Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử

Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của vị thuốc câu kỷ tử

Trang 1

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ~~= đb»s@ LL oh -

LE THI KIM NGAN

GOP PHAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẢN HOÁ HỌC vA MOT SO TAC DUNG SINH HOC CUA VI THUOC CAU KY TU (KHOA LUAN TOT NGHIEP DUGC SY KHOA 2004-2009) Người hướng dẫn: Nơi thực hiện: Thời gian thực hiện: HA NOI, THANG 5 — 2009 PGS.TS VU VAN DIEN

Trang 2

Lol Cam on

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, ngoài sự cố gắng, nỗ lực của

bản thân, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình về kiến thức, tỉnh thân va co

sở vật chất của bộ môn Dược học cổ truyền & một số bộ môn khác trong

trường Đại học Dược Hà Nội Nhân dịp này, em xin phép được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến :

PGS 1S Vũ Văn Điền - giảng viên bộ môn Dược học cổ truyen,

Ths Dé Thi Nguyét Qué - giảng viên bộ môn Dược lực— là người đã trực

tiếp hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện giúp đỡ & đóng góp cho em những lời khuyên và kinh nghiệm quý báu

Ths Nguyễn Quốc Huy - giảng viên bộ môn Thực vật - đã giúp đỡ

em thực hiện phan vi hoc

Các thây cô giáo, các cán bộ KTV ở bộ môn Duge hoc cé truyén &

bộ môn Thực vật cùng toàn thể các Thây cô giáo trong trường đã truyền đạt

cho em những kiến thức quý giá

Em xin chán thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên,

tạo mọi điều kiện giúp đỡ trong suốt thời gian qua đề em có thể hoàn thành

khóa luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2009

Sinh viên

Trang 3

ĐT VÀN ĐẼ., ecniabiibiisaaresausssridiidnsaasasanBelssstee 1

PHAN 1, T ÔNG DÁN .ẳtetqntadonaeerasse 2

11,ĐẶC ĐIÊẾM THƯC VẶT Lúa k ngu dang 2

LL1LEEHER GHI HE VĂY ko cccseccocaeisenaassosetiiaettayatasgpaai 2

113 Đhầu Bồ di LẪT váaeeeeeeaaaaadaaoieiebiiossesxesbkaeasasagasa 3

LAF: BO DRG GRRE: vo scccrsunewaysseccscsuvssciservevaserevencqecemsaccveneneness 4

Lẻ tực đc GẦN GIG ss toss tcxvessonessteceerip erste omen veevaeceos 4 L5,.THÀNH PHẨN HỖ HÙ ga duiodỷdok_ 4 1S SAC DONG GIN TO eeeeedeiieeeoseeeeeeee 6 lã 1C Ea eeeeeeeeavararovaardrrtrgoarroidreraareesse 7 l3 GIẨ sac sa ctaccgbandtbotittocecaevrenuobsngrpyege0p0aoxgaug 9 TT Ï“Ặă——.Ắ ốằằẽ ồ 9

DE TING ects siercasansseevrcoxacunsansnuomacioumentatontensacomacanns 9 PHAN 2 THUC NGHIEM VÀ KẾT QUÁ 10 2.1 NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU 10 24 7, Wisi UN cs cases inscicsniuasianstuvcsuvecmaissnsicienianeieamnism 10

Rh De PAM PRED UGNIER CEB os os vicssesiscssuracsvcsiverscvendowcieecesssvave 11

2.2 KÉT QUÁ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT - - 13

11 BH na ih De CD aeeaaaedejyyỷ.-oa eo 13

DSF: PRE CRW BĂNG 2a eeiaadadeaeaaOesssae 17

2.2.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học - 5c cc Sss<ss<sse2 35 "E4 TỐ ằẶằẶằ-ằẰ ẴẶằẴằẽẰằẽằẽằẰẮ {ẽ5ẽằẽằẽẽs= 37

PHÀN 3 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUÁT - 5 SS sec: 39

Trang 4

DANH MUC BANG SO LIEU & HÌNH ANH BANG SO LIEU STT Tén bang Trang

1 | Hàm lượng cắn trong các phân đoạn chiết 19 2_ | Định tính các nhóm chất hữu cơ trong bột được liệu 26

3 | Dinh tính các nhóm chất hữu cơ trong cắn A & cắn B 28 4_ | Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cắn C & cắn D 29

5_ | Tóm tắt các nhóm chất hữu cơ trong 4 cắn 31

6 | Định tính cắn C theo hướng alcaloid bằn SKLM 32 7 | Định tính cắn C theo hướng flavonoid bằng SKLM 34

8 | Sự biến đổi glucose huyết theo thời gian trên chuột thí nghiệm | 35

HÌNH ẢNH

1 | Hoa & la Lycium chinense Mill 2 | Qua Lycium chinense Mill

3 | Câu kỷ tử 13

| 4 | Hạt câu kỷ tử 13

5| Vi phẫu vỏ câu kỷ tử 14

6 | Vi phẫu hạt câu kỷ tử 15

7 | Một số đặc điểm soi bột câu kỷ tử l6

8 | So đồ chiết xuất 4 phân đoạn Câu kỷ tử 18

| 9 | Sac kí đồ cắn C ở bước sóng 366 nm 33

| 10 | Sắc kí đồ của cắn C ở bước sóng 366 nm 34

| 11 | Sắc kí đồ của cắn C ở bước sóng 254 nm 34

Trang 5

DANH MUC CHU VIET TAT Bs : — Bước sóng CKT : — Câu kỷ tử DCC : Dịch chiết cồn DCN : Dịch chiết nước DD, dd : — Dung dịch

DDVN : Duge dién Viét Nam

DTD : Đái tháo đường

Trang 6

DAT VAN DE

Trong Y học cỗ truyền (Đông y) Câu kỷ tử là vị thuốc được dùng khá

phô biến (đầu vị) ở Việt Nam, Trung Quốc và nhiều nước trên thế giới, nó có tác dụng bổ can thận, ích tinh tuỷ, bỗ phế, chữa suy nhược cơ thể Ở Việt

Nam vị thuốc này vẫn phải nhập từ Trung Quốc là chủ yếu Đã có rất nhiều

nghiên cứu chứng minh được nhiều công dụng mà y học cổ truyền đã dùng & bổ sung những tác dụng mới

Đái tháo đường là một bệnh rối loạn chuyển hoá đang gia tăng theo sự nâng cao mức sống Hiện nay đây cũng là một bệnh khá phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt là Đái tháo đường týp II Việc nghiên cứu tìm thêm thuốc điều trị từ thảo dược là rất cần thiết Vì bệnh Tiểu đường týp II thường phải dùng thuốc

thường xuyên, kéo dài & nếu dùng thuốc tây y thường tác dụng giảm nhanh

nhưng nếu dùng kéo dài thì có những tác dụng bất lợi Vị thuốc Câu kỷ tử là

một trong những vị thuốc mà đông y sử dụng để điều trị bệnh Đái tháo đường Để góp phần đánh giá đúng khả năng của vị thuốc này, tìm hiểu phân đoạn nào, thành phần nào có tác dụng chính, vì vậy chúng tôi đã tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh

học của vị thuốc Câu kỷ tử” với các nội dung sau:

