Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của A-Mangostin Từ Vỏ Quả Măng Cụt (Garcinia Mangostana L.) Lên Vi Khuẩn

1 VI N HÀN LÂM KHOA H C VÀ CÔNG NGH VI T NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH V T **************** LU NăV NăTH C S SINH H C TÀI:ăXỄCă NH T N SU Tă T BI Nă I M VÙNG D ậ LOOP TRONG H GEN TY TH NG Chuyên ngành : Sinh h c th c nghi m Mã s : 60 42 01 14 Ng iăh Ng i th c hi n L p I VI T NAM ng d n khoa h c : PGS.TS LÊ QUANG HU N : NGUY N THÙY LINH : Cao h c K17 Hà N i ậ 2015 M ă U t v năđ Trong vƠi n m tr l i đơy, h nh m t ch th sinh h c đ ng nghiên c u s d ng ADN ty th (ADN ty th ) c phát tri n nhanh chóng nhi u l nh v c khác Bên c nh đó, nh ng v n đ v r i lo n ty th liên quan đ n b nh ty th , b nh chuy n hóa hi m g p, lưo hóaầ.đ c xem m t nh ng m c tiêu nghiên c u c b n c a di truy n h c y h c V i nhi u phát minh c ng nh nghiên c u m i v di truy n t th k tr c mà tiêu bi u vi c cơng b trình t h gen ng chi u” (Cambridge Reference Sequencing ậ CRS) đ i hay g i lƠ “ trình t tham c Anderson c ng s công b đ u tiên vƠo n m 1981 vƠ “trình t tham chi u s a đ i” ậ rCRS (Andrew c ng s 1991) đư t o u ki n thu n l i cho nhà khoa h c nghiên c u sinh h c mƠ đ c bi t nh ng nghiên c u v loƠi ng cá th ng i Sau có b n đ gen ng i, ng i ta th y r ng i gi ng đ n 99.9% ch khác r t nh (0.1%) v c u trúc h gen Trong 0.1% khác bi t gi a hai cá th có đ n h n 80% lƠ đa hình nucleotit đ n (Single Nucleotide Polymorphism vƠ đ đ c s d ng r ng rãi m ng y d ích q trình ti n hóa loƠi ng c vi t t t SNP) Chính th SNP c h c, hình s cung c p nh ng ki n th c h u i vùng đ a lý b i c nh l ch s khác Vi c tìm đ c danh sách SNP c a ng i Vi t Nam s góp ph n h tr vào nghiên c u ti n hóa di truy n, đ ng th i c ng cung c p đ có liên quan đ n c n b nh ung th , r i lo n ng c thông tin v đ t bi n i Nh n th c đ c t m quan tr ng v vi c tìm hi u d li u di truy n v dân t c Vi t Nam th khn kh lu n v n nƠy, ti n hành nghiên c u: “Xácăđ nh t n su tăđ t bi n m vùng D ậ Loop c a h gen ty th ng M c tiêu: L pđ c a ng i Vi t Nam” c danh sách SNP vùng D ậ Loop c a AND ty th đ c tr ng i Vi t Nam N i dungăđ tài: - Tách chi t ADN t m u móng tay - Gi i trình t gen vùng D ậ Loop - Phân tích trình t gen vùng D ậ Loop m u so sánh trình t m u phân tích v i trình t tham chi u s a đ i (rCRS) vƠ tìm đ c tr ng SNPs Nam ch ng ng i Vi t CH NGăIăậ T NGăQUANăTÀIăLI U Gi i thi u chung v ty th Ty th (Mitochondrion) bào quan có th tìm th y g n nh t t c t bào có nhân S l ng c a ty th m i t bào m i loài khác Ty th trung tâm hô h p c a t bƠo, lƠ n i s n sinh ATP m t d ng n ng l ng có th s d ng cho ph n ng c a t bào Khơng có ty th t bào s ph i d a vào q trình đ ng phân k khí đ cung c p t t c adenosin triphotphat (ATP) cho ho t đ ng c a Ty th có h gen đ c l p nên có kh n ng t sinh s n b ng cách phơn đôi ty th m đ sinh ty th (Alberts B, Johnson A, Lewis J c ng s 2002) Hình 1.1 Hìnhă1.1.ăTyăth (Thepsychguru.com – 2012) 1.1 C u t o ch ngăc a ty th 1.1.1 C u t o Ty th bào quan có hình tròn ho c hình tr dƠi, có kích th cđ ng kính 0.1 ậ 0.5 µm, chi u dài ậ m Ty th có c u trúc màng kép bao g m màng (outer membrane) màng (inner membrane) Màng ch a protein t p kênh l n (g i porin) cho phép t t c phân t nh h n 5kDa th m qua đ đ c Màng c cu n g p r t ph c t p t o thành c u trúc g i mào ho c r ng l c (cristate) Khác v i màng ngoài, màng ch th m ch n l c m t s ion Vùng b m t l n c a màng ty th (intermembrane space) ch a enzym tham gia vào q trình oxy hóa - photphoryl hóa t ng h p ATP Ph n ch t n n (matrix space) c a ty th ch a enzym c n thi t cho s oxy hóa pyruvat axit béo, enzym tham gia vào chu trình axit tricacboxylic (ATC) (Cooper 2000) Khoang n n c ng ch a nhi u b n c a ADN ty th , ribosome c a ty th , RNA v n chuy n (tRNA) nhi u lo i enzym c n thi t cho phiên mã d ch mã c