Xác định các tác nhân gây bệnh trên cá cảnh biển tại thủy cung vinpearl, bước đầu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của một số thực vật trên tác nhân gây bệnh cho cá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MƠI TRƯỜNG TRẦN THỊ KHÁNH MAI XÁC ĐỊNH CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH TRÊN CÁ CẢNH BIỂN TẠI THỦY CUNG VINPEARL BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ THỰC VẬT TRÊN TÁC NHÂN GÂY BỆNH CHO CÁ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC GVHD:ThS VĂN HỒNG CẦM TS ĐỖ LÊ HỮU NAM Nha Trang, 07/2013 LỜI CẢM ƠN Đề tài tốt nghiệp thực Phòng thí nghiệm Vi sinh - Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, trường Đại học Nha Trang thời gian từ ngày 20/2/2013 đến 15/6/2013 Để hoàn thành đề tài này, nỗ lực cố gắng thân, nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cô giáo Đặc biệt, xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ths Văn Hồng Cầm tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian công sức dạy cho nhiều kiến thức kỹ quý báu suốt trình thực tập hồn thành đề tài tốt nghiệp Tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến: Ban giám đốc Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, thầy Đỗ Lê Hữu Nam cô Trương Thị Thu Thủy - cán quản lý Phòng Vi sinh tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài tốt nghiệp Các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học Môi trường, trường Đại học Nha Trang truyền dạy kiến thức tảng cho suốt năm giảng đường Đại học Cuối cùng, xin cảm ơn quan tâm, dạy dỗ động viên gia đình giúp đỡ bạn bè suốt trình thực đề tài Trong thời gian thực đề tài, có nhiều cố gắng kiến thức kinh nghiệm hạn chế nên khơng thể tránh khỏi nhiều thiếu sót Rất mong nhận quan tâm, góp ý q thầy giáo bạn để đề tài hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng năm 2013 Sinh viên thực TRẦN THỊ KHÁNH MAI MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁ CẢNH BIỂN 1.1.1 Đa dạng sinh học cá biển 1.1.2 Giá trị kinh tế cá cảnh biển 1.1.3 Một số bệnh thường gặp cá cảnh biển 1.2 MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ THỰC VẬT 16 1.2.1 Những hạn chế việc sử dụng thuốc kháng sinh việc phòng trị bệnh nhiễm khuẩn thủy sản 16 1.2.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng hợp chất chiết xuất từ thực vật nước 17 1.3 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 19 1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 21 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 21 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 21 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Đối tượng 21 2.2.2 Các chủng vi khuẩn kiểm định 21 2.2.3 Một số loại thực vật thí nghiệm 21 2.3DỤNG CỤ - HĨA CHẤT – MƠI TRƯỜNG 22 2.3.1 Dụng cụ thí nghiệm 22 2.3.2 Mơi trường hóa chất 22 2.4PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 23 2.4.2 Phương pháp thu mẫu phân lập tác nhân gây bệnh 24 2.4.3 Thí nghiệm xác định độc lực vi khuẩn định danh chủng vi khuẩn đích gây bệnh 26 2.4.4 Lập kháng sinh đồ 28 2.4.5 Thử nghiệm khả kháng khuẩn thực vật 29 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 KẾT QUẢ 30 3.1.1 Kiểm định tiêu nấm ký sinh trùng 30 3.1.2 Phân lập vi khuẩn định danh sơ 30 3.1.3 Xác định độc lực vi khuẩn định danh vi khuẩn mục tiêu 31 3.1.4 Kháng sinh đồ 36 3.1.5 3.2 Khả kháng khuẩn số loại thực vật 37 THẢO LUẬN 39 3.2.1 Định danh vi khuẩn dựa đặc điểm sinh lý, sinh hóa 39 3.2.2 Xác định tác nhân gây bệnh cá cảnh biển 39 3.2.3 Khả mẫn cảm với số loại kháng sinh 43 3.2.4 Khả kháng khuẩn dịch chiết từ số loài thực vật 44 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1 KẾT LUẬN 45 4.2 KIẾN NGHỊ 45 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABIS Advanced Bacterial Identification Software (Phần mềm định danh vi khuẩn ) ATCC American Type Culture Collection (Bộ sưu tập chủng giống Hoa Kỳ) CFU Colony-forming unit (Số đơn vị khuẩn lạc) CLSI Clinical and Laboratory Standards Institude (Tiêu chuẩn sở lâm sàng phòng thí nghiệm) KIA Kligler Iron Agar LD50 Lethal Dose, 50% (liều lượng chất độc gây chết cho 50% số cá thể đem thí nghiệm) McF McFarland NA Nutrient Agar R Resistant (Kháng) S Susceptible (Nhạy cảm) TCBS Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Tổng số cá cảnh biển giao dịch toàn cầu năm 1990 .4 Bảng 1.2 Các nước xuất nhập cá cảnh biển giới Bảng 3.1 Kết cảm nhiễm chủng D1-8 cá Khoang cổ đỏ ( A frenatus) 32 Bảng 3.