> Chiết tách, định lượng cắn các phân đoạn bằng các dung môi có độ

phân cực khác nhau

> Định tính một số nhóm chất trong bột dược liệu & các phân đoạn

Trang 7

PHAN 1 TONG QUAN

1.1 DAC DIEM THUC VAT

Tén khoa hoc : Lycium chinense Mill

Tén Viét Nam : Câu kỷ tử, củ khởi, rau khởi, khủ khởi, khởi tử,

địa cốt bì, phjăc khau khi (Tay)

Tên nước ngoài : Chinenese box — thorn, Chinense desert thorn,

Chinense wolfberry, Chinense matrimony vine (Anh), Lyciet (Phap)

Ho : Ca (Solanaceae)

Ở Trung Quốc ngoài dùng Cau ky tir loai Lycium chinense con ding Câu kỷ

tử thuộc loài Lycium barbarum vGi tén Ninh ha Cau kỷ với tác dụng công dung nhu nhau [8], [18], [38]

1.1.1 Hình thái thực vật [3], [7], [11], [16], [18], [20], [21], [22],

s* Câu kỷ là 1 loại cây nhỏ, cao 0.5-lm, mọc đứng thành bụi sum suê, phân

cành nhiều Cành cứng, nhỏ, uốn cong cần câu & ngã xuống có thể dài

đến 4m, đôi khi có gai ngắn ở kẽ lá, màu xám vàng, dài 5cm

s* Lá nguyên, mọc so le hoặc tụ tập 4-5 cái, hình mũi mác, hẹp dần ở gốc,

đầu tù hoặc nhọn, mép uốn lượn, hai mặt nhẫn, mặt trên màu lục sẫm

bóng, mặt dưới nhạt, cuống lá ngắn chỉ 2-6 mm

* Hoa nhỏ, mọc đơn độc hoặc một số hoa mọc tụ lại ở kẻ lá, cánh hoa màu

tím nhạt hoặc tím đỏ, đài nhẫn hình chuông có 3-6 thùy Tràng hình

phéu, 5 cánh, có lông ở mép Nhị 5 đính ở ống tràng

s* Quả mọng, hình trứng dài 0.5-1.5cm, đường kính 4-Smm [20], khi chin

mau d6 sam hoặc vang do Hat nhiéu, hinh than det, dai 2-2.5mm [21],

[18], [20]

Trang 8

HI Hoa & lá Lyciwm chinense Mill — H2 Quả Lycium chỉinense MIII

Nguôn ảnh:

Hình 1: www.webtretho.com/forum/showthread.php?t=221221 Hinh 2: http://ecocrop.fao.org/ecocrop/srv/en/crop View?id=7444

1.1.2 Phan bé sinh thai [9], [18], [21], [22]

% Chi Lycium L cé khoang 100 loai trên thế giới, phân bố rải rác khắp các

vùng nhiệt đới và á nhiệt đới ở châu Mỹ châu Phi & châu Á Có 2 loài câu kỷ đáng chú ý là:

>» Cau ky qua do: (Lycium chinense Mill.) & loai Lycium barbarum cé

nguồn gốc từ vùng Tây á, mọc hoang và trồng nhiều ở Trung Quốc,

Nhật Bản, Triều Tiên, Malaysia, Indonesia

> Câu kỷ quả đen (L.ruthenicum Murray) cũng có nguồn gốc ở vùng Tây

á hoặc Nam á Cây được trồng ở Ân Độ, Malaysia và một số nơi khác %Ở Việt Nam hiện nay cé ca 2 loai L.chinense & L.ruthenicum nhưng

không rõ được nhập từ bao giờ Cây trồng ở Đà Lạt (Lâm Đồng), Hà Nội

& một số nơi khác nhưng chỉ dùng làm rau ăn Từ năm 1996, Trạm Nghiên Cứu Dược Liệu Thanh Hóa đã nghiên cứu trồng loài Lycium chinense Mill thành công và hàng năm đều thu hoạch được nhiều quả * Nhìn chung cả 2 loài Câu kỷ trên đều là cây ưa sáng & ưa ẩm Cây sinh

trưởng tốt trong vụ xuân — hè, có hoa quả vào cuối mùa hè đến đầu mùa

Trang 9

muốn có hoa quả, không được thu hoạch ngọn và lá làm rau Câu kỷ có

khả năng tái sinh chồi sau khi chặt Từng đoạn thân, cành đem vùi xuống

đất cũng có khả năng tái sinh

1.1.3 BO phan ding [21]

> Qua chín phơi khô của cây Câu kỷ Quả được thu hái sau khi chuyển sang màu đỏ da cam Sau khi đem phơi âm can để vỏ quả se lại thi dem phơi nắng cho đến khi vỏ quả khô lại và cứng, còn ruột thì vẫn xốp

> Vỏ rễ phơi hay sấy khô (Địa cốt bì) 1.1.4 Đặc điểm vi học [8]

s* Vi phẫu Câu kỷ tử:

> Vỏ quả ngoài gồm một lớp tế bào dài, vách hơi dày, bên ngoài có lớp cutin Vỏ quả giữa có khoảng một chục lớp tế bào to nhỏ không đều,

trong có tỉnh thể calci oxalat dạng cát và các bó libe -gỗ sắp xếp không theo thứ tự nhất định Vỏ quả trong gồm một lớp tế bào hình tròn hay hình trứng tạo thành lớp tế bào hơi nhấp nhô

> Vỏ hạt gồm một lớp tế bào mô cứng hình chữ nhật ở phía ngoài, phía

trong là một vài hàng tế bào bị ép, dẹt Tế bào nội nhũ hình đa giác,

trong có giọt dầu Rễ mầm được cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác

Mô mềm lá mầm không rõ rệt s* ,Soi bội

Câu kỷ tử (CKT): Tế bào vỏ quả hình đa giác hoặc hình chữ nhật, to

nhỏ không đều Mảnh mạch xoắn Tế bào vỏ hạt có vách nhấp nhô Mảnh tế bào nội nhũ Các giọt dầu màu vàng cam

1.2 THÀNH PHÀN HÓA HỌC

Trang 10

cao (18%) trong phân đoạn trung tính Các ester của các acid béo Ca, C¡¿

và C¡s cũng có với tỷ lệ cao Quả có betain 0.09% [9], zeaxanthin, physalien [21] Hac Hey / ae = nf HP Betain OH HO Zeaxanthin

> Qua con cd 3 mg% acid ascorbic, 1.7 mg% acid nicotianic, atropin

[18], lysin, cholin, 3.96 mg% caroten, 150 mg% Ca, 6-7 mg% P, 3.4 mg% Fe, 0.23 mg% amoni sulfat [10], [22]

> Quả chứa chất béo 2.2%, protein 4.6%, acid cyanhydric và có thể có atropin [11], 18] * Hai chất còn được chiết tách từ quả và nhận dạng là B-Sitosterol va Acid melissic B-Sitosterol

Trang 11

có gramisterol (44%), citrostadienol (18%), lophenol (9%), cycloeucalenol (8%), nor- cycloartenol (6%), obtusifoliol (6% )

Cycloartenol

s* Theo A.Y.Leung và cộng sự (1966), quả chứa §-10% acid amin trong đó chừng l nửa ở dạng tự do: acid aspartic 1.2%, Prolin 0.65%, Acid

glutamic 0.63%, Alanin 0.37%, Arginin 0.19%, Serin 0.14% va 9 acid

amin khac [21]

s* Vỏ cây cũng chứa j-Sitosterol và Acid melissic Ngoài ra, còn có Acid linoleic, 5 @ - stigmastan-3,6-dion, sugiol [21]

s* Vỏ rễ chứa :

