Nghiên cứu ảnh hưởng của chế biến đến thành phần hóa học chính và một số tác dụng sinh học của vị thuốc hoàng cầm (radix scutellariae)

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO • • BỘ Y TÉ • • TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • • • • NGUYỄN PHƯƠNG NHỊ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CÙA CHẾ BIế N ĐẾN THÀNH PHầ N HÓA HỌC ■ CHÍNH VÀ MỘT ■ Số TÁC DỤNG ■ SINH HỌC CỦA VỊ■ THUỐC HOÀNG Cầ M ■ (Radix Scutellariae) LUẬN VĂN THẠC s ĩ DƯỢC HỌC • • • • Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền %1 ” • • • • % } Mã số: 60.73.10 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS.Phạm Xuân Sinh TS.Nguyễn Mạnh HÀ NỘI - 2008 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: GS.TS Phạm Xuân Sinh, TS Nguyễn Mạnh Tuyển - Bộ môn Dược học cổ truyền-Trường Đại học Dược Hà Nội, trực tiếp hướng dẫn tơi tận tình, tạo điều kiện thuận lợi bảo cho kiến thức q báu q trình thực luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn TS.VŨ Thị Trâm - Trưởng Bộ môn Dược lý, PGS.TS Cao Văn Thu-Trưởng Bộ môn Vi sinh, PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu - Trưởng Bộ mơn Hóa phân tích Trường Đại học Dược Hà nội, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình thực nghiệm mơn để hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học, Phòng Thí nghiệm Trung tâm thầy cô giáo, anh chị em kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập hồn thiện đề tài Tơi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, Tháng 12-2008 Dược sĩ Nguyễn Phương Nhị LỜI CẢM ƠN CÁC CHỮ VIế T TẮT VÀ KÝ HIỆU MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN Đề 01 Chương - Tổ NG QUAN 02 1.1 Mục đích chế biến cổ truyền 02 1.2 Các phương pháp chế biến cổ truyền 02 1.2.1 Phương pháp hỏa chế 02 1.2.2 Phương pháp thủy c h ế 04 1.2.3 Phương pháp thủy hỏa hợp chế 05 1.3.Ảnh hưởng nhiệt độ đến màu sắc TPHH vị thuốc 06 1.4.Ảnh hưởng nhiệt độ phụ liệu đến tác dụng sinhhọc vị thuốc .07 1.5 Vị thuốc Hoàng cầm 07 1.5.1 Đặc điểm thực vật, phân bố thu h i 07 1.5.2 Đặc điểm Dược liệu 1 1.5.3 Đặc điểm bột Hoàng cầm 11 1.5.4 Thành phần hóa học 11 1.5.5 Chế biến Hoàng cầm 14 1.5.6 Tác dụng sinh học 14 1.5.7 Công dụng, liều dùng 15 1.5.8 Một số phương thuốc có Hồng cầm 15 Chương 2:Đố I TƯỢNG-PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2 Phương tiện nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên u 18 2.3.1 Xác định tính vị Hồng cầm 18 2.3.2 Chế biến vị thuốc theo số phương pháp cổ truyền 19 2.3.3 Nghiên cứu hóa học số mẫu Hoàng cầm sống chế 19 2.3.3.1 Định tính flavonoid 19 2.3.3.2 Định lượng flavonoid 19 2.3.