Luận văn sư phạm Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter Xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng của etanol, axit axetic, ( NH4)2SO4, pH, ứng dụng làm thạch dừa

Khoá luận tốt nghiệp TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA : SINH HỌC NGUYỄN THỊ QUANG – K29A “TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM CHO MÀNG DÀY, NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ETANOL, AXIT AXETIC, (NH4)2SO4, pH,ỨNG DỤNG LÀM THẠCH DỪA ” KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Vi sinh vật Người hướng dẫn : Thạc sĩ: Nguyễn Khắc Thanh Hà Nội: 2007 Nguyễn Thị Quang K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để có thành cơng đề tài khoá luận, em nhận giúp đỡ tâm huyết tận tình thầy môn Vi Sinh tổ thực vật, đặc biệt giúp đỡ thầy Nguyễn Khắc Thanh cô Đinh thị Kim Nhung bạn sinh viên, ý kiến đóng góp bạn nhóm vi sinh Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành sâu sắc giúp đỡ quý báu thầy cơ, bạn nhóm vi sinh người trực tiếp hướng dẫn em thầy Nguyễn Khắc Thanh Hà Nội, tháng 05 năm 2007 Sinh viên: Nguyễn thị Quang Nguyễn Thị Quang K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Khoá luận tốt nghiệp hoàn thành hướng dẫn tận tình thạc sĩ Nguyễn Khắc Thanh Em xin cam đoan rằng: Đây kết nghiên cứu riêng em Kết không trùng với kết tác giả cơng bố Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Sinh viên: Nguyễn Thị Quang Nguyễn Thị Quang K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp TĨM TẮT CƠNG TRÌNH Thạch dừa sản phẩm tạo thành q trình ni cấy vi sinh Acetobacter xylinum mơi trường nước dừa chuyển hố thành Hemixenluoza, qua chế biến xử lý với số nguyên liệu thành thạch dừa Đây ăn cổ truyền số nước Đông Nam Á: Philipin, Malaixia Việt Nam xứ sở dừa Bên cạnh ăn chế biến từ dừa cơm dừa, kẹo dừa, bánh đa Thì thạch dừa nhiều người ưa thích Thạch dừa với thành phần Hemixenluloza, có tác dụng giúp cho q trình tiêu hố tốt hơn, dưỡng da, chống lão hố, giảm cholesterol máu phòng ngừa số bệnh ung thư Ở nước ta, việc nghiên cứu ứng dụng vi khuẩnAcetobacter xylinum sản xuất thạch dừa ít, xuất hịên vài sở sản xuất thạch dừa (Thành phố Hồ Chí Minh) sản lượng nhu cầu sử dụng thạch dừa ngày tăng, nguồn nguyên liệu lại dồi Đứng trước nhu cầu tiềm việc nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum đến việc ứng dụng tạo nguồn thức ăn từ nguyên liệu sẵn có việc làm có ý nghĩa thực tiễn lý luận sâu sắc, chọn nghiên cứu đề tài:”Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH, ứng dụng làm thạch dừa” Trong đề tài này, từ nguồn nguyên liệu sẵn có nước tơi phân lập 60 mẫu, tuyển chọn 02 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày làm đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu khả tạo màng chọn hai chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum A3 A6 cho màng dày Nghiên cứu quan sát hình dạng tế bào kính hiển vi quang học Nghiên cứu động thái phát triển hai chủng Nghiên cứư ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH tới trình tạo màng hai chủng Ứng dụng hai chủng vào làm thạch dừa phạm vi phòng thí nghiệm Nguyễn Thị Quang K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp PHẦN ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Lý chọn đề tài Cũng linh vực khoa học khác, công nghệ vi sinh mà tiền thân cơng nghệ lên men cổ trải qua chặng đường phát triển đầy khó khăn, phức tạp Đã từ lâu người biết ứng dụng trình lên men sản xuất vào đời sống như: Làm tương, muối dưa, làm bánh mì, sản