> Betain, acid malissic, sugiol [9]

> 0.08% alcaloid, 1.07% saponin, 1 alcaloid gọi là kukoamin và một dipeptid gọi là lyciumamid (N-benzoyl-L-phenylalanyl-L- phenylalaninol acetat) [21], [22]

*%*Lá chứa Betain, lyciumwithanolid A và B, tinh dau trong đó

hydroxydehydro-J-ionol [21] Va protein 3.5%, lipid 0.72%, glucid 2.25%,

tro 1.37%, rat giau vitamin A [22]

s* Câu kỷ còn được cho là có scopoletin, acid vanilic [2I]

1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC

Các bộ phận của cây Câu kỷ thường được sử dụng trong điều trị như:

quả, vỏ rễ & lá Nhưng trong phạm vi nội dung của bài khóa luận này chỉ tập

Trang 12

1.3.1 Câu kỷ tử

* Tác dụng tăng cường miễn dịch [21]

> Nước sắc Câu kỷ tử 50% với liều 2.5g/kg/ngày, dùng bằng đường uống trong 3 ngày liên tiếp, làm tăng cường khả năng thực bào của đại thực

bào trong xoang bụng chuột nhắt, đồng thời tăng cường hoạt động của

men lysozym trong huyết thanh và nâng cao hiệu quả kháng thể kháng

hồng cầu cừu của huyết thanh & tăng số lượng tế bào có kháng thể hình thành trong tô chức lách

> Quan sát (QS) trên lâm sàng ở những người già mà chức năng miễn dịch

giảm, dùng dạng chiết từ Câu kỷ tử hoặc ăn quả Câu kỷ tử tươi thì hệ

thống miễn dịch đã bị giảm của họ được điều chỉnh, tỷ lệ chuyển hóa của nguyên bạch câu (leukocytoblast), globulin miễn dịch trong huyết

thanh như IgG, IgA và IgM đều tăng

s* Tác dụng hạ Cholesterol huyết, đường huyết & bảo vệ gan

> Dạng chiết nước từ Câu kỷ tử dùng cho chuột cống trắng và thỏ có tác

dụng làm giảm cholesterol & có tác dụng bảo vệ gan Nuôi chuột dài

ngày (75 ngày) bằng thức ăn có trộn dạng chiết từ Câu kỷ tử (0.5% và 1%) hoặc betain (0.1%) có tác dụng bảo vệ gan, chống lại những tổn

thương do tetraclorua- cacbon gây nên [21]

> Dẫn chất pyrrole có tác dụng bảo vệ gan so với sylibin ở nồng độ 0.]

microM (64.6 va 65.8%) [24]

>» Zeaxanthin dipalmitate cé trong qua Lycium chinense lam giam kha nang xo gan trong thực nghiệm trên chuột [29]

> Qua Lycium chienese có tác dụng bảo vệ do tetrachloride gây độc cho gan [26]

> Cerebroside trong Lycium chinense có tắc dụng bảo vệ các tế bào gan

Trang 13

> Trên lâm sàng, những người già trên 60 tuổi uống dạng chiết từ Câu kỷ

tử với liều 100mg liên tục trong 4 tuần lễ thì cholesterol huyết, -

lipoprotein & triglycerid đều giảm [21] * Tác dụng chống lão hoá [S]

> Dạng chiết nước từ Câu kỷ tử cho vào thức ăn của ruồi giấm (2%), làm

cho sức ăn của ruồi giấm tăng 47% & ức chế sự tích lũy fuscin của ruồi > Người già mỗi ngày dùng 5g quả câu kỷ trong 10 ngày liên tiếp thì hoạt

độ của men superoxid dismutase (SOD) tăng 48%, hemoglobin tăng 12% & lipid peroxyd giảm 65%

%* Tác dụng dối với hệ thống máu [21]

> Nước sắc Câu kỷ tử (10%) dùng cho chuột nhắt trắng với liều 0,5ml/kg

chuột liên tục trong 10 ngày làm tăng lượng bạch cầu Dạng đông khô Câu kỷ tử có tác dụng ngăn ngừa hiện tượng giảm bạch cầu do cyclophosphamid gây nên trong điều trị ung thư thực nghiệm trên chuột

cống trắng

> Người bình thường hoặc bệnh nhân ung thư ăn quả khô câu kỷ 5g/ngày

liên tục thì số lượng bạch cầu tăng lên rõ rệt

s* Các tác dụng khác

> Betain làm tăng trọng gà nuôi thịt so với lô đối chứng, và làm tăng lượng trứng đẻ ở gà mẹ Dịch chiết Câu kỷ tử tác dụng trực tiếp lên tuyến yên của chuột cống trắng kích thích rụng trứng [21]

> Betain có thể tăng giải phóng mucin & tác dụng này cần được nghiên

cứu tiếp để có thê được dùng như là những thuốc long đờm trong điều trị các bệnh đường hô hấp cấp & mãn tính [31]

> Dịch chiết MeOH & dịch chiết nước (DCN) của Câu kỷ tử có tác dụng

Trang 14

> Dịch chiết MeOH của Eyeiwm chinense ức chế hoạt tính & chọn lọc đối với monoamine oxidase B (MAO-B) có các giá trị IC50 là 0.44, 0.29,

0.40 Vì vậy nó có thể làm chậm trễ tiến trình thoái hóa gây ra do các bệnh thần kinh [33] > Độc tính: Câu kỷ tử có độc tính thấp 1.3.2 Địa cốt bì >» Tac dung ha sot, ha duong huyét, ha cholesterol mau & ha huyét ap > Tác dụng kháng khuẩn > Chống nấm [34], chống oxy hóa mạnh [30]

> Độc tính: Nước sắc địa cốt bì trên chuột nhắt trắng dùng qua đường dạ

dày với liều 262,6g/kg súc vật vẫn không chết

1.3.3 Lá : Thường được dùng làm rau ăn

1.4 CÔNG DỤNG

s* Tính vi, cong nang [21]

> Tinh vi : Vi ngot, tinh binh

> Quy kinh =: Can, than

> Công năng : Dưỡng can, minh mục, bé than, ich tinh, nhuận phé

* Công dụng: Câu kỷ tử được coi là vị thuốc bỗ toàn thân dùng cho cơ thể

Trang 15

PHAN 2 THUC NGHIEM VA KET QUA

2.1 NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1.1 Nguyén liéu

Qua cua cay Cau ky (Lycium chinense Mill., hg Ca Solanaceae) duge mua tại công ty dược liệu Mediplantex

s* Phương tiện

> Thiết bị

Bộ bình chiết Soxlech, máy cất quay Buchi (Thuy Sÿ)

Tủ sấy Memmeret (Đức), cân xác định độ 4m Precisa XM-120, cân phân tích

Máy đo đường huyết Sure Step cùng kít thử tương ứng, nhà sản xuất

Lifescan, Inc, Milpitas, USA

Đèn tir ngoai, may anh Canon IXY digital

Bép dun cach thuy, tủ lạnh

Kinh hién vi Leica (Birc), lam kinh, phién kinh, dao tem,

> Héa chit

Các dung môi được mua tại thị trường Hà Nội đạt tiêu chuẩn phân tích

Streptozotocin bét pha tiém (STZ) cia hang MP Biomedicals, LCC, Phap

Các thuốc thử: Mayer, Diazo, Dragendoff, Ninhydrin, FeCl; 5%,

Ban mong silicagen GF 254 (Merk) > Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss có trọng lượng từ 16-18 g, cả 2 giống,