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học Hoàng cầm 20 2.3.4.1 Tác dụng giảm ho Hoàng cầm sống HC vàng 20 2.3.4.2 Tác dụng giảm thời gian máu chảy, máu đông HCS, HCV HCĐ 20 2.3.4.3 Tác dụng kháng khuẩn HC sống mẫu chế 22 2.3.4.4 Tác dụng kháng nấm HC sống mẫu c h ế 22 2.3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 23 Chương 3- THựC NGHIỆM VÀ KẾT Q U Ả 24 3.1 Nghiên cứu tính dược liệu Hoàng cầm 24 3.2 Chế biến vị thuốc Hoàng cầm 26 3.3 Nghiên cứu hóa học HC sống chế 29 3.3.1 Định tính flavonoid 29 3.3.1.1 Chiết xuất 29 3.3.1.2 Định tính phản ứng hóa học 30 3.3.1.3 Định tính bàng SKLM 31 3.3.2.Chiết xuất, phân lập, nhận dạng số thành phần flavonoid HC sống 36 3.3.2.1 Dung môi Ethanol 36 3.3.2.2 Dung môi nước 38 3.3.2.3 Nhận dạng LI L 40 3.3.2.4 Ảnh hưởng chế biến đến số chất H C 42 3.3.3 Định lượng flavonoid .45 3.3.3.1 Chiết xuất 45 3.3.3.2 Xác định độ ẩm mẫu Hoàng c ầ m 48 3.3.3.3 Định lượng flavonoid mẫu sống chế 49 3.4 Nghiên cứu số tác dụng sinh học Hoàng cầm 50 3.4.1 Chuẩn bị chế phẩm th 50 3.4.2 Tác dụng giảm ho HCS H C S 50 3.4.3 Tác dụng giảm thời gian máu chảy, máu đông HCS, HCV, H C Đ 52 3.4.3.1 Tác dụng giảm thời gian máu đông 52 3.4.3.2 Tác dụng giảm thời gian máu chảy 55 3.4.4 Tác dụng kháng khuẩn HC sốne chế 57 3.4.5 Tác dụng kháng vi nấm HC sống chế 64 3.5 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho Hoàng cầm chế .68 3.5.1 Dược liệu 68 3.5.2 Phương pháp chế biến 68 3.5.3 Tiêu chuẩn vị thuốc 68 3.5.3.1 Cảm quan 68 3.5.3.2 Kiểm nghiệm 68 3.5.4 Công chủ t r ị 69 3.5.5 Bảo quản 69 Chương 4: BÀN LUẬN 70 4.1 Dược liệu Hoàng cầm 70 4.2 Chế biến Hoàng cầm 70 4.3 Tác dụng sinh h ọc 71 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 72 5.1 Kết luận 72 5.1.1.v ề Dược liệu .72 5.1.2 v ề chế biến 72 5.1.3 v ề thành phần hóa học 72 5.1.4 v ề tác dụng sinh học 72 5.2 Đe xuất 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CHỮ VIÉT TẮT VÀ KÝ HIỆU Chữ viết tắt Dd dung dịch DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt nam Dm dung mơi HC Hồng cầm HCĐ Hồng cầm đen HCG Hồng cầm chích gừng HCM Hồng cầm chích mật ong HCR Hồng cầm chích rượu HCS Hồng cầm phiến (HC sống) HCV Hoàng cầm vàng HCX Hoàng cầm chuyển màu xanh vàng IR Hồng ngoại KS Kháng sinh MS Khối phổ SKLM Sắc ký lớp mỏng TB Trung bình Tđ tuyệt đối TPHH Thành phần hóa học TT Thuốc thử Tt Thể trọng uv Tử ngoại VK Vi khuẩn WHO World health organization YHCT Y học cổ truyền Bảng Nội dung Trang Bảng 3.1 Hiệu suất chế biến Hồng cầm 29 Bảng 3.2 Ket định tính flavonoid 30 Bảng 3.3 Kết SKLM flavonoid HC với hệ dm 33 Bảng 3.4 Kết SKLM flavonoid HC với hệ dm 35 Bảng 3.5 Hàm ẩm bột HC sống chế 48 Bảng 3.6 Ket định lượng flavonoid tính theo baicalin HC sống chế Bảng 3.7 Kết tác dụng giảm ho HCS, HCV Bảng 3.8 Ket tác dụng giảm thời gian máu đông HCS, HCV HCĐ Bảng 3.9 Ket tác dụng giảm thời gian máu chảy HCS, HCV HCĐ 49 51 53 56 Bảng 3.10 Ket tác dụng kháng khuẩn mẫu nghiên cứu 61 Bảng 3.11 Ket tác dụng kháng nấm mẫu nghiên cứu 67 Hình Nội dung Trang Hình 1.1 Một số lồi Hồng cầm Hình 1.2 Cây hoa rễ HC 10 Hình 3.1 Rễ HC 24 Hình 3.2 Đặc điểm bột rễ HC 25 