a gen ty th Hình 1.2 Hình 1.2 C u trúc ty th (hallcpbio.com) 1.1.2 Ch ngăc a ty th Ty th trung tâm gi i phóng chuy n hóa n ng l hóa ậ oxy hóa) Ph n l n n ng l ng đ ng c a t bào (photphoryl c tích l y nguyên li u h u c đ c gi i phóng chuy n thành d ng ATP s d ng pha phân gi i hi u khí di n ty th Vì v y ty th đ c xem lƠ “nhƠ máy n ng l ng” c a t bào (Dahout, Gonzalez 2006) Trong m i t bào s l ng ty th dao đ ng t 50 ậ 1.000 Các t bào ho t đ ng m nh nh t bƠo c vƠ t bào gan có s l ng l n ty th n i t bào ho t đ ng nhi u s vách ng n l i t ng lên, ng v i s enzym t ng lên Bên t bào ty th phân b l n i c n dùng nhi u n ng l ng Ví d t bào gan, ty th n m chèn m ng i n i ch t h t n i c n nhi u n ng l T ng h p n ng l r t nh n ng l cacbohydrat đ ng d ng cho t ng h p protein ng ty th thơng qua q trình đ tr c a gluco đ ng phân Ch m t ph n c chuy n hóa (2ATP) S c hồn t t s n ph m c a trình đ chuy n vào ty th b oxy hóa t O2 thành CO2, n chuy n hóa ng phơn (pyruvat) đ c c 36 ATP Các protein liên quan q trình oxy hóa ậ photphoryl hóa đ u đ nh v màng ty th , bao g m thành ph n chu i truy n n t (ph c h đ n 4), enzym F0F1 ATP synthase Quá trình truy n n t t ng h p ATP đ c tóm t t hình 1.3 Hìnhă1.3.ăS ăđ ăt ngăh păATPătrongătyăth Ty th có kh n ng t ng h p ch t: photpholipit, axit béo vƠ đ c bi t protein (protein c u trúc enzym) ADN ty th ch u trách nhi m t ng h p ph n protein ty th Ty th có kh n ng di truy n đ c l p đ i v i nhân Tuy nhiên v n có s ph i h p gi a nhơn, c ch t c a t bào ch t v i c ch t c a ty th trình bi u hi n c a gen (phiên mã t ng h p protein) căđi m c a ADN ty th ng 1.2 i ng d ng nghiên c u Ty th đóng vai trò quan tr ng đ i v i s ti n hóa c a đ ng v t Nh ng nghiên c u ph bi n hi n đ i v i di truy n ng i ADN ty th (mitochondrial DNA ậ ADN ty th ) M c dù b gen ty th ng i ch b ng 0.0005% so v i tồn b kích th c tìm th y gen ty th có liên c b gen nhơn nh ng SNP đ quan đ n nhi u b nh chuy n hóa, r i lo n c ng nh đ c tr ng SNP 1.2.1 ng i vƠ đ c bi t vùng D ậ Loop căđi m c a h gen ty th ng H gen ty th ng i i có chi u dài kho ng 16.569 bp, m t phân t m ch vòng kín n m ch t n n ty th có hàng ngàn b n m t t bào Phân t ADN ty th có hai chu i khác v thành ph n nucleotit:  Chu i n ng có ch a nhi u Guanin (H ậ strand), mã hóa cho 28 gen  Chu i nh ch a nhi u Cytosin (L ậ strand), mã hóa cho gen t ng s 37 gen c a h gen ty th Trong 37 gen có 13 gen mã hóa cho 13 chu i polypeptide c n thi t cho h th ng photphoryl hóa ậ oxy hóa, bao g m ti u đ n v c a ph c h I (complex I), m t ti u đ n v c a ph c h III (complex III), ti u đ n v c a ph c h VI (complex VI) hai ti u đ n v c a ph c h V (complex V) S gen l i mã hóa cho 22 tRNA, rRNA (12S 16S) ph c v trình d ch mã c a ty th (Anderson S 1981) Các chu i polypeptit khác c n thi t cho c u trúc ch c n ng c a ty th đ gen nhơn vƠ đ c mã hóa b i c t ng h p ribosom c a t bào ch t M t đ c m đáng Ủ lƠ h gen ty th ng hóa Ch có kho ng 7% gen ty th ng i có r t ph n trình t khơng mã i khơng mã hóa protein, rRNA, tRNA ph n l n h gen nhơn lƠ vùng ADN không mư hóa (intron) o n ADN gi a gen ty th ho c khơng có ho c ng n h n 10 bp mã k t thúc mRNA c n đ m t vài gen thay có c polyadenin hóa đ t o thành mã k t thúc Kho ng 90% s gen ty th không mã hóa l i n m vùng u n hay D ậ Loop Ph n l n trình t liên quan t i q trình nhơn đơi c a ADN ty th hay trình phiên mư đ u n m ho c g n vùng D ậ Loop o n D ậ Loop có kích th c kho ng 1.1 kb ADN ty th có m t s vùng b t bi n n m vùng D ậ Loop bao g m vùng promoter vùng CSB (Conserved Sequence Block) I, II III Vì trình t b t bi n nƠy đ u n m nên chúng đ D ậ Loop vƠ đ cb ot n r t nhi u loƠi đ ng v t có x ng s ng c cho r ng có vai trò quan tr ng q trình nhơn đơi c a ADN ty th Ví d , CSB I có v trí g n vùng kh i đ u c a trình nhơn đôi chu i n ng (Wallberg and Clayton 1981) Thêm n a, vùng D ậ Loop ch a vùng siêu bi n (hypervariable regions) HVI, HVII HVIII Nh ng vùng có t n su t đ t bi n cao h n đáng k so v i vùng khác c a h gen ty th (Greenberg 1983) Hìnhă1.4.