đạt tiêu chuẩn thí nghiệm được mua từ Viện vệ sinh & Dịch tễ TW

Trang 16

"Chuột sau khi được mua về nuôi 3-5 ngày trước khi làm thí nghiệm tại phòng thí nghiệm bộ môn Dược lý-Trường Đại Học Dược Hà Nội

Chuột được cho ăn thức ăn chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp và

được cho uống nước đun sôi để nguội

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Kiếm tra tính đúng của dược liệu

s* Vi Cau ky tử được mua tại công ty dược liệu (DL) Mediplantex, nhập từ

Trung Quốc Do đó không thể xác định rõ được tên khoa học & tính

đúng của vị thuốc Vì vậy chúng tôi phải dựa vào DĐVN II & Dược

điển Trung Quốc (2005) để xác định

s* Mô tả đặc điểm bên ngoài của được liệu bằng quan sát trực tiếp với mắt

thường & kính lúp để đối chiếu với đặc điểm được mô tả trong được

điển

* Dược liệu được nghiền (tán) thành bột mịn, soi dưới kính hiển vi và xác

định các đặc điểm của bột dược liệu theo tài liệu [8]

* Ngâm dược liệu trong cồn 50°, cắt & nhuộm bằng phương pháp nhuộm

kép theo [4] Sau đó xác định các đặc điểm vi phẫu của dược liệu [8]

2.1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

s* Chiết xuất dược liệu bằng MeOH, sau đó chiết phân đoạn bằng các dung

môi có độ phân cực tăng dân Tiến hành định lượng cắn trong các phân

đoạn bằng phương pháp cân

s* Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong dược liệu & cắn của các phân

đoạn bằng phản ứng hóa học

s* Định tính một số nhóm chất trong cắn các phân đoạn bằng SKLM

Phần nghiên cứu về hoá học tiến hành theo các phương pháp hoá thực vật thường qui ghi trong các tài liệu [2], [3], [14]

2.1.2.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học

Trang 17

Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết (GH) của Câu kỷ tử

+ +9 Phương pháp: Gây tăng glucose huyết bằng STZ (theo phương pháp của

Hsu (1997) & CT Nityanand (1984) ) [28]

> Nguyên tắc: STZ gây độc trực tiếp và chọn lọc trên tế bào B của đảo tụy thông qua hệ thống vận chuyển GLUT2, bẻ gãy sợi ADN, ức chế sự sao chép ADN, ức chế sự nhân lên của tế bào, đần dần dẫn đến hủy hoại tế

bào đảo tụy và gây ra tình trạng ĐTĐ trên động vật thực nghiệm STZ

đã được nhiều nhà khoa học sử dụng để làm tác nhân gây ĐTĐ thực

nghiệm trên động vật

> Chuột nhắt trắng được nuôi ôn định trong phòng thí nghiệm, sau đó gây

tăng GH bằng cách tiêm màng bụng STZ một liều duy nhất là

I50mg/kg Định lượng GH của chuột trước và sau khi tiêm 72h (3 ngày sau), lựa chọn những con có GH tăng cao trên 10mmol/1 để tiến hành thi

nghiệm Cho uống thuốc thử (TT), đến ngày thứ 5, định lượng GH GH

được đo bằng máy đo GH Sure Step kèm theo kít thử tương ứng

> So sánh nồng độ glucose huyết trước & sau khi uống thuốc thử giữa các

lô thử thuốc & lô chứng

> Công thức tính độ giảm glucose huyết :

Di tenth <= « am Ọ giam ( 0) — Ctr X

Trong đó :

“Cụ: Nồng độ GH trước khi uống thuốc hoặc dung môi pha thuốc = C;: Nồng độ GH sau khi uống thuốc hoặc dung môi pha thuốc “> Xử by số liệu:

“Số liệu được xử ký bằng phương pháp thống kê sinh học test T-student,

sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2003 Với độ tin cậy 95%, sự khác

Trang 18

biệt có ý nghĩa thống kê nếu P < 0.05 và không có ý nghĩa thống kê nếu P > 0.05 [23]

= Két qua (KQ) thi nghiém dugc biéu thi bằng trị số trung bình cộng / trừ sai sé chuan (M + SE)

2.2 KET QUA THUC NGHIEM VA NHAN XET 2.2.1 KIEM TRA TINH DUNG CUA DUOC LIEU 2.2.1.1 Đặc điểm dược liệu

s* Quả hình trứng dài hay trái xoan, hai đầu hơi lõm, dài 1-2cm, đường

kính 5-7 mm, mặt ngoài đỏ sẫm đến đỏ xám, mềm, bóng, thường nhăn

nheo Gốc quả có vết cuống quả màu trắng còn sót lại, đỉnh quả có điểm nhỏ hơi nhô lên

% Quả có nhiều hạt nhỏ hình thận dẹt, hai mặt hơi căng phông lên hoặc có

| mặt lõm Hạt màu vàng nâu có nội nhũ, rốn hạt là một điểm nhỏ ở mép hạt

s* Chất mềm, vị ngọt , hơi chua

Hình 3 Câu kỷ tử Hình 4 Hạt câu kỷ tử

%% Nhận xét: Sau khi quan sát bằng mắt thường & kính lúp, so sánh với các đặc điểm của dược liệu được mô tả trong DĐVN III [8], thấy hoàn

toàn giống nhau

Trang 19

ine 2.2.1.2 Đặc điểm vi phẫu

% Làm vi phẫu câu kỷ tử: Tách riêng vỏ quả & hạt của Câu kỷ tử, cắt ngang & nhuộm vi phẫu theo phương pháp nhuộm kép, lên tiêu bản

bằng phương pháp giọt ép [4]

s* Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở các vật kính 4, 10 và 40

A Vi phẫu vỏ quả

Mặt cắt ngang vỏ quả nhìn từ ngoài vào trong gồm các đặc điểm:

s* Vỏ quả ngoài gồm một lớp tế bào dài, vách hơi dày, bên ngoài có lớp

cutin

Vỏ quả giữa có khoảng một chục lớp tế bào to nhỏ không đều, trong có

các tinh thé calci oxalat đạng cát và các bó libe - gỗ sắp xếp không theo

thứ tự nhất định

% Vỏ quả trong gồm một lớp tế bào hình tròn hay hình trứng tạo thành

lớp tế bào hơi nhấp nhô (Hình 5)

Hình 5 Vi phẫu vỏ Câu kỷ tử s» Chú thích:

Trang 20

.~

2.2.1.3 Đặc điểm bột dược liệu

Bột dược liệu có màu đỏ cam, có vị ngọt, hơi chua Gồm các thành phần sau:

s Tế bào vỏ quả hình đa giác hoặc hình chữ nhật, to nhỏ không đều

s* Mảnh mạch xoắn

s* Tế bào vỏ hạt có vách nhấp nhô % Mảnh tế bào nội nhũ

s* Các giọt dầu màu vàng cam (Hình 7)