Hình 3.3 Các mẫu HC nghiên cứu 28 Hình 3.4a,3.4b Sắc ký đồ flavonoid hệ dm 31 Hình 3.5a,3.5b Sắc ký đồ ílavonoid hệ dm 34 Hình 3.6 Sơ đồ chiết xuất, phân lập LI 37 Hình 3.7a, 3.7b SKLM hai chiều LI 38 Hình 3.8 Sơ đồ chiết xuất, phân lập L2 39 Hình 3.9a, 3.9b SKLM hai chiều L2 40 Hình 3.10 Tinh thể LI 41 Hình 3.1 la, 3.11b SKLM so sánh L1 với mẫu nghiên cứu 43 Hình 3.12a, 3.12b SKLM so sánh L2 với mẫu nghiên cứu 44 Hình 3.13 Sơ đồ chiết xuất flavonoid Hồng cầm 47 Hình 3.14 Biểu đồ hàm lượng flavonoid mẫu nghiên cứu 49 Hình 3.15 Biểu đồ số tiếng ho chuột 51 Hình 3.16 Biểu đồ tỉ lệ giảm thời gian máu đông lơ thử 54 Hình 3.17 Biểu đồ tỉ lệ giảm thời gian máu chảy lô thử 57 Hình 3.18 Sơ đặt mẫu nghiên cứu thử tác dụng kháng khuẩn 60 Hình 3.19 Vòng vơ khuẩn Gen mẫu thử VK Gr(-) 62 Hình 3.20 Vòng vơ khuẩn Pen mẫu thử VK Gr(+) 63 Hình 3.21 Sơ đồ đặt mẫu nghiên cứu thử tác dụng kháng vi nấm 66 Hình 3.22 'Vòng vơ nấm mẫu thử 67 ĐẶT VẤN ĐÈ Từ lâu nhân dân ta có nhiều kinh nghiệm sử dụng cỏ thiên nhiên để phục vụ sống cách hữu ích, đặc biệt việc phòng chữa bệnh Ngày nay, để kinh nghiệm chứng minh cách khoa học, việc nghiên cứu đầy đủ, chi tiết theo phương pháp khoa học điều cần thiết Theo lý luận y học cổ truyền, vị thuốc trước dùng cần chế biến phương pháp khác Mỗi phương pháp chế biến đáp ứng số mục đích định, làm tăng tác dụng chữa bệnh, có làm giảm độc tính hay thay đổi tính vị quy kinh, tránh mùi vị khó chịu, có tác dụng bảo quản vị thuốc Do chế biến thuốc theo y học cổ truyền việc làm quan trọng Hoàng cầm vị thuốc đông y sử dụng từ lâu để chữa bệnh: sốt cao, viêm phổi, viêm phế quản, ho, ngực tức, buồn nôn, kiết lỵ, tiêu chảy, động thai, chảy máu cam Để góp phần chứng minh cho tác dụng chữa bệnh nói trên, đồng thời góp phần vào việc xây dựng quy trình chế biến thuốc cổ truyền Bộ Y tế, tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu ảnh hưởng chế biến đến thành phần hóa học số tácdụng sinh học vị thuốc Hoàng cầm Radix Scutellariae'1' với mục tiêu: Khảo sát thay đổi thành phần hoá học, số tác dụng sinh học Hoàng cầm qua việc chế biến theo phương pháp khác góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho Hồng cầm chế Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Xác định tính vị thuốc Hồng cầm Radix Scutellariae - Tiến hành chế biến vị thuốc Hoàng cầm theo số phương pháp cổ truyền - Định tính, định lượng ílavonoid Hoàng cầm sống chế - Nghiên cứu số tác dụng sinh học Hoàng cầm - Góp phần xây dựng tiêu chuẩn sở cho vị Hồng cầm chế C hưong1 TỒNG QUAN 1.1 MỤC ĐÍCH CỦA CHÉ BIỂN CỎ TRUYỀN Chế biến thuốc cổ truyền sử dụng phương pháp tổng họp để làm biến đổi trạng thái thuốc từ trạng thái tự nhiên ban đầu thành vị thuốc sử dụng cho việc phòng chữa bệnh Hay nói cách khác, chế biến để chuyển vị thuốc từ vị thuốc sống trở thành thuốc chín Chế biến để làm cho thuốc có biến đổi, thay đổi định hình dáng màu