ăC uătrúcătyăth ăng i (Innovitaresearch – 2003) 1.2.2 V tríăvƠăđ dƠiăvùngăgenăđi u n D ậ Loop Nh đư gi i thi u trên, vùng gen u n D ậ Loop có chi u dài x p x 1.100 bp ch a trình t kh i đ u cho trình tái b n h gen ty th vƠ đo n u n cho trình phiên mã c a gen ch c n ng vùng đ c mã hóa (Anderson 1981, Lightowlers 2001) H th ng đánh s baz b t đ u t i m g n gi a vùng u n vƠ v hai phía, th vùng u n tr i dài t v trí 16024 đ n 16569, sau ti p t c t v trí baz cho đ n 576 ơy lƠ vùng xu t hi n nhi u đ t bi n nh t v i t n s đ t bi n cao h n so v i vùng khác c a h gen ty th (Horai 1995, Sorenson, Fleischer 1996) Hình 1.5 Hìnhă1.5.ăVùngăđi uăkhi năDăậ Loopăc aătyăth ăng (http://www.alphabiolab.com) i  Vùng siêu bi n (HV1) kéo dài t v trí 16024 đ n 16365  Vùng siêu bi n (HV2) kéo dài t v trí 73 đ n 340  Vùng siêu bi n (HV3) kéo dài t nucleotit 438 đ n 574 1.3 aăhìnhănucleotităđ nă(SingleăNucleotideăPolymophismsăậ SNPs) 1.3.1 aăhìnhănucleotităđ nălƠăgì? a hình nucleotit đ n hay g i lƠ SNPs, đ c đ nh ngh a lƠ bi n th trình t ADN x y m t nucleotit đ n A, T, G hay C h gen khác bi t so v i cá th khác m t lồi Hìnhă1.6.ă aăhìnhănucleotităđ n (learn.genetics.utah.edu) cá th ng i, có 99.9% gi ng nhau, ch 0.1% khác bi t S khác bi t có th lƠ đ c tr ng tính tr ng Ví d nh s phát tri n b nh nƠo ng i ho c ki u hình ầ Nh ng bi n đ i có th khơng có h i (nh ng thay đ i v ki u hình), có h i (gây b nh ung th , b nh tim, Huntington’s, b nh tan huy t b m sinh), ho c phát tri n sau v giƠ (đơy lƠ nh ng bi n đ i đ c tìm th y vùng mư hóa vƠ u hòa gen) 1.3.2 Các v trí SNP gen SNP có th n m vùng mã hóa gen, vùng không mang mã ho c vùng xen gi a gen Các SNP trình t mã hóa khơng nh t thi t s làm thay đ i trình t axit amin 10 TÀIăLI UăTHAMăKH O Attardi, G., and Schatz, G., 1988, Biogenesis of mitochondria, Annu Rev Cell Biol 4:289-333 Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.Molecular Biology of the Cell 4th edition, Garland Science; 2002 Barthelemy, C., de Baulny, H O., and Lombes, A., 2002, D-loop mutations in mitochondrial DNA: link with mitochondrial DNA depletion?, Hum Genet 110(5):47987 Berger, K H., and Yaffe, M P., 1996, Mitochondrial distribution and inheritance, Experientia 52(12):1111-6 Bowmaker, M., Yang, M Y., Yasukawa, T., Reyes, A., Jacobs, H T., Huberman, J A., and Holt, I J., 2003, Mammalian mitochondrial DNA replicates bidirectionally from an initiation zone, J Biol Chem 278(51):50961-9 Brown, T A., Cecconi, C., Tkachuk, A N., Bustamante, C., and Clayton, D A., 2005, Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative lightstrand origins, not via a strand-coupled mechanism, Genes Dev 19(20):2466-76 Butler, J.M., McCord, B.R., Jung, J.M., Wilson, M.R., Budowle, B., Allen, R.O (1994) Quantitation of PCR products by capillary electrophoresis using laser fluorescence J Chromatogr B 658: 271-280 Butler, J.M and Levin, B.C (1998) Forensic applications of mitochondrial DNA Trends in Biotechnology 16: 158-162 Chen, X J., and Butow, R A., 2005, The organization and inheritance of the mitochondrial genome, Nat Rev Genet 6(11):815-25 10 Cheng, Y L., Chang, W L., Lee, S C., Liu, Y G., Chen, C J., Lin, S Z., Tsai, N M., Yu, D S., Yen, C Y., and Harn, H J., 2004, Acetone extract of Angelica sinensis inhibits proliferation of human cancer cells via inducing cell cycle arrest and apoptosis, Life Sci 75(13):1579-94 39 11 Clayton, D A., 2003, Mitochondrial DNA replication: what we know, IUBMB Life 55(4-5):213-7 12 Cooper, G., 2000, The Cell: A Molecular Approach, Sunderland 13 Dahout-Gonzalez, C., Nury, H., Trezeguet, V., Lauquin, G J., Pebay-Peyroula, E., and Brandolin, G., 