xuất bia rượu mà chưa hiểu hết chất trình lên men Cho đến gần thị trường xuất loại thực phẩm thạch dừa Đây loại thực phẩm nhiều người ưu thích bổ dưỡng: Giúp cho q trình tiêu hố tốt hơn, dưỡng da, giảm cholesterol máu, chống lão hoá, ngăn ngừa số bệnh ung thư…Tuy nhiên nước vài sở sản xuất, nhu cầu sử dụng thạch dừa ngày cao, nguồn nguyên liệu thô để sản xuất lại dồi khố để bảo quản nước dừa Đứng trước tiềm nhu cầu chọn tiến hành nghiên cứu đề tài: :”Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH, ứng dụng làm thạch dừa” 1.2.Mục tiêu đề tài Từ nguồn nguyên liệu: Bia, rượu vang, hoa quả, giấm tiến hành phân lập tuyển chọn chủng cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố tới trình lên men 1.3.Nhiệm vụ Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày, từ chọn hai chủng cho màng dày làm đối tượng nghiên cứu Tìm hàm lượng etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH thích hợp cho phát triển hai chủng Acetobacter xylinum tuyển chọn 1.4 Ý nghĩa lý luận thực tiễn đề tài Nghiên cứu nhằm sâu tìm hiểu hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hố chủng Acetobacter xylinum có khả cho màng dày Góp phần tìm hiểu q trình sản xuất thạch dừa nâng cao hiệu sản xuất Nguyễn Thị Quang K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Lược sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum (A.xylinum) 2.1.1.Lược sử nghiên cứu vi khuẩn A.xylinum Người ta thường gọi trình chuyển hố rượu thành axit axetic q trình lên men axetic, thực chất trình oxi hố, vi khuẩn gây q trình vi khuẩn axetic thuộc giống Acetobacter Trước người ứng dụng trình để làm giấm từ rượu vang hỏng cách thụ động mà chưa biết đến chế chất cuả Tuy tới năm đầu kỉ 19 người điều chế axit axetic đậm đặc, biết giấm sản phẩm lên men nhóm vi sinh vật mà ngày gọi Acetobacter hay vi khuẩn axetic Từ đến có nhiều khoa học nghiên cứu loại vi khuẩn Người nhìn thấy vi sinh vật Antoni Lơvenhuc (1632-1723) Person (1822) người nghiên cứu axit axetic từ lớp màng mỏng phát triển giấm Ơng chứng minh loại vi sinh vật có tên Mycoderma axetic Năm 1973 Kittzing nhận xét trình lên men giấm thiết phải có vi sinh vật, ơng khẳng định rõ vai trò vi sinh vật trinh lên men giấm Cùng năm đó, Hansen cung tách hai loại vi khuẩn khiết từ mangf giấm ơng gọi Mycoderma aceti Mycoderma pasteurianum Năm (1862-1868) L.pasteur người khám phá chế q trình lên men axetic, q trình oxi hố rượu etylic Ơng chứng minh đắn nhận xét Kittzing & Hansen, khẳng định chất trình lên men axetic Với việc sử dụng kính hiển vi Lơvenhuc nhận thức tồn giới vi sinh vật thực bắt đầu, nhờ Pasteur xem xét xuất màng bia rượu vang cách kỹ lưỡng Cuối ông kết luận màng tạo thành loại trực khuẩn (màng tập hợp tế bào trực khuẩn) ông gọi Mycoderma aceti Những nghiên cứu nhằm mục đích cải tiến trình lên men axetic Trên sở có nhiều quan điểm phân loại khác đời Nguyễn Thị Quang K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp 2.1.2.Phân loại vi khuẩn Acetobacter Từ trước tới có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề đáng ý khố phân loại Beijerinck Ông phân loại vi khuẩn dựa vào hai dấu hiệu Một là: Khả sử dụng đạm amoni để thực sinh trưởng phát triển Hai là: Có hay khơng có giai đoạn di động trình phát triển Năm 1962 Heneberg chia tất vi khuẩn axetic thành nhóm theo nơi sống đặc trưng chúng Nhóm 1: Vi khuẩn khơng phát triển bia hoa Hublon độc với chúng Nhóm 2: Vi khuẩn phát triển bia Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển dung dịch rượu vang Nhóm 4: Vi khuẩn