Trang 21

Sau khi kiểm tra đặc điểm được liệu, vi phẫu, soi bột được liệu, thấy

các đặc điểm giống với các đặc điểm được mô tả trong DĐVN III Vì vậy chúng tôi cho rằng mẫu nghiên cứu chính là mẫu đã được ghi trong DĐVN III

với tên khoa học là Lycium chinense Mill

2.2.2 NGHIÊN CUU VE HOA HOC

2.2.2.1 Chiết tách, định lượng cắn các phân đoạn của bột Câu kỷ tử

s* Bột được liệu xay thô, cân một lượng chính xác, gói bằng giấy lọc, đặt vào bình chiết soxchlet, chiết bằng MeOH Thu hồi dịch chiết MeOH dưới áp

suất giảm cho tới cao lỏng

s* Hòa tan cao lỏng trong nước nóng, được dịch chiết nước Đem dịch chiết

nước lắc lần lượt với với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan,

CHC]:, EtOAc, n-BuOH, thu được dịch chiết 4 phân đoạn, cất thu hồi dung môi thu được cắn, kí hiệu la: A, B, C, D tương ứng

s* Quá trình chiết xuất 4 phân đoạn Câu kỷ tử được tóm tắt ở sơ đồ hình 8

Trang 22

Bột DL + MeOH r DC MeOH MeOH thu hồi Căn «| Nước nóng DCN + n- hexan + CHCl, + EtOAc + nBuOH `

Dc n- hexan Dc CHC]; Dc EtOAc Dc n-BuOH

n-hexan | CHCl; || | EtOAc n-BuOH L_

Trang 23

% Cắn thu được của các phân đoạn đem sấy ở 50°C đến khối lượng không

đổi Cân cắn & tính hàm lượng các chất trong các phân đoạn theo công thức: X (%)= ————— x 100 m(1—0,01.h) Trong đó: > X : Hàm lượng chất (%) | > a : Khối lượng cắn (8)

| > m : Khối lượng dược liệu cần định lượng (g) > h : Độ âm dược liệu (%)

| 4+ Tiến hành định lượng 5 lần, lấy kết quả trung bình Kết quả được tóm

| tat 6 bang 1

| Bảng 1 Hàm lượng cắn trong các phân đoạn chiết

| 6 Khoi | Độ Căn A Căn B Căn C Căn D lượng | am iz DL | DL | (g) | (%)| (g) |(Œ42)| (œ) |(@%2)| () |@®2 (g) | (%) 1} 150 | 7.51 | 4.74 | 3.42] 2.48 | 1.79] 2.45 |1.77| 9.47 | 6.83 2| 150 | 7.63 | 4.57 | 3.30] 2.82 | 2.04] 3.11 | 2.25] 10.53 | 7.60 3 | 250 | 6.91 | 7.19 | 3,09| 3.50 | 1.50 | 3.70 | 1.59 | 16.26 | 6.99 4| 250 | 7.32 | 8.01 |3,46 | 3.53 | 1.52 | 4.88 | 2.11] 17.34 | 7.48 5 | 580 | 6.87 | 16.52 | 3,06] 7.90 | 1.46 | 9.66 | 1.79 | 38.42 | 7.11 TB 3.23 + 0.09 | 1.63 + 0.14 | 1.93 + 0.15 | 7.30 + 0.15

s* Nhận xét: Sau 5 lần định lượng, thây hàm lượng căn D là nhiêu nhất, có

thể là vì n- BuOH có độ phân cực lớn, do vậy hòa tan được nhiều chất hơn so với các phân đoạn còn lại Hàm lượng cắn A cũng tương

đối nhiều so với 2 cắn B & C

Trang 24

2.2.2.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học A Định tính các nhóm chất hữu cơ trong bột dược liệu

s* Câu kỷ tử đem sấy khô, xay thành bột thô để định tính

` Lấy 40g bột dược liệu chiết với 100ml cồn 909, lọc qua giấy lọc hoặc

bông, thu được dịch chiết cồn (DCC) để làm các phản ứng định tính

* Lấy 40g bột được liệu chiết nóng với 100ml nước (đun trên bếp cách

thủy), lọc qua bông thu được DCN để làm các phản ứng định tính

A.I Định tính alcaloid

* Lấy khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 50ml,

thêm 10ml dd H;ạSO¿ 1N, đun đến sôi, để nguội Lọc vào l1 bình gạn,

kiềm hóa dịch lọc bằng dd NHạ đặc (6N), sau đó cho vào bình gạn, lắc với CHCI; 3 lần, mỗi lần 10ml Gộp hết dịch chiết CHCI; bốc hơi đến khô, thu được cắn alcaloid base, hòa tan cắn bằng 10 ml H;SO¿ IN,

chia vào 3 ống nghiệm đẻ làm các phản ứng sau:

> Ông 1: Thêm 1-2 giọt TT Mayer, xuất hiện tủa vàng nhạt (phản ứng dương tính) > Ong 2: Thêm 1-2 giọt TT Bouchardat, xuất hiện tủa nâu.( phản ứng dương tính) > Ong 3: Thém 1-2 giọt TT Dragendorff, xuất hiện tủa đỏ cam (phản ứng dương tính)

s* Nhận xét: Trong bột Câu kỷ tử có chứa alcaloid A.2 Dinh tinh flavonoid

s* Phản ứng Cyanidin: Cho 2ml DCC vào 1 ống nghiệm, thêm 1 ít bột Mg kim loại Nhỏ từ từ vài giọt HCI đậm đặc, lắc nhẹ, đun cách thủy 5°

QS: DD chuyển sang màu đỏ cam (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lan, KQ tuong tu

Trang 25

s* Phản ứng với FeCl]; 5%: Cho 2ml DCC vào 1 ống nghiệm, thêm vài giọt dd FeCls 5%, lắc nhẹ QS: DD chuyển sang màu xanh den (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự s* Phản ứng với kiêm: Cho 1 ml DCC vào 1 ống nghiệm, thêm 3 giọt dd NaOH 10% QS: Xuất hiện tủa vàng nâu (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

s* Phản ứng với NH; đặc: Nhỏ vài giọt DCC lên 1 mẫu giấy lọc, sây khô

nhẹ, đem hơ trên miệng lọ dd NH; đặc

QS: Vết DC chuyên từ vàng nhạt sang đậm dần (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

s* Nhận xét: Trong bột Câu kỷ tử có chứa flavonoid

A.3 Dinh tinh glycosid tim

s* Cân khoảng 10g bét duge DL cho vao | bình nón có dung tích 100ml,

thêm 50ml nước Ngâm trong 24h Sau đó gạn, lọc dịch chiết vào 1 cốc

có mỏ Thêm khoảng 3ml dd Pb(CH;COO); 30%, khuấy đều, lọc qua

giấy lọc để loại tủa tạp Lặp lại 3-5 lần đến khi loại hết tạp (không còn

tủa nữa) Gộp toàn bộ dịch lọc vào bình gạn, lắc kỹ 3 lần với CHC];,

mỗi lần 5ml Gan lấy dịch chiết CHC]; vào cốc có mỏ Chia vào 3 ống

nghiệm nhỏ, bốc hơi cách thủy dến khô Cắn thu dược đem tiến hành các phản ứng định tính:

> Phản ứng Lieberman: Thêm vào ông nghiệm Iml anhydrid acetic, lắc đều

cho tan hết cắn, nghiêng ống nghiệm 45°, cho từ từ theo thành ống 0.5 ml

H;SO¿ đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống

Trang 26

QS: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ, lớp

chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá cây (phản ứng

dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

> Phan ung Baljet:

= Pha TT Baljet: Cho vao 6ng nghiém to 1 phan dd acid picric 1% & 9 phan dd NaOH 10%, lắc đều

“ Cho 0.5 ml EtOH 90 vào ống nghiệm chứa cắn, lắc đều cho tan hết cắn

Nhỏ từng giọt TT Baljet mới pha, không thấy xuất hiện màu đỏ cam (phản ứng âm tính) Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

> Phản ứng Legal: Thêm vào ông nghiệm 0.5ml EtOH 90°, lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt TT Natri nitroprussiat 1% và 2 giọt dd NaOH 10%, lắc đều

QS: không thấy xuất hiện màu đỏ cam (phản ứng âm tính) Phản ứng được lặp

lại 3 lần, KQ tương tự

s* Nhận xéi: Trong bột CKT không có glycosid tim Tuy phản ứng

Liberman dương tính nhưng cả 2 phản ứng Legal & Baljet đều âm tính

Ta có thể nhận xét đó có thể là phản ứng của vòng sterol

A.4 Định tinh saponin

s* Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ông nghiệm 5ml DCN, bịt miệng

ống nghiệm, lắc mạnh theo chiều dọc 5’, dé yên

QS: Thấy xuất hiện cột bọt bễn vững sau 15° (phản ứng dương tính)

Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

s* Sơ bộ phân biét saponin steroid va saponin triterpenoid:

Cho vao 2 éng nghiém to:

> Ong 1: 5ml NaOH 0.1N (pH 13)

> Ong 2: Sm! HCI 0.1N (pH 1)

Thêm vào mỗi ống 3 giọt DCC Lắc mạnh cả 2 ống trong 3° Để yên

Trang 27

QS: Cột bọt trong ống nghiệm I cao hơn cột bọt trong ống nghiệm 2 Sơ bộ

nhận xét trong Câu kỷ tử có saponin steroid Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

“+ Phản ứng Liebermann-Burchardr: Lẫy 1ml DCC cho vào 1 ống

nghiệm, bốc hơi đến cắn Thêm vào Iml anhydrid acetic, lắc đều cho đến khi tan hết cắn, cho thêm 1 giọt HạSOx đậm đặc

QS: Xuất hiện màu xanh lá Sơ bộ nhận xét trong Câu kỷ tử có saponin steroid Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

s* Nhận xét: Sơ bộ nhận xét trong bột Câu kỷ tử có saponin steroid A.5S Dinh tinh anthranoid

%* Phản ứng Borntraege: Cho vào ông nghiệm 1g bột DL, thêm 5ml dd

H;SO¿ 25% Đun nhẹ khoảng 5°, để nguội, lọc Lắc với 10ml ether, gạn lớp ether ra 1 ống nghiệm khác rồi thêm 1 ít dd NaOH 10% Lắc nhẹ QS: Không thấy lớp nước có màu đỏ sim (phản ứng âm tính) Phản ứng được

lặp lại 3 lần, KQ tương tự

s* Nhận xéi: Trong bột Câu kỷ tử không có anthranoid A.6 Dinh tinh coumarin

“ Phan tng mé, dong vong lacton: Cho vao 2 éng nghiệm mỗi ống Iml DCC Sau đó:

> Ông 1: Thêm 0.5ml dd NaOH 10%

> ng 2: Để nguyên

Đun cả 2 ống đến sôi, để nguội QS: > Ông 1: Có tủa màu vàng nâu > ng 2: DD không thay đổi

Sau đó thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cắt, lắc đều QS: > Ong I: Trong suốt

> Ông 2: Có tủa đục

Trang 28

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCI đặc, dd sẽ trở lại tủa đục như ống 2

(phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

%* Phản ứng diazo hóa: Cho vào ông nghiệm 1ml dich chiết, thêm 1ml dd

NaOH 10%, lắc kỹ Nhỏ vài giọt TT Diazo mới pha

QS: Thấy xuất hiện màu đỏ gạch (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

s* Nhận xét: Trong bột Câu kỷ tử có coumarin A.7 Định tính tanin

Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2ml DCN, tiến hành các phản ứng:

s* Phản ứng với dd FeCl; 5 %: Thêm 2 giọt dd FeCl 5%, lắc đều

QS: Thấy tủa màu xanh đen (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp

lại 3 lần, KQ tương tự

s* Phản ứng voi dd Pb(CH;COO)210%: Thém 2 giot Pb(CH;COO), 10%

QS: Thấy xuất hiện tủa bông (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp

lại 3 lần, KQ tương tự

s* Phản ứng với dd gelatin 1%: Thém 5 giot dd gelatin 1%

QS: Không thấy xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng âm tính) Phản ứng

được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

s* Nhận xét: Trong bột Câu kỷ tử không có tanin Vì phản ứng với gelatin

1% là phản ứng đặc trưng để nhận biết tanin

A.8 Định tính acid hữu cơ

s* Phản ứng với bột Na;CO3: Cho vào 1 ống nghiệm nhỏ 3ml DCN, thêm

vào | it tinh thể NaạCO;

QS: Thấy có bọt khí bay lên (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp

lại 3 lần, KQ tương tự

s* Nhận xé(: Trong bột Câu kỷ tử có acid hữu cơ

Trang 29

A.9 Dinh tinh acid amin

% Phan tng với TT Ninhydrin 3%: Cho vào 1 ống nghiệm nhỏ 2ml DCN,

thêm 3 giọt TT Ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10”

QS: Thấy dd xuất hiện màu tím (phản ứng dương tính) Phản ứng được

lặp lại 3 lần, KQ tương tự

s* Nhận xét: Trong bột Cau ky tu co acid amin

A.10 Định tính đường khử

%* Phản ứng với TT Fehling: Cho vào 1 ống nghiệm 2ml DCN, thêm 0.5ml

TT Fefling A va 0.5 ml TT Fehling B Dun cach thủy 5`

QS: Thay xuất hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính) Phản ứng được

lặp lại 3 lần, KQ tương tự

s* Nhận xét: Trong bột Câu kỷ tử có đường khử

A.11 Dinh tinh chat béo

s* Vết mờ trên giấy lọc: Lẫy 10g bột dược liệu vào bình nón có dung tích

100ml, dé ether dau hỏa ngập dược liệu, ngâm qua đêm, lọc lay dich loc

làm phản ứng Nhỏ vài giọt dịch chiết lên miếng giấy lọc, hơ nóng nhẹ cho bay hết dung môi

QS: Thấy có vết mờ để lại trên giấy lọc (phản ứng dương tính) Phản

ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

% Nhận xét: Trong bột Câu kỷ tử có chất béo

A.12 Dinh tinh sterol

“+ Phan ứng Liebermann: Cho vào 1 ống nghiệm 2 ml De ether dau héa, bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn, thêm Iml anhydric, lac déu dé hoa

tan hết cắn Đặt ống nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ từng giọt H;ạSO¿

đặc theo thành ống nghiệm

Chú ý: tránh xáo trộn dd trong ống nghiệm

Trang 30

QS: Thấy mặt phân cách giữa 2 chất lỏng có màu xanh lá (phản ứng

dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự s* Nhận xéí: Trong bột Câu kỷ tử có sterol