sắc, mùi vị, thành phần hố học, cơng chủ trị, nhằm mục đích tăng hiệu lực trị bệnh tăng độ an toàn vị thuốc người dùng [2], [15], [22],[23], Chế biến thuốc cổ truyền nhằm mục đích sau: + Làm vị thuốc + Làm thay đổi tính, vị thuốc từ tạo tác dụng điều trị + Giảm độc tính thuốc, giảm tác dụng khơng mong muốn + Ổn định thành phần hố học, góp phần bảo quản thuốc tốt + Tăng hiệu lực trị bệnh + Thay đổi mặt hoá học vị thuốc dẫn đến thay đổi tác dụng vị thuốc + Giảm tính bền vững học, tăng khả giải phóng dược chất làm tăng hiệu lực thuốc trực tiếp hay gián tiếp qua phụ liệu trung gian nhiệt độ mức độ khác [2],[3],[4] 1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÉ BIÉN CỎ TRUYÈN [2],[3],[4],[22] Trong phần giới thiệu số phương pháp chế biến liên quan đến đề tài 1.2.1 Phương pháp hoả chế Là phương pháp chế biến sử dụng tác động nhiệt độ trực tiếp PHỤ LỤC 345 q 200.0 220.0 240.0 260.0 280.0 300.0 320.0 340.0 360.0 380.0 400.0 420.0 440.0 460.0 480.0 500.0 Mau L1 nm Phổ u v LI ,lim X m lù í ế mụ *** VẾ —ỉ í m, css aer«*5~ nI ịMj I i _ -J _ m m Phố IR LI m B■**m t ■■■ im? - !2&r.? VMA m3- File O perator A cquired Instrum ent S a m p l e Name M isc In fo Vial Number C:\HPCHEM\1\DATA\D-DIP472.D phong khoi 25 J u n 108 10:29 9 B MS LX - N h i DHDu oc am u s i n g A c q M e t h o d N - D I P Phổ khối LI L ib ry Searched Q uality ID : D: \ DATABASE\ 8XLEY275 L : 93 : Wogonin S c a n 89 (4 mixi) : D - Đ I P Đ L I - N h i DHDuoc abund m/z abund m/z 1813 2844 61.20 50.10 62 1151 51.20 5393 1677 63.10 1965 52 64.20 797 53.10 4238 1483 54.20 3620 65.10 1634 15248 66.20 55.20 67.20 6359 4436 56.20 13913 68,20 3098 57.20 25344 58.20 1531 69.10 4329 70.20 59.20 58 7071 71.20 60.20 4660 S c a n (4 ỐS6 m i n ) : D - D I P D L I - N h i DHDuoc m/z 72.20 73.10 7- 10 75.10 76.10 77.10 78.10 79.20 80.20 81.20 82.10 abund 651 3981 1771 2073 3186 6050 1013 1945 1112 4838 3800 m/z 83.20 84.20 85.20 86.20 87.10 88.10 89.10 90.10 91.10 92.20 92 abund 7555 3587 4090 527 1931 40 52 37 1385 335 91 m/z abund m /2 abund 583 3541 104.15 93.10 2320 105.05 94.20 1392 494 3867 106.05 95.20 927 107.15 3375 96.20 77 108.05 SS7 97.20 1861 2857 109.15 98.20 61 1616 110.05 99.20 8180 614 111.05 100.05 1334 112.05 1742 1 IS 1445 113.05 5097 102.05 872 114.15 5848 OS S c a n Í , SS6 m i n ) : D - D I P Đ L I - H h i DHDuoc m/z 115.05 116.05 117.05 118.05 1X9.15 120.05 121.15 122.15 123.15 124.15 125.15 abund 2402 805 358 244 34 444 1438 873 1630 1091 1851 m/z 05 127 15 128,15 129.05 130.05 131.05 131.95 133.15 134.05 135.15 136.05 abund 928 1594 Ĩ336 2744 486 89 155 298 557 1277 730 m/ z abund abund m/z 331 1131 148.15 137.15 1139 149.05 1044 138.15 42 27040 150.15 139.05 859 151.05 2360 140.05 889 152.15 923 141.05 2539 858 153.05 142.05 413 154.15 60 143.05 591 271 155.15 144.15 191 156.25 550 145.05 987 157.15 14 146.15 92 158.15 641 147.15 S c a n