để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh Năm 1934, theo nghiên cứu hội nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ, vi khuẩn axetic có khả sử dụng hợp chất tương đối đơn giản cacbon nitơ nên kết hợp vào họ Nitrobacteriaceae Từ vi khuẩn giấm giữ tên Acetobacter Năm 1848 Vanght cơng bố kết ông quan sát thấy di động nhiều loại Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans, Acetobacter malanogenum Vanght giải thích lồi loại có đơn mao cực xác nhận vị trí vi khuẩn axetic họ Pseudomonadaceae Ngày theo khoá phân loại Bergeys nhiều tác giả khác xếp vi khuẩn Acetobacter Gluconobacter vào họ Acetobacter iaceae Năm 1914 Bergeys phân loại loài giống Acetobacter thành hai loại - Loại 1: Oxi hoá axit axetic thành CO2 H2O + Loại sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ nhất, đại diện vi khuẩn Acetobacter aceti + Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ Trên bề mặt môi trường dịch thể tạo màng nhầy có chứa xenluloza, điển hình acetobacter xylinum Trên bề mặt mơi trường dịch thể khơng tạo màng nhầy chứa xenluloza, dàng điển hình Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianum Nguyễn Thị Quang K29A-Sinh Khố luận tốt nghiệp _ Loại 2: Vi khuẩn khơng oxi hố axit axetic +Tạo thành sắc tố mơi trường glucoza Sắc tố nâu tới đen nhạt : Acetobacter malanogenus Sắc tố hồng: Acetobacter zancens + Không tạo thành sắc tố Nhiệt độ thích hợp 30-350C: Acetobacter suboxydans Nhiệt độ thích hợp giưa 18-210C :Acetobacter oxydans Năm 1960 Shiwel Car nghiên cứu đặc trưng nuôi cấy sinh hoá vi khuẩn Acetobacter đưa kết luận khơng thể có đồng vi khuẩn Acetobacter Tư nghiên cứu Acetobacter người ta khơng ngừng phát huy vai trò đời sống người Nhu cầu người vè sử dụng Acetobacter ngày đa dạng chúng sử dụng nhiều cơng trình khoa học phục vụ nhu cầu hàng ngày như: lên men giấm, chế biến thức ăn, sản xuất vitaminC, B1, B2, B12, sản xuất tơ nhân tạo … 2.2 Đặc điểm chung vi khuẩn Acetobacter[2] Ngày người ta biết vi khuẩn Acetobacter tác nhân q trình lên men axetic Chúng thuộc vào giống vi khuẩn Acetobacter chu mao không bà Gluconobacter đơn mao Đây giống vi khuẩn axeticquan trọng họ Acetobaccter iaceae Chúng phổ biến trongtự nhiên, có bề mặt lá, hoa quả…chúng tạo axix axetic từ rượu etylic Trong tế bào Gluconobacter khơng có chu trình tricacboxylic hoạt động nên khơng thể oxi hố axetat có chu trình khác thay thế( chu trình glyoxylat) Khơng oxi hoá axit axetic Khi so sánh vi khuẩn với vi khuẩn thuộc giồng pseudomonas thấy có đặc điểm tương tự Chúng khác pseudomonas chỗ chịu độ axit cao hơn, khẳ chuyển hoá pepton yếu di động khơng sinh sắc tố.Nhiều loại vi khuẩn Acetobacter phát triển môi trường thiếu thức ăn môi trường nuôi cấy lâu dễ làm biến đổi hình thái thành dạng có hình thái đặc biệt Vi khuẩn Acetobacter dạng hình que, có tiêm mao, di động , khơng sinh bào tử,gram âm, hiếu khí bắt buộc Nguyễn Thị Quang K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp Trên sở dựa vào tính chất đặc trưng vi khuẩn Acetobacter mà người ta xếp chúng vào nhóm độc lập khả oxi hố rượu etylic thành axit axetic, pH=4,5 Ngồi chúng thực q trình oxi hố khơng hồn toàn hợp chất hữu khác để tạo thành hợp chất xeton, Vi khuẩn Acetobacter phát triển tốt điều kiện hiếu khí, nhiệt độ thích hợp từ25-300C, pH thích hợp 5,4-6,8 hố dị dưỡng hữu [10,15] Đặc điểm phân biệt Acetobacter Gluconobacter So sánh với Pseudomonas Đặc điểm so sánh Gluconobacter Acetobacter Pseudomonas Đơn mao cực Chu mao Chu mao Vị trí tiêm mao khơng