A.13 Dinh tinh caroten

s* Phản ứng với H;SO,: Cho vào 1 ống nghiệm nhỏ 2ml DC ether dầu hỏa, bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn, thêm vài giọt HạSO¿ đặc vào cắn QS: Thấy dd chuyển sang màu xanh dương đậm (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự

s* Nhận xét: Trong bột Câu kỷ tử có chứa caroten

A.14 Định tính polysaccharid

%% Phản ứng với TT Lugoi: Cho vào 2 ống nghiệm:

> Ông 1: Iml dịch chiết nước > ng 2: Iml nước cất

Cho vào mỗi ống 3 giọt TT Lugol

QS: Thay dd trong ống 1 có màu đậm hơn màu của đd trong ống 2 (phản ứng dương tính) Phản ứng được lặp lại 3 lần, KQ tương tự s* Nhận xéí: Trong bột Câu kỷ tử có chứa polysaccharid

Trang 31

Pư với kiêm +++ Pư với DD NH; e+ Pu Liebermann ++ =a Không 3 Glycosid tim | Pu Baljet - 5 C Pư Legal -

Hién tugng tao bot _ Pư sơ bộ phân biệt saponin Có

steroid & saponin triterpenoid 4 | Saponin ++ | saponin Cột bọt NaOH cao hơn cột bot L steroid HCI Pư Liebermann- Buchardat + Không 5_ | Anthranoid Pư Borntrager = Pư mở, đóng vòng lacton ++ 6 | Coumarin Có Pư với TT Diazo ++ Phản ứng với dd FeC]; 5 % + Phản ứng với dd Không 7 |Tanin +1” Pb(CH:COO);10% co

Phan tng voi dd gelatin 1% -

8 | Acid hitu co Pu voi bét Na,CO,; +++|Có

9 | Acid amin Phan tmg voi TT Ninhydrin3% | +++ | Có

10 | Đường khử Phản ứng với TT Fehling +++| Có

11 | Chất béo Vết mờ trên giấy lọc ++ |Có

12 |Steroid Phản ứng Liebermann ++ |Có 13 | Caroten Phản ứng với HạSO¿ +++|Có

Trang 32

14 Polysaccharid Phản ứng với TY Lugol Có s* Chu thích: > (-) : Pư âm tính (không có Pư) > (+) : Pư dương tính > (++) : Pư dương tính rõ > (+++) : Pư dương tính rất rõ

% Nhận xéí: Trong bột Câu kỷ tử có alcaloid, flavonoid, saponin,

coumarin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử, chất béo, sterol, caroten

& polysaccharid

B Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cắn các phân đoạn

Tiến hành định tính các nhóm chất hữu cơ trong các căn A, B, C, D tuong tự như các nhóm chất hữu cơ trong bột dược liệu KQ được trình bày tóm tắt trong bảng 3, 4, 5 Bảng 3 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cắn A & B STT | Nhóm chất Phản ứng định tính Căn A | Căn B

Pư với TT Mayer + ++

Trang 33

Hiện tượng tạo bọt - ++

š | sanh Pư sơ bộ phân biệt saponin steroid _ & saponin triterpenoid oid Pu Liebermann- Buchardat - +

5 | Anthranoid | Pu Boorntrger + -

5 Ì Cusmên Pư mở, đóng vòng lacton - ~

Pư với TT Diazo - -

Phan tmg voi dd FeCl; 5% - -

7 | Tanin Phan tmg voi dd Pb(CH;COO),10% - -

Phản ứng voi dd gelatin 1% - -

Acid httuco | Pư với bột Na;COa + +

9 | Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% -

I0 |Đường khử | Phản ứng với TT Fehling - +++ 11 | Chat béo Vết mờ trên giây lọc + +

12 | Steroid Phan tmg Liebermann + +++

13 | Caroten Phản ứng với HạSO¿ - -

14 | Polysaccharid | Phản ứng với TT Lugol - +

«,

s* Nhận xét:

> Cắn A có chứa: Alcaloid, acid hữu cơ, sterol & chất béo Trong đó,

alcaloid 14 cho phản ứng rõ nhất, có thể trong phân đoạn này chứa

nhiều alcaloid

> Cắn B có chứa: Alcaloid, flavonoid, saponin, acid hữu cơ, đường khử, sterol & polysaccharid Trong phân đoạn này, phản ứng của alcaloid

& flavonoid cũng rất rõ

Bảng 4 Định tính các nhóm chất trong cắn C & cắn D

Trang 34

STT |Nhóm chất | Phản ứng định tính Cắn C | Cắn D

Pư với TT Mayer +++ +

1 ÌAleatoid Pư với TT Bouchardat +++] ++ Pu voi TT Dragendoff +++ + Pu Cyanidin +++ + Pu véi FeCl; 5% +++ + 2 | Flavonoid Pư với kiêm + + +, € Pu véi DD NH; +4 + Pu Liebermann ++ 5 3 | Glycosid tim | Pu Baljet - - Pư Legal ‘ ¬

Hiện tượng tạo bọt - ++

i | Seponie Pu so b6 phan biét saponin steroid & saponin triterpenoid Pu Liebermann- Buchardat 5 | Anthranoid | Pư Boomtrger - - 7 Pư mở, đóng vòng lacton ++ = Pư với TT Diazo ++ š Phản ứng voi dd FeCl; 5% ++ ˆ 7 | Tanin Phản ứng với dd Pb(CHạCOO);10% | ++ ; Phản ứng với dd gelatin 1% - -

Acid hituco’ | Pư với bột Na;ạCO; +++| ++ 9 | Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3%

I0 | Đường khử | Phản ứng với TT Fehling ++++++

11 | Chất béo Vết mờ trên giây lọc - a

12 | Steroid Phan tmng Liebermann +++ 1

Trang 35

I3 | Caroten Phản ứng với H;ạSO¿ - -

14 | Polysaccharid | Phản ứng với TT Lugol + + s%* Nhận xét:

> Trong cắn C có chứa: Alcaloid, flavonoid, coumarin, acid httu co,

đường khử, sterol & polysaccharid Trong phân đoạn này, phản ứng của alcaloid & flavonoid là rõ nhất Và đây cũng là phân đoạn cho các

phản ứng định tính rõ nhất trong các phân đoạn

»> Trong cắn D có chứa: Alcaloid, flavonoid, acid hữu cơ, đường khử,

polysaccharid

Bảng 5 Tóm tắt các nhóm chất hữu cơ trong 4 cắn

STT | Căn - phân đoạn | Các nhóm chất

l A: n-hexan Alcaloid, acid hitu co, sterol & chat béo

2 B: CHCl, Alcaloid, flavonoid, saponin, acid hữu cơ, đường khử, sterol & polysaccharid

3 C: EtOAc Alcaloid, flavonoid, coumarin, acid hitu co,

đường khử, sterol & polysaccharid

4 D: n - BuOH Alcaloid, flavonoid, acid hitu cơ, đường khử,

polysaccharid

2.2.2.3 Định tính một số nhóm chất trong cắn C bằng SKLM

Qua kết quả định tính trong ống nghiệm, cắn C cho phản ứng với một số nhóm chất tương đối rõ Vì vậy chúng tôi tập trung vào nghiên cứu cắn này

& khảo sát theo hướng nhóm chất alcaloid & flavonoid

A Định tính cắn C theo hướng alcaloid

“+ Chuan bj dich cham sắc kí: Lấy khoảng 1g cắn C hòa tan trong 2ml

MeOH, loc qua bong, lay dich cham sac kí

Trang 36

“+ Chuan bị bản mỏng chấm sac ki: Ban mong silicagen GF 254 (Merck)