2006, Molecular, functional, and pathological aspects of the mitochondrial ADP/ATP carrier, Physiology (Bethesda) 21:242-9 14 Ernster, L., and Schatz, G., 1981, Mitochondria: a historical review, J Cell Biol 91(3 Pt 2):227s-255s 15 Evan, G I., and Vousden, K H., 2001, Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer, Nature 411(6835):342-8 16 Fliss, M S., Usadel, H., Caballero, O L., Wu, L., Buta, M R., Eleff, S M., Jen, J., and Sidransky, D., 2000, Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids, Science 287(5460):2017-9 17 Ginther, C., Issel-Tarver, L., and King, M C., 1992, Identifying individuals by sequencing mitochondrial DNA from teeth, Nat Genet 2(2):135-8 18 Goldstein, S., and Shmookler Reis, R J., 1984, Genetic modifications during cellular aging, Mol Cell Biochem 64(1):15-30 19 Greenberg, B D., Newbold, J E., and Sugino, A., 1983, Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA, Gene 21(1-2):33-49 20 Hanahan, D., and Weinberg, R A., 2000, The hallmarks of cancer, Cell 100(1):57-70 Herbst, R., 2008, Molecylar origind of cancer: Lung Cancer, N Engl J Med (359):136780 21 Hernandez-Resendiz, S., Buelna-Chontal, M., Correa, F., and Zazueta, C., 2013, Targeting mitochondria for cardiac protection, Curr Drug Targets 14(5):586-600 40 22 IARC, 2013, IARC releases the latest global cancer trends in five continents, in: WHO Press Release 23 Lu, J., Sharma, L K., and Bai, Y., 2009, Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis, Cell Res 19(7):802-15 24 Majamaa, K., Moilanen, J S., Uimonen, S., Remes, A M., Salmela, P I., Karppa, M., Majamaa-Voltti, K A., Rusanen, H., Sorri, M., Peuhkurinen, K J., and Hassinen, I E., 1998, Epidemiology of A3243G, the mutation for mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: prevalence of the mutation in an adult population, Am J Hum Genet 63(2):447-54 25 McFarland, R., Elson, J L., Taylor, R W., Howell, N., and Turnbull, D M., 2004, Assigning pathogenicity to mitochondrial tRNA mutations: when "definitely maybe" is not good enough, Trends Genet 20(12):591-6 26 McKinney, E A., and Oliveira, M T., 2013, Replicating animal mitochondrial DNA, Genet Mol Biol 36(3):308-315 27 Miyazono, F., Schneider, P M., Metzger, R., Warnecke-Eberz, U., Baldus, S E., Dienes, H P., Aikou, T., and Hoelscher, A H., 2002, Mutations in the mitochondrial DNA D-Loop region occur frequently in adenocarcinoma in Barrett's esophagus, Oncogene 21(23):3780-3 28 Mootha, V K., Lindgren, C M., Eriksson, K F., Subramanian, A., Sihag, S., Lehar, J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N., Daly, M J., Patterson, N., Mesirov, J P., Golub, T R., Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E S., Hirschhorn, J N., Altshuler, D., and Groop, L C., 2003, PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes, Nat Genet 34(3):267-73 29 Moraes, C T., Srivastava, S., Kirkinezos, I., Oca-Cossio, J., van Waveren, C., Woischnick, M., and Diaz, F., 2002, Mitochondrial DNA structure and function, Int Rev Neurobiol 53:3-23 41 30 Muller-Hocker, J., 1990, Cytochrome c oxidase deficient fibres in the limb muscle and diaphragm of man without muscular disease: an age-related alteration, J Neurol Sci 100(12):14-21 31 Nass, M M., and Nass, S., 1963, Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics I Fixation and Electron Staining Reactions, J Cell Biol 19:593-611 32 Parkin, D M., Pisani, P., and Ferlay, J., 1993, Estimates of the worldwide incidence of eighteen major cancers in 1985, Int J Cancer 54(4):594-606 33 Petersen, K F., Befroy, D., Dufour, S., Dziura, J., Ariyan, C., Rothman, D L., DiPietro, L., Cline, G W., and Shulman, G I., 2003, Mitochondrial dysfunction in the elderly: possible role in insulin resistance, Science 300(5622):1140-2 34 Polyak, K., Li, Y., Zhu, H., Lengauer, C., Willson, J