khơng cực Phát triển pH=4.5 Oxy hoá etanol pH=4.5 Oxy hoá axit axetic Oxy hoá lactat Glucoza -> Gluconate Sử dụng tinh bột lactose Sử dụng Gelatin Sắc tố huỳnh quang + + _ + + _ _ + + _ + + + +  _ _  _ _  _ _  Về hình dạng tế bào, vi khuẩn Acetobacter trực khuẩn hình que, kích thước trung bình từ 0,6-0,8µm Các tế bào đứng tách riêng xếp thành chuỗi, loại đặc biệt có tế bào hình cầu tuỳ thuộc vào điều kiện pH môi trường ,nhiệt độ nuôi cấy [2].Vi khuẩn Acetobacter khơng có khả sinh bào tử, tạo Nguyễn Thị Quang K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp màng nhầy, số có khả di động nhờ tiêm mao,một số khơng có khả Khi nghiên cứu khuẩn lạc màng vi khuẩn Acetobacter môi trường cấy cho thấy vi khuẩn Acetobacter phát triển tốt môi trường nước bia, môi trường có chứa cao nấm men:glucoza, rượu etylic, manitol Trên mơi trường đặc chúng phát triển khuẩn lạc tròn đặn đường kính trung bình 3mm, bề mặt trơn bóng, phần khguẩn lạc lên dày sẫm phần xung quanh Một số loại có khuẩn lạc lớn(d=4-5mm) bề mặt trơn bóng khơng có màu, mỏng hạt sương nhỏ dễ dàng dùng que cấy gạt khỏi môi truường Trên môi trường lỏng vi khuẩn axetic phát triển tạo thành lớp màng Dung dịch màng suốt Khi nghiên cứu lớp màng người ta thấy có sợi xenluloza giống sọi Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn axetic nguồn cacbon, nitơ chất sinh trưởng đa dạng Chúng sử dụng đường, rượu etylic, axit hữu làm nguồn cacbon, muối amoni làm nguồn nitơ Trong trình phát triển chúng có nhu cầu số axit amin, chất kích thích sinh trưởng… Một số lồi vi khuẩn có khả tổng hợp chất cao phân tử:xenluloza, tinh bột …Con người ứng dụng điều sản xuất cơng nghiệp Vi khuẩn axetic có khả oxi hố gluxit theo hướng sau: -Hướng 1: Khơng có photphoril hoá chất với tham gia enzym đặc hiệu -Hướng 2: Oxxi hoá chất photphoril hoá đường pentozo photphat -Hướng 3: Theo sơ đồ Entenr-Doudoroff -Hướng 4: Theo chu trình Krebs Glyoxylat 2.3.Một số loại vi khuẩn Acetobacter[10,15] 2.3.1.Acetobacter xylinum Là trực khuẩn hình que (2µm), đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi, không di động tế bào bao bọc chất dầy, tạo váng nhanh dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iốt H2SO4 2.3.2 Acetobacter aceti Nguyễn Thị Quang 10 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập vi khuẩn acetic từ màng bia, chuối, giấm, nước dừa, tuyển chọn chủng vi khuẩn A xylinum Để tiến hành phân lập, trước tiên tiến hành làm dịch lên men Cho vào bình cầu bình tam giác có dung tích 500 ml khoảng 200 ml nước hoa qua giấm, thêm vào ml rượu etylic axit hố mơi trường ml axetic, có vài lát chuối tiêu chín bóc vỏ với mục đích cung cấp thêm nguồn gluxit, vitamin cho vi khuẩn axetic phát triển, đạy nút bông, cho vào tủ ấm 300C Sau 5-7 ngày bề mặt thoáng bình cầu xuất lớp màng màu trắng, màng tập hợp tế bào vi khuẩn axetic có dịch lên men từ nguồn nguyên liệu kể trên[11,12,14] Hình :Mẫu dịch lên men từ nguồn nguyên liệu giấm Nguyễn Thị Quang 22 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp Khi có dịch lên men tơi tiến hành phân lập tạo mẫu vi khuẩn Acetobacter Để phân lập vi khuẩn acetic ta dùng que cấy đũa thuỷ tinh vô trùng lấy dịch chiết lên men lấy lượng màng định cho vào nước vô trùng đánh tan Tiếp theo tiến hành pha loãng theo phương pháp pasteur độ pha loãng khác từ 10-1 -10-10 Sau gieo cấy mơi trường thạch đĩa (mt 1) hấp để khử trùng để tách khuẩn lạc riêng rẽ Sau phân lập 4-7 ngày bề mặt môi trường thạch đĩa xuất khuẩn lạc có kích thước to nhỏ khác Hầu khuản