8 ±7,0 > 0,05 < 0,05 ±0,44 2,23 ±0,83 2,34 ±0,70 2,38 ±0,69 3,08 ±0,82 > 0,05 < 0,05 < 0,05 1,74 ±0,22 1,98 ±0,26 < 0,05 Nhận xét: + NN1 có tác dụng cường tim nồng độ 40g/l; NN2 biểu rõ liều thấp hơn: 10 20g/l + Tất mẫu thử nồng độ nghiên cứu không gây rối loạn nhịp tim kể liều thử 40g/l b) Thử độc tính cấp MNC theo đường uống: Chọn MNC NN2 Bột thô NN2 chiết ethanol, cô tới cắn, hoà tan cắn nước cất với liều thử khác tương ứng: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 gDL/KgTT Cho lô chuột uống liều Theo dõi 72 giờ, thấy: Tất lô thử không thấy chuột chết, chưa xác định LD50 liều thử IV BÀN LUẬN Chế biến: Theo số phương pháp [3, 7], thường chế phụ tử sau thu hoạch (củ tươi) nên khó khăn đồng thời chế biến lượng lớn Việc nghiên cứu chế biến từ nguyên liệu khô chủ động Trên sở phương pháp chế biến Trung Quốc [2] chọn phương pháp chế biến đơn giản an toàn hiệu lực để thuận tiện cho việc sản xuất Phụ tử khơ, sau ngâm 12-14 ngày vị tê cịn khơng đáng kể - Thành phần hố học: Tất MNC cho phản ứng dương tính với alcaloid Trên sắc ký lớp mỏng, phụ tử sống có số vết alcaloid nhiều nhất, phụ tử chế hơn, đặc biệt vết Aconitin không rõ ràng Hàm lượng alcaloit toàn phần giảm nhiều (từ 0,70% xuống 0,16%) tuỳ thuộc vào phương pháp chế biến Alcaloid bị hoà tan phần vào dịch ngâm Sử dụng nước muối đậm đặc làm giảm độ khuếch tán alcaloid từ phụ tử dịch ngâm, hàm lượng alcaloid cao, giữ tác dụng thuốc Thời gian ngâm không dài, làm giảm hoạt chất - Bằng cách sàng lọc, chọn mẫu NN2 (phụ tử ngâm dung dịch muối MgCl2 NaCl) có tác dụng cường tim tốt mẫu nghiên cứu Tác dụng cường tim nhiều thành phần alcaloid: hypaconitin, mesaconitin Về mặt lý thuyết, magnesi có tác dụng điều hồ nhịp tim [5], yếu tố quan trọng hỗ trợ điều trị bệnh tim Ở liều tối đa thử (320g/KgTT chuột), thuốc không gây ngộ độc cấp thử đường uống Aconitin thành phần gây độc, loạn nhịp tim [61 bị giảm trình chế biến nên khơng gây loạn nhịp tim Trên thực tế, YDHCT thường dùng cho bệnh nhân dạng uống dịch sắc bột nên có độ an tồn cao V KẾT LUẬN - Cây ô đầu phụ tử trồng Sapa Aconitum carmichaeli Debx Họ Ranunculaceae (GS Vũ Văn Chuyên xác định) - Quy trình chế biến đơn giản: chế phụ tử từ củ khô, ngâm dịch nước muối đậm đặc (gồm MgCl2 + NaCl), luộc chín sấy khơ Sản phẩm có tác dụng cường tim tốt, không gây loạn nhịp tim an toàn sử dụng đường uống Nghiên cứu ảnh hưởng MgCl2 đến tác dụng phụ tử việc cần làm tiếp sau Summary A study for processing Radix Aconiti carmichaelii planted in Sapa (Lao Cai) by tradtional methods Radix Aconiti put in sodium and magnesium chloride solutions until having or without slightly pungent and numb taste after 12 to 14 days Studying the chemical composition shows that contents of total alcaloids and aconitin were reduced Radix Aconiti processed in different ways will give different action of cardiotonic A study in acute toxicity found that no mouse was dead in an oral maximum dose of 320g radix Aconiti per kg body weight of mouse Tài liệu tham khảo Phạm Thanh Kỳ, Phùng Hồ Bình CS Góp phần nghiên cứu đầu Việt Nam Tạp chí Dược học số 4/1990 trang 10,11,12 Ban huấn luyện đào tạo dược liệu Trung Quốc Kỹ thuật nuôi trồng chế biến dược liệu NXB nông nghiệp - 1979 trang 465, 466, 467 Pharmacopeia of the Pecople's Republic of China English Edition 2000 Volum I P 153-6 Bộ Y tế Dược điển Việt Nam III NXB Y học 2002 trang 437, 440-1 Dr Jean - Paul Curtay Josette Lyon Bách khoa toàn thư vitamin, muối khoáng yếu tố vi lượng NXB Y học - 2001 trang 239- 48 Jean Bruneton Plantes toxiques Ve gétaux dangereux pour I' Homme et les animaux Editions TEC & DOC 1999 P 399 Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học 1999 trang 876-82 _ Tạp chí Dược học -Số 2/2003Trang 21-24 ... chuột chết, chưa xác định LD50 liều thử IV BÀN LUẬN Chế biến: Theo số phương pháp [3, 7], thường chế phụ tử sau thu hoạch (củ tươi) nên khó khăn đồng thời chế biến lượng lớn Việc nghiên cứu chế biến. .. alcaloid toàn phần mẫu nghiên cứu (MNC) theo phương pháp DĐVN III [4] c) Nghiên cứu thăm dò số tác dụng sinh học Dựa vào kết định tính, định lượng alcaloid trên, chọn MNC để thử tác dụng tim ếch cô... cao mức quy định Nghiên cứu thăm dò số tác dụng sinh học MNC Chọn MNC NN1, NN2 để thử tác dụng tim ếch lập; chọn mẫu có tác dụng tốt để thử độc tính cấp xác định LD50 a) Thử tác dụng tim ếch cô