K., Markowitz, S D., Trush, M A., Kinzler, K W., and Vogelstein, B., 1998, Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours, Nat Genet 20(3):291-3 35 Ralph, S J., Rodriguez-Enriquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., and Moreno-Sanchez, R., 2010, The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy, Mol Aspects Med 31(2):145-70 35 Reed, J C., and Green, D R., 2002, Remodeling for demolition: changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis, Mol Cell 9(1):1-3 36 Schatz, G., and Klima, J., 1964, Triphosphopyridine Nucleotide: Cytochrome C Reductase of Saccharomyces Cerevisiae: a "Microsomal" Enzyme, Biochim Biophys Acta 81:448-61 37 Shoubridge, E A., 2001, Nuclear genetic defects of oxidative phosphorylation, Hum Mol Genet 10(20):2277-84 38 Slonimski, P., and Ephrussi, B., 1949, Action de l'acriflavine sur les levures V Le systeme des cytochromes des mutants ‘petite colonie’, Annales de l'Institut Pasteur:47-63 42 39 Stoneking, M., 2000, Hypervariable sites in the ADN ty th control region are mutational hotspots, Am J Hum Genet 67(4):1029-32 Taylor, R W., and Turnbull, M CL C Trang M U Error! Bookmark not defined t v n đ Error! Bookmark not defined M c tiêu Error! Bookmark not defined N i dung đ tài Error! Bookmark not defined CH NG I ậ T NG QUAN TÀI LI U Error! Bookmark not defined Gi i thi u chung v ty th Error! Bookmark not defined 43 1.1 C u t o ch c n ng c a ty th Error! Bookmark not defined 1.1.1 C u t o Error! Bookmark not defined 1.1.2 Ch c n ng c a ty th Error! Bookmark not defined 1.2 căđi m c a ADN ty th ng Bookmark not defined i ng d ng nghiên c u Error! c m c a h gen ty th ng i Error! Bookmark not defined 1.2.1 1.2.2 V trí vƠ đ dƠi vùng gen u n D ậ Loop Error! Bookmark not defined 1.3 aăhìnhănucleotităđ nă(SingleăNucleotideăPolymophismsăậ SNPs) Error! Bookmark not defined 1.3.1 a hình nucleotit đ n lƠ gì? Error! Bookmark not defined 1.3.2 Các v trí SNP gen Error! Bookmark not defined 1.3.3 ng d ng t m quan tr ng Error! Bookmark not defined 1.4 t bi n ty th b nh ty th Error! Bookmark not defined 1.4.1 t bi n ty th vùng D ậ Loop Error! Bookmark not defined 1.4.2 t bi n ty th n m vùng D ậ Loop Error! Bookmark not defined CH NG V T LI U VÀ PH not defined NG PHÁP NGHIÊN C U Error! Bookmark 2.1 V t li u Error! Bookmark not defined 2.1.1 Ph 2.1.2 Hóa ch t Error! Bookmark not defined 2.2 Trang thi t b Error! Bookmark not defined 2.3 Ph n m m tin sinh h c Error! Bookmark not defined 2.4 Ph ngăphápănghiênăc u Error! Bookmark not defined 2.4.1 Ph ng pháp tách chi t ADN t móng tay Error! Bookmark not defined ng pháp l y m u Error! Bookmark not defined 2.4.2 nh l ng ADN tách chi t b ng ph Bookmark not defined 2.4.3 ng pháp quang ph k Error! Nhơn đo n gen b ng ph n ng PCR Error! Bookmark not defined 2.4.4 Ph defined ng pháp gi i trình t theo ph 2.4.5 Ph defined ng pháp phơn tích ch t l ng pháp F Sanger Error! Bookmark not ng d li u trình t Error! Bookmark not 2.4.6 Ph ng pháp tìm đ t bi n gen Error! Bookmark not defined CH NGăIIIăậ K T QU VÀ TH O LU N Error! Bookmark not defined 3.1 Tách chi t ADN t ng s t m u sinh ph m Error! Bookmark not defined 3.2 Nhân gen b ngăph ngăphápăPCR Error! Bookmark not defined 44 3.3 K t qu gi i trình t gen Error! Bookmark not defined 3.4 K t qu phơnătíchăđ t bi n Error! Bookmark not defined 3.4.1 Các SNPs đ 3.4.2 Các v trí đa hình (SNPs) HV1 vùng D ậ Loop c a ng Error! Bookmark not defined c công b Ngân hàng Gen Error! Bookmark not defined i Vi t Nam 3.4.3 So sánh danh sách SNPs ng i Vi t Nam danh sách SNPs th ng kê GenBank Error! Bookmark not defined 3.5 Các v tríăđaăhìnhăđ cătr ngă ng Bookmark not defined i Vi t Nam b nh ty th Error! 