lạc có đường kính từ 0,6-2,4 mm, bề mặt trơn bóng, phần dày lên sẫm màu phần xung quanh Cũng có dạng bề mặt xù xì, nhăn nheo Hình : Khuẩn lạc vi khuẩn acetic độ pha loãng 10-8 Nguyễn Thị Quang 23 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp Sau có khuẩn lạc mơi trường thạch đĩa dùng que cấy khử trùng lửa đèn cồn gợt lấy khuẩn lạc riêng rẽ Mỗi khuẩn lạc cấy ống thạch nghiêng mẫu , mẫu mã hố kí tự riêng Sau thời gian phân lập tuyển chọn liên tục tuyển chọn 60 mẫu vi khuẩn acetic từ nguồn nguyên liệu nói Sau 3-5 ngày tế bào phát triển theo đường cấy Hình : Vi khuẩn acetic mơi trường thạch nghiêng Tiếp theo tiến hành nuôi cấy 60 mẫu vi khuẩn vào môi trường số Khi nuôi cấy 15 ngày cần kiểm tra khả oxi hoá etanol xác định xem mẫu Acetobacter hay Gluconobacter Trong 60 mẫu xác định mẫu chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum So sánh với đặc điểm vi khuẩn A.xylinum thấy vi khuẩn A.xylinum loại trực khuẩn hình que 2µm đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi, không di động, tế bào bao bọc chất nhầy tạo váng nhăn dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iot H2SO4 Nguyễn Thị Quang 24 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp Căn vào đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hố vi khuẩn A.xylinum khẳng định chủng chọn vi khuẩn A.xylinum, kí hiệu từ A1-> A6 4.2 Nghiên cứu số đặc điểm hình thái sinh lí, sinh hố vi khuẩn A xylinum Tôi dùng chủng vi khuẩn A xylinum nuôi cấy sang môi trường nước dừa( mt 4) Môi trường khử trùng 0,5 at, 30 phút để nguội, cấy giống vào Theo dõi khả tạo màng, quan sát hình dạng tế bào kính hiển vi quang học 4.2.1 Quan sát khả tạo màng chủng vi khuẩn A.xylinum Khi cấy sang mơi trường nước dừa tơi thấy chủng màng xuất ngày thứ 3, đa số xuất ngày thứ Ba ngày đầu kể từ xuất màng dày nhanh , ngày sau màng phát triển chậm lại, mơi trường cấy có đục Sau 20 ngày ni cấy kết thu bảng Bảng 1: Khả tạo màng chủng vi khuẩn A.xylinum STT Ký hiệu chủng A.xylinum A1 A.xylinum A2 A.xylinum A3 A.xylinum A4 A.xylinum A5 A.xylinum A6 Khả tạo màng Rất mỏng Mỏng + ++ + ++ - Dày +++ +++ Môi trường nuôi cấy Đục Trong + + + + + + - Ghi chú: Dấu (+): có Dấu (-): Khơng Dấu (++): Màng dày tăng dần Dấu (+++): Màng dày tăng lên nhanh[12] Kết bảng cho thấy chủng vi khuẩn A xylinum có khả tạo màng dày Kết thực nghiệm ra: Nguyễn Thị Quang 25 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp Loại : Màng mỏng(2cm) môi trường nuôi cấy đục Loại 4: Màng dày, dịch nuôi cấy Nhận xét: Hầu hết vi khuẩn A xylinum vi khuẩn hiếu khí, mơi trường lỏng chúng phát triển lớp màng dày mỏng khác bề mặt mang đặc điểm tuỳ tính chất loại Màng tập hợp vi khuẩn A xylinum Kết thí nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn A3 A6 cho màng dày 2,5 2,6 cm Vì tơi định giữ lại chủng để tiếp tục nghiên cứu Hình 4: Ảnh tạo màng dày số chủng A.xylinum Nguyễn Thị Quang 26 K29A-Sinh Khố luận tốt nghiệp 4.2.2 Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn A.xylinum kính hiển vi quang học Sau kiểm tra khả oxi hoá etanol xác định mẫu vi khuẩn A.xylinum tiến hành quan sát hình dạng tế bào chủng vi khuẩn kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần Dựa theo nguồn nguyên liệu phân lập, đặc điểm khả tạo màng, độ dày màng, hình dạng tế bào chủng tơi định giữ lại chủng A.xylinum A3 A6 có đặc tính cho màng dày Kết quan sát dẫn hình Nhận xét: Số lượng mẫu A.xylinum nhiều chọn chủng đại diện cho màng dày để làm đối tượng nghiên cứu 4.3 Nghiên cứu động thái phát triển chủng