đã được tráng sẵn, hoạt hóa bản mỏng ở 110°C/ 60°, để nguội, bảo quản trong bình hút âm Cham dịch chiết lên bản mỏng với một lượng nhất định, để bay hết dung môi, tiến hành chạy sắc kí

s* Dung môi khai triển: Khảo sát trên một số hệ dung môi, chọn hệ tách tốt

hon ca dé ghi lại kết quả

> Al: CHCl; : MeOH (9:1)

A2: CHCl; : MeOH : dd NH; dac (20 : 3.5: 0.5) A3: CHC];: aceton : dd NHạ đặc (Š: 4 : 0.5 ) A4: n- BuOH : CH:COOH : H;ạO (14:2: 1) AS: Toluen :EtOAc: aceton: HCOOH (5: 2:2: 1)

A6: Toluen : aceton : EtOH : dd NH; dac (4: 5 : 0.6 : 0.4) A7: Toluen : aceton: MeOH : dd NH; dace (10: 10: 1.5: 1) A8: Toluen : EtOAc : HCOOH : H,0 (6 :5 :1.5 : 1)

A9: CHCl;: EtOAc : HCOOH (5:5:1) > Al10: EtOAc : CHCl; : HCOOH (4: 1 : 1)

s* Triển khai dung môi chạy từ dưới lên, sau khi chạy sắc kí xong, để bản Y Y Y Y Y YV YV Y

mỏng khô, đem soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng (bs) 366nm, thấy hệ A7 có khả năng tách được nhiều vết & rõ hơn so với các hệ còn lại Kết quả

được tóm tắt ở bảng 6 & hình 9

Bảng 6 Định tính cắn C theo hướng alcaloid bằng SKLM

Trang 37

Vết sô | Màu Độ đậm | Rfx 100 l Xanh lo + 12 2 Xanh lo + 21 3 Xanh lo * 26 4 Xanh tim nhat | + 32 5 Vang nhat + 36 6 Vang +++ | 43 7 Xanh lơ +++ |57 § Xanh tím ++ 66 9 Xanh nhat ++ 81 H9.SKD cua cắn C 6 bs 366nm

B Dinh tinh can C theo hwéng flavonid

“+ Chuan bi dich cham sắc kí & bản mỏng như mục định tính theo hướng alcaloid “+ Hé dung môi khai triển: > FI: F2: H3: F4: FS: F6: HT: F8: F9: F10: CHC]: : Aceton : HCOOH (10 : 2.2 : 1.1) F11: CHCI; : Ether đầu hỏa (8 : 2) F12: CH;COOH : H,0 (15 : 85) Y Y Y YÝ Y Y Y Y Y Y OF

EtOAc : EtOH : H;O (10: 2: 1 ) EtOAc : HCOOH : CHCI; (2:1 :2)

Ether dau héa : etOH : HCOOH (16 : 7 : 2)

CHC]; : meOH : aceton (5: 5 : 2) CHC]; : meOH (19 : 1)

Ether dầu hỏa : EtOAc (1:1)

EtOAc : HCOOH : H2,0 (8: 1: 1) Toluen : EtOAc : HCOOH (5: 4 :1)

Toluen : EtOAc : Aceton : HCOOH (5 : 2:2: 1)

Trang 38

s* Sau khi chạy sắc kí xong , để bản mỏng khô, đem soi dưới đèn tử ngoại ở

bước sóng 254 nm và 366nm, thấy hệ F9 tách được nhiều vết rõ nhất Kết quả được tóm tắt ở hình 10, hình 11 & bảng 7

H10.SKĐ của cắn C (36ónm) HI1 SKĐ của cắn C (254nm)

Bang 7 Định tính cắn C theo hướng flavonoid bằng SKLM Vet| Rfx 100 Độ | Rfx 100 Độ số | (2=366nm) a đậm | (A=254nm) lu đậm

l 10 Xanh lơ + 13 Nâu đậm ++

2 31 Xanh tim + 31 Nau dam | ++

3 38 Xanh lo qt 45 Nau dam | ++

4 45 Xanh tim ++v a2 Nâu đậm | +++

5 56 Xanh tim + 63 Nau dam | ++

6 63 Xanh lo +

Trang 39

2.2.3 NGHIÊN CỨU VÈẺ TÁC DỤNG SINH HỌC s* Äẫu nghiên cứu: Cắn của các phân đoạn A, B, C, D

s* Chuột nhắt trắng sau khi nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm chọn ngẫu nhiên 8 con làm lô trắng (chứng sinh lý) Số còn lại tiêm màng

bụng STZ một liều duy nhất là 150mg/kg pha trong dung môi citrat (pH: 4,5-5) Định lượng glucose huyết sau khi tiêm 72 giờ, chọn những con có glucose huyết > 10mmol/I để thử thuốc

> Mau dem định lượng glucose huyết là máu tĩnh mạch toàn phần được

lấy từ đuôi chuột (bỏ đi giọt máu đầu tiên)

> Chia chuột có glucose huyết > 10mmol/1 thành các lô:

“_ Lô l: Chứng trắng (chứng sinh lý)

"_ Lô 2: Chứng SŠTZ (chứng bệnh lý)

"_ Lô 3: Cho dùng cao lỏng cắn dịch chiết A = L6 4: Cho ding cao long can dich chiết B “ Lô 5: Cho dùng cao lỏng cắn dịch chiết C

= L6 6: Cho ding cao long can dich chiét D >» Trong dé:

“Lô chứng trắng: Cho uống nước

“ Các lô thử thuốc: Cho chuột uống thuốc thử với liều tương đương

30g dược liệu/kg trong 5 ngày, tại ngày thứ 5 định lugng glucose huyết trước khi uống thuốc và sau khi uống thuốc thử 4 giờ Kết quả được trình bày ở bảng 8

Trang 40

Bảng 8 Sự biến đỗi glucose huyết theo thời gian trên chuột thí nghiệm Nong d6 GH trung binh (mmol/l) M+ SE STT Tén 16 0h 4h 1 Chứng trăng 6.588 + 0.294 6.475 + 0.545 (n=8) P= 0.794* Chứng STZ 16.433 + 2.268 2 18.283 + 3.165 (n=6) P = 0.630* DC n-hexan 14.167 + 2.449 3 14.250 + 2.602 (n= 7) P =0.939* DC CHCl; 17.714 + 2.043 4 19.357 + 1.612 (n=7) P=0.434* DC EtOAc 12.037 + 2.035 5 15.857 + 1.880 (n= 14) P =0.000927* DC n-BuOH 16.786 + 2.747 6 17.571 + 2.392 (n=7) P=0.492* s* Chú thích: (*): So với thời điểm 0h s* Nhận xét: > Ở lô chứng bệnh lý cũng giảm glucose huyết nhưng không có ý nghĩa thống kê (P > 0.05)

> Lô uống cắn dịch chiết C làm hạ glucose huyết có ý nghĩa thống kê

(P <0.05) với tỷ 18 ha glucose huyét la 24.09 %

> Các lô uống cắn dịch chiết A, cắn dịch chiết B và cắn dịch chiết D sau 4h làm hạ glucose huyết không có ý nghĩa thống kê (P > 0.05) so với trước khi đùng thuốc