3.6 T l đaăhìnhăcácăv tríăđaăhìnhăxu t hi n m u phân tích Error! Bookmark not defined CH NGăIVăậ K T LU N VÀ KI N NGH Error! Bookmark not defined K T LU N Error! Bookmark not defined KI N NGH Error! Bookmark not defined TÀI LI U THAM KH O Error! Bookmark not defined 45 DANH M C CÁC HÌNH Trang M U t v năđ M c tiêu: 3 N iădungăđ tài: .3 CH NG I ậ T NG QUAN TÀI LI U Gi i thi u chung v ty th Hình 1.1 Ty th .5 1.1 C u t o ch ngăc a ty th .5 1.1.1 C u t o Hình 1.2 C u trúc ty th .6 1.1.2 Ch ngăc a ty th Hình 1.3 S đ t ng h p ATP ty th 1.2 căđi m c a ADN ty th ng 1.2.1 căđi m c a h gen ty th ng Hình 1.4 C u trúc ty th ng 1.2.2 i ng d ng nghiên c u i i .9 V tríăvƠăđ dƠiăvùngăgenăđi u n D ậ Loop Hình 1.5 Vùng u n D ậ Loop c a ty th ng i 1.3 aăhìnhănucleotităđ nă(SingleăNucleotideăPolymophismsăậ SNPs) 10 1.3.1 aăhìnhănucleotităđ nălƠăgì? 10 Hìnhă1.6.ă aăhìnhănucleotităđ n 10 1.3.2 Các v trí SNP gen 10 Hình 1.7 V trí SNPs gen 11 1.3.3 ng d ng t m quan tr ng 11 1.4 t bi n ty th b nh ty th 12 1.4.1 t bi n ty th vùng D ậ Loop 12 1.4.2 t bi n ty th n m vùng D ậ Loop 13 CH NG V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 15 2.1 V t li u .15 2.1.1 Ph ng pháp l y m u 15 Hình 2.1 Các b c ti n hành thu th p m u sinh ph m 15 2.1.2 Hóa ch t 15 2.2 Trang thi t b 16 46 B ng 2.1 Danh sách trang thi t b s d ng cho nghiên c u 16 2.3 Ph n m m tin sinh h c 16 B ng 2.2 Ph n m m s d ng 17 2.4 Ph ngăphápănghiênăc u .17 2.4.1 Ph ng pháp tách chi t ADN t móng tay 17 2.4.2 2.4.3 nh l ng ADN tách chi t b ng ph ng pháp quang ph k 18 Nhơn đo n gen b ng ph n ng PCR 18 Hình 2.2 S đ nguyên lý ph n ng PCR 19 Hình 2.3 Các b 2.4.4 Ph c c a m t chu k PCR 20 ng pháp gi i trình t theo ph ng pháp F Sanger 21 Hình 2.4 Nguyên lý gi i trình t ADNătheoăph 2.4.5 Ph ng pháp phơn tích ch t l ngăphápăSanger 22 ng d li u trình t 22 Hình 2.5 Ki m tra ch t l ng tín hi u d a d li u trình t 23 Hình 2.6 Ki m tra ch t l ng gi i mã trình t b ng ph 2.4.6 Ph ng pháp ph thơng .24 ng pháp tìm đ t bi n gen 24 CH NG III ậ K T QU VÀ TH O LU N 25 3.1 Tách chi t ADN t ng s t m u sinh ph m 25 B ng 3.1 K t qu đo ki m tra giá tr h p th ánh sáng t ngo i t i b c sóng 260 nm 280 nm 25 3.2 Nhân gen b ngăph ngăphápăPCR .25 B ng 3.2 Thành ph n dùng cho m t ph n ng PCR 27 B ng 3.3 Chu trình nhi t ph n ng PCR .27 Hình 3.1 K t qu n di s n ph m PCR vùng D ậ Loop 27 3.3 K t qu gi i trình t gen 28 Hình 3.2 K t qu gi i trình t m t s m u sinh ph m 28 3.4 K t qu phơnătíchăđ t bi n 28 3.4.1 CácăSNPsăđ c công b Ngân hàng Gen 29 B ng 3.4 V trí đa hình HV1 vùng D ậ Loop đ 29 3.4.2 c công b Ngân hàng Gen Các v tríăđaăhìnhă(SNPs)ă HV1 vùng D ậ Loop c aăng i Vi t Nam 30 Hình 3.3 Ph n m m NovoSNP phân tích m u .31 B ng 3.5 SNPs đ c tìm th y HV1 m u sinh ph m Vi t Nam (NovoSNPS) 31 Hình 3.5 SNP t i v trí 16381 .33 3.4.3 SoăsánhădanhăsáchăSNPsăng i Vi t Nam danh sách SNPs th ng kê GenBank 33 Hình 3.6 B n đ Venn tìm m đ c tr ng vƠ riêng c a ng B ng 3.6 Các SNP đ c tr ng ng i Vi t Nam 34 i Vi t Nam 34 47 3.5 Các v tríăđaăhìnhăđ cătr ngă ng 3.6 Ph nătr măđaăhìnhătrongăm u phân tích 36 i Vi t Nam b nh ty th 34 Hình 3.7 K t qu phơn tích đ t bi n nhóm ng i Vi t Nam nghiên c u .36 B ng 3.8 Ph n tr m đa hình c a 11 SNP đ c tr ng c a ng i Vi t Nam 36 K T LU N VÀ KI N NGH .38 K T LU N 38 KI N NGH 38 TÀI LI U THAM KH O .39 Attardi, G., and Schatz, G., 1988, Biogenesis of mitochondria, Annu Rev Cell Biol 4:289-333 39 Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.Molecular Biology of the Cell 4th edition, 39 Garland Science; 2002 39 Barthelemy, C., de Baulny, H O., and Lombes, A., 2002, D-loop mutations in mitochondrial DNA: link with mitochondrial DNA depletion?, Hum Genet 110(5):47987 39 Berger, K H., and Yaffe, M P., 1996, Mitochondrial distribution and inheritance, Experientia 52(12):1111-6 39 Bowmaker, M., Yang, M Y., Yasukawa, T., Reyes, A., Jacobs, H T., Huberman, J A., and Holt, I J., 2003, Mammalian