vi khuẩn A xylinum A3 A6 Tiến hành nuôi cấy chủng môi truờng số Ở môi trường thành phần dinh dưỡng tối ưu Ni cấy mơi trường nhằm mục đích xác định xem khoảng thời gian số lượng tế bào chủng vi khuẩn đạt cực đại Môi trường hấp để khử trùng ngày liên tiếp, để nguội sau cấy giống vào, bổ sung thêm rượu etylic axit axetic, để tủ ấm Nguyễn Thị Quang 27 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp Tiến hành xác định số lượng tế bào thời điểm :0, 24,48,72,96,120,144,168,192,216,240,264,288,312,336,360,384,408,432h phương pháp đếm số lượng tế bào buồng đếm hồng cầu[3, 4, 7] Số lượng tế bào x 106 Các chủng Thời gian (h) A3 A6 Kết dẫn bảng biểu đồ Bảng 2: Số lượng tế bào thời điểm chủng vi khuẩn A3 A6 Nguyễn Thị Quang 28 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 360 384 408 432 0,19  0,05 0,28  0.25 2,3  0,015 6,1  0,04 6,15  0,35 11,5  0,06 14,8  0,15 17,5  0,02 24,9  0,03 30,2  0,016 40,5  0,045 47,8  0,04 60,15  0,015 90,2  0,02 129,1  0,035 124,5  0,04 122  0,026 119,53  0,03 117,28  0,015 0,15 0,37 2,5 4,5 6,2 15,73 16,86 14,25 22,5 29,16 42,7 46,9 61,2 92,5 127,3 90,0 90,5 85,53 80,9 Biểu đồ Quá trình sinh trưởng chủng Acetobacter xylinum A3 A6 Nguyễn Thị Quang 29 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp 300 250 200 A6 150 A3 100 50 0 48 96 144 192 240 288 336 384 432 4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH tới trình tạo màng chủng Acetobacter xylinum A3 A6 4.4.1 Ảnh hưởng (NH4)2SO4 Trước tiên tiến hành nuôi cấy chủng mơi trường số 3, sau thay đổi dần yếu tố (NH4)2SO4 nồng độ khác nhau: 0, 4; 0, 5; 0, 6; 0, 7; 0, 8; 0, 9, 1,0 (%) Biểu đồ Biểu diễn độ dày chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum A3 A6 có tỷ lệ (NH4)2SO4 mức độ khác Nguyễn Thị Quang 30 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp 2.5 1.5 A3 A6 0.5 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Độ dày màng (cm) 4.4.2 nh hng etanol Sử dụng nồng độ etanol nồng độ khác nhau: ; ; ; 10 ; 12 (g/l) Kết thí nghiệm thể biểu đồ 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 A3 A6 10 12 Nång ®é etanol (g/l) Nguyễn Thị Quang 31 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp Nhận xét: Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum A3 phát triển tất nồng độ etanol pha phát triển tốt nồng độ 8(g/l) Chủng A6 phát triển tốt nồng độ etanol 4g/l 4.4.3 Ảnh hưởng axit axetic Môi trường nuôi cấy pha chế nồng độ: ; 1,5 ; ; 2,5 ; 3,0 (g/l) Qua thí nghiệm ta thu kết sau:Nhận xét: Tối thích cho A3 g/l A6 (g/l) Ở nồng độ khác lớn nhỏ màng tạo mỏng Giải thích: axit axetic xem nguồn nguyên liệu thô ban đầu, nguồn cacbon bổ sung cho phản ứng polime hoá để tạo thành xenluloza 4.4.4 Ảnh hưởng độ pH pH: 3,0 – 3,5 – 4,0 – 4,5 – 5,0 – 5,5 – 6,0 Kết thí nghiệm thể biu Độ dày màng(cm) 2.5 A3 1.5 A6 0.5 2.5 4.5 5.5 §é pH Nhận xét: Qua bảng biểu đồ ta thấy độ dày màng đạt giá trị cực đại pH = 4,5 Với chủng A.x A3 2,5cm Với chủng A.x A6 2,6cm Nguyễn Thị Quang 32 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp 4.5 Ứng dụng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum A3 A6 vào làm thạch dừa phạm vi phòng thí nghiệm Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã phân lập mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum từ nguồn nguyên liệu giấm - Nghiên cứu khả tạo màng Quan sát hình dạng tế bào - Nghiên cứu động thái phát triển - Nghiên cứu ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH tới trình tạo màng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum A3 A6 - Ứng dụng chủng vào làm thạch dừa phòng thí nghiệm Kết thu lớp màng thạch dừa với độ dày Với chủng Acetobacter xylinum A3 đạt: 2,5cm Với chủng Acetobacter xylinum A6 đạt: 2,6cm 5.2 Đề nghị Tôi hy vọng qua phát hiên nghiên cứu áp dụng vào thực tiễn Nguyễn Thị Quang 33 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Tóm tắt cộng trình Phần Đặt vấn đề Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Lược sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn Acetobacter 2.2 Đặc điểm chung vi khuẩn Acetobacter 2.3 Một số loại vi khuẩn Acetobacter 2.4 Cơ sở khoa học lên men axetic 2.5 Các điều kiên ảnh hưởng tới trình lên men axetic 2.6 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacte Phần 3.Đối tượng phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.2 Hố chất mơi trường 3.3 Phương pháp nghiên cứu Phần Kết nghiên cứu thảo luận 4.1 Phân lập vi khuẩn axetic từ màng bia, chuối, giấm, nước dừa, tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 4.2 Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá vi khuẩn Acetobacter xylinum 4.3 Nghiên cứu động thái phát triển hai chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH4)2SO4,pH tới trình tạo màng hai chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 4.5 ¦ngs dơng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum vào làm thạch dừa phạm vi phòng thí nghiệm trang 6 10 12 13 14 16 16 16 17 22 22 24 27 28 33 33 PhÇn Kết luận đề nghị Nguyn Th Quang 34 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Ngô Kế Sương (1970), Cơ sở lý luận vi sinh học, Nxb khoa học kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng số cộng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, (1, 2) Nxb khoa học kỹ thuật Nguyễn Lân Dung, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến (1979), Vi sinh vật (1) Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp, tr 87-107 Nguyễn thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật học, Nxb giáo dục Văn Thuý Hà, Đào Thị Bích Ngọc (1999), Nghiên cứu động thái phát triển số chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum, Thông báo khoa học trường ĐHSPHN 2, tr 9-12 Hữu Thị Hải, Đào Thị Bích Ngọc (1999), Nghiên cứu ảnh hưởng số nhân tố vô tới tạo màng số chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum, Thông báo khoa học Trường ĐHSPHN Nguyễn Duy Hưng (2000), Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum, ứng dụng làm thạch dừa, Cơng trình dự thi giải thưởng sinh viên nghiên cứu khoa học Đinh Thị Kim Nhung (1993), Khảo sát lên men axetic môi trường có thay đường glucoza đường malt, Thơng báo khoa học Trường ĐHSPHN 2, tr – 12 Đinh Thị Kim Nhung (1995), Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum ứng dụng làm thạch dùa, Thông báo khoa học Trường ĐHSPHN 2, tr 181 – 186 Nguyễn Thị Quang 35 K29A-Sinh Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Quang 36 K29A-Sinh ... tiễn lý luận sâu sắc, tơi chọn nghiên cứu đề tài: Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH, ứng dụng làm thạch dừa Trong... dừa ứng trước tiềm nhu cầu chọn tiến hành nghiên cứu đề tài: : Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày, nghiên cứu ảnh hưởng etanol, axit axetic, (NH4)2SO4, pH, ứng dụng làm. .. mẫu, tuyển chọn 02 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng dày làm đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu khả tạo màng chọn hai chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum A3 A6 cho màng dày Nghiên cứu quan