mitochondrial DNA replicates bidirectionally from an initiation zone, J Biol Chem 278(51):50961-9 39 Brown, T A., Cecconi, C., Tkachuk, A N., Bustamante, C., and Clayton, D A., 2005, Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative lightstrand origins, not via a strand-coupled mechanism, Genes Dev 19(20):2466-76 .39 Butler, J.M., McCord, B.R., Jung, J.M., Wilson, M.R., Budowle, B., Allen, R.O (1994) Quantitation of PCR products by capillary electrophoresis using laser fluorescence J Chromatogr B 658: 271-280 .39 Butler, J.M and Levin, B.C (1998) Forensic applications of mitochondrial DNA Trends in Biotechnology 16: 158-162 39 Chen, X J., and Butow, R A., 2005, The organization and inheritance of the mitochondrial genome, Nat Rev Genet 6(11):815-25 .39 10 Cheng, Y L., Chang, W L., Lee, S C., Liu, Y G., Chen, C J., Lin, S Z., Tsai, N M., Yu, D S., Yen, C Y., and Harn, H J., 2004, Acetone extract of Angelica sinensis inhibits proliferation of human cancer cells via inducing cell cycle arrest and apoptosis, Life Sci 75(13):1579-94 39 11 Clayton, D A., 2003, Mitochondrial DNA replication: what we know, IUBMB Life 55(4-5):213-7 40 12 Cooper, G., 2000, The Cell: A Molecular Approach, Sunderland 40 48 13 Dahout-Gonzalez, C., Nury, H., Trezeguet, V., Lauquin, G J., Pebay-Peyroula, E., and Brandolin, G., 2006, Molecular, functional, and pathological aspects of the mitochondrial ADP/ATP carrier, Physiology (Bethesda) 21:242-9 40 14 Ernster, L., and Schatz, G., 1981, Mitochondria: a historical review, J Cell Biol 91(3 Pt 2):227s-255s 40 15 Evan, G I., and Vousden, K H., 2001, Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer, Nature 411(6835):342-8 40 16 Fliss, M S., Usadel, H., Caballero, O L., Wu, L., Buta, M R., Eleff, S M., Jen, J., and Sidransky, D., 2000, Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids, Science 287(5460):2017-9 40 17 Ginther, C., Issel-Tarver, L., and King, M C., 1992, Identifying individuals by sequencing mitochondrial DNA from teeth, Nat Genet 2(2):135-8 40 18 Goldstein, S., and Shmookler Reis, R J., 1984, Genetic modifications during cellular aging, Mol Cell Biochem 64(1):15-30 40 19 Greenberg, B D., Newbold, J E., and Sugino, A., 1983, Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA, Gene 21(1-2):33-49 40 20 Hanahan, D., and Weinberg, R A., 2000, The hallmarks of cancer, Cell 100(1):57-70 40 Herbst, R., 2008, Molecylar origind of cancer: Lung Cancer, N Engl J Med (359):136780 40 21 Hernandez-Resendiz, S., Buelna-Chontal, M., Correa, F., and Zazueta, C., 2013, Targeting mitochondria for cardiac protection, Curr Drug Targets 14(5):586-600 .40 22 IARC, 2013, IARC releases the latest global cancer trends in five continents, in: WHO Press Release .41 23 Lu, J., Sharma, L K., and Bai, Y., 2009, Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis, Cell Res 19(7):802-15 41 24 Majamaa, K., Moilanen, J S., Uimonen, S., Remes, A M., Salmela, P I., Karppa, M., Majamaa-Voltti, K A., Rusanen, H., Sorri, M., Peuhkurinen, K J., and Hassinen, I E., 1998, Epidemiology of A3243G, the mutation for mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: prevalence of the mutation in an adult population, Am J Hum Genet 63(2):447-54 41 25 McFarland, R., Elson, J L., Taylor, R W., Howell, N., and Turnbull, D M., 2004, Assigning pathogenicity to mitochondrial tRNA mutations: when "definitely maybe" is not good enough, Trends Genet 20(12):591-6 41 26 McKinney, E A., and Oliveira, M T., 2013, Replicating animal mitochondrial DNA, Genet Mol Biol 36(3):308-315 41 27 Miyazono, F., Schneider, P M., Metzger, R., Warnecke-Eberz, U., Baldus, S E., Dienes, H P., Aikou, T., and Hoelscher, A H., 2002, Mutations in the mitochondrial 49 DNA D-Loop region occur frequently in adenocarcinoma in Barrett's esophagus, Oncogene 21(23):3780-3 41 28 Mootha, V K., Lindgren, C M., Eriksson, K F., Subramanian, A., Sihag, S., Lehar, J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N., Daly, M J., Patterson, N., Mesirov, J P., Golub, T R., Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E S., Hirschhorn, J N., Altshuler, D., and Groop, L C., 2003, PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes, Nat Genet 34(3):267-73 .41 29 Moraes, C T., Srivastava, S., Kirkinezos, I., Oca-Cossio, J., van Waveren, C., Woischnick, M., and Diaz, F., 2002, Mitochondrial DNA structure and function, Int Rev Neurobiol 53:3-23 41 30 Muller-Hocker, J., 1990, Cytochrome c oxidase deficient fibres in the limb muscle and diaphragm of man without muscular disease: an age-related alteration, J Neurol Sci 100(12):14-21 .42 31 Nass, M M., and Nass, S., 1963, Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics I Fixation and Electron Staining Reactions, J Cell Biol 19:593-611 42 32 Parkin, D M., Pisani, P., and Ferlay, J., 1993, Estimates of the worldwide incidence of eighteen major cancers in 1985, Int J Cancer 54(4):594-606 .42 33 Petersen, K F., Befroy, D., Dufour, S., Dziura, J., Ariyan, C., Rothman, D L., DiPietro, L., Cline, G W., and Shulman, G I., 2003, Mitochondrial dysfunction in the elderly: possible role in insulin resistance, Science 300(5622):1140-2 42 34 Polyak, K., Li, Y., Zhu, H., Lengauer, C., Willson, J K., Markowitz, S D., Trush, M A., Kinzler, K W., and Vogelstein, B., 1998, Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours, Nat Genet 20(3):291-3 .42 35 Ralph, S J., Rodriguez-Enriquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., and Moreno-Sanchez, R., 2010, The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy, Mol Aspects Med 31(2):145-70 42 35 Reed, J C., and Green, D R., 2002, Remodeling for demolition: changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis, Mol Cell 9(1):1-3 .42 36 Schatz, G., and Klima, J., 1964, Triphosphopyridine Nucleotide: Cytochrome C Reductase of Saccharomyces Cerevisiae: a "Microsomal" Enzyme, Biochim Biophys Acta 81:448-61 42 37 Shoubridge, E A., 2001, Nuclear genetic defects of oxidative phosphorylation, Hum Mol Genet 10(20):2277-84 42 38 Slonimski, P., and Ephrussi, B., 1949, Action de l'acriflavine sur les levures V Le systeme des cytochromes des mutants ‘petite colonie’, Annales de l'Institut Pasteur:47-63 42 39 Stoneking, M., 2000, Hypervariable sites in the ADN ty th control region are mutational hotspots, Am J Hum Genet 67(4):1029-32 43 50 Taylor, R W., and Turnbull, 43 DANH M C CÁC B NG Trang B ng 2.1 Danh sách trang thi t b s d ng cho nghiên c u 16 B ng 2.2 Ph n m m s d ng 17 B ng 3.1 K t qu đoăki m tra giá tr h p th ánh sáng t ngo i t iă2ăb c sóng 260 nm 280 nm 25 B ng 3.2 Thành ph n dùng cho m t ph n ng PCR 27 B ng 3.3 Chu trình nhi t ph n ng PCR 27 B ng 3.4 V tríăđaăhìnhăHV1ătrongăvùngăDăậ Loopăăđ B ngă3.5.ăSNPsăđ c tìm th y HV1 B ngă3.6.ăCácăSNPăđ cătr ngă ng c công b Ngân hàng Gen 29 m u sinh ph m Vi t Nam (NovoSNPS) 31 i Vi t Nam 34 B ng 3.7 M t s b nh ty th liênăquanăđ năđ t bi năđi m vùng HV1 35 B ng 3.8 Ph nătr măđaăhìnhăc a 11 SNP đ cătr ngăc aăng 51 i Vi t Nam 36 52 53 ... loƠi ng c vi t t t SNP) Chính th SNP c h c, hình s cung c p nh ng ki n th c h u i vùng đ a lý b i c nh l ch s khác Vi c tìm đ c danh sách SNP c a ng i Vi t Nam s góp ph n h tr vào nghiên c u... ng v vi c tìm hi u d li u di truy n v dân t c Vi t Nam th khn kh lu n v n nƠy, ti n hành nghiên c u: “Xácăđ nh t n su tăđ t bi n m vùng D ậ Loop c a h gen ty th ng M c tiêu: L pđ c a ng i Vi t... (hypervariable regions) HVI, HVII HVIII Nh ng vùng có t n su t đ t bi n cao h n đáng k so v i vùng khác c a h gen ty th (Greenberg 1983) Hìnhă1.4.ăC uătrúcătyăth ăng i (Innovitaresearch – 2003) 1.2.2