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn D1-8 35 Bảng 3.3 Bảng kết xác định kháng sinh đồ chủng D1-8 D2-10 .36 Bảng 3.4 Kết kháng khuẩn dịch chiết số loại thực vật .38 Bảng 3.5 Các đặc điểm sinh hóa chủng D1-8 so sánh với chủng Aeromonas phân lập từ số nghiên cứu 40 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Mối quan hệ yếu tố gây bệnh cho động vật thủy sản Hình 1.2 Mối tương quan vật chủ, môi trường, tác nhân gây bệnh khả hình thành bệnh 10 Hình 1.3 Một số bệnh phổ biến vi khuẩn gây cá biển 13 Hình 1.4 Một số bệnh cá biển ký sinh trùng gây 14 Hình 1.5 Các khối u cá virus Lymphocystis gây 15 Hình 1.6 Bệnh hoại tử tuyến tụy virus IPNV gây cá hồi 16 Hình 1.7 Cá bị xung huyết thân 19 Hình 1.8 Cá bị đục mắt 19 Hình 1.9 Bóng (trái) thành ruột (phải) bị xuất huyết 20 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập tác nhân gây bệnh tổng quát 23 Hình 2.2 Hình ảnh giải phẫu cá vị trí nội quan 25 Hình 2.3 Cá Khoang cổ đỏ (trái) thao tác tiêm vi khuẩn vào cá (phải) 28 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng D1-8 mơi trường TCBS .31 Hình 3.2 Biểu đồ xác định số LD50 chủng D1-8 33 Hình 3.3 Biểu độ xác định tỷ lệ chết tích lũy theo ngày chủng D1-8 .33 Hình 3.4 Khả làm tan huyết chủng D1-8 34 Hình 3.5 Kết kiểm tra đặc tính sinh hóa chủng D1-8 kit API-20E 34 Hình 3.6 Kết thử nghiệm khả kháng loại kháng sinh hai chủng D1-8 (trái) D2-10 (phải) 37 Hình 3.7 So sánh khả kháng khuẩn dịch chiết từ lồi thực vật 37 Hình 3.8 Hệ thống bể ni tuần hồn khép kín Thủy cung Vinpearl .42 Hình 3.9 Các sản phẩm kháng sinh Amoxicilin dùng cho cá cảnh .43 LỜI MỞ ĐẦU Bên cạnh loài cá nước mặn cho giá trị mặt dinh dưỡng, cá cảnh biển đối tượng mang lại giá trị mỹ thuật có lợi ích kinh tế cao Thủy cung – nơi trưng bày loài cá động thực vật thủy sinh quy mô lớn – địa điểm du lịch thu hút đông đảo khách tham quan Các thủy cung khơng có vai trò kinh tế thơng qua việc cung cấp dịch vụ giải trí nghệ thuật mà hình thức bảo tồn chuyển vị (exsitu conservation) giúp bảo tồn số lồi q có nguy đe dọa cao Tại thành phố biển Nha Trang, số thủy cung tiếng nhiều người biết đến Thủy cung Vinpearl, Hồ cá Trí Nguyên Bảo tàng Hải Dương học Trong năm gần đây, dịch bệnh cá ngày diễn biến phức tạp khó kiểm sốt Cá cảnh thủy cung khơng tránh khỏi vấn đề dịch bệnh Thủy cung Vinpearl thường phải đối mặt với tình trạng cá bể thủy sinh chết hàng loạt không rõ nguyên nhân, làm thiệt hại lớn đến doanh thu khu du lịch Xác định nguyên nhân gây bệnh đề biện pháp phòng điều trị bệnh cần thiết Hiện nay, kháng sinh sử dụng rộng rãi để phòng trị bệnh động vật nói chung (Feinman, 1998; Barbosa Levy, 2000; Blackman, 2002) nuôi trồng thủy sản (Reilly Kaeferstein, 1997) nói riêng Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh không quy cách, lạm dụng thuốc mức gây nên tượng tạo lây lan dòng vi khuẩn kháng thuốc (Feinman, 1998; Levy, 1998; Witte, 1998), làm giảm hiệu sử dụng, tăng khả kháng bệnh vi khuẩn; ngồi tác động xấu đến môi trường nuôi làm giảm sức sống cá (Nguyễn Thị Vân Thái cs., 2003; Mai Văn Tài, 2004; Nguyễn Thị Vân Thái, 2004) Do đó, vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thực vật trở nên phổ biến hơn, xem giải pháp có biên độ an tồn cao để phòng trị bệnh động vật thủy sản (Nguyễn Ngọc Phước cs., 2007a) Từ nhu cầu tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh, tìm cách phòng điều trị bệnh cho thủy cung Vinpearl, nghiên cứu đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh cá cảnh biển thủy cung Vinpearl Bước đầu thử nghiệm khả kháng khuẩn số thực vật tác nhân gây bệnh cho cá” nhằm mục đích: Xác định tác nhân gây bệnh cho cá cảnh biển bể ni Vinpearland gặp cố từ đưa biện pháp trị phòng bệnh hiệu Xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết thơ từ số loài thực vật tác động lên chủng vi khuẩn phân lập CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁ CẢNH BIỂN 1.1.1 Đa dạng sinh học cá biển Theo FishBase (http://www.fishbase.org) - trang Cơ sở liệu loài cá toàn cầu, năm có khoảng 250 lồi cá phát tính đến tháng 12/2012 có 32.400 lồi mơ tả, có 58% cá nước mặn Hầu hết loài cá biển thường sống vùng biển gần bờ thềm lục địa (chiếm 78%), có khoảng 13% sống đại dương 7% sống vùng nước biển sâu (Cohen, 1970) Việt Nam thuộc vùng có khí hậu nhiệt đới, với đường bờ biển dài 3.260 km vùng đặc quyền kinh tế rộng triệu km vùng biển có rạn san hơ lớn Hải Vân - Sơn Trà, Cù Lao Chàm, vịnh Nha Trang, Ninh Hải, Cà Ná, quần đảo Trường Sa, Hoàng Sa, Hà Tiên mang nguồn tài nguyên sinh vật biển phong phú (Nguyễn Thị Thu Hương, 2006) Theo Vũ Cẩm Lương (2008), tổng số loài sinh vật biển biết Việt Nam có khoảng 11.000 lồi, cá biển có đến 2.458 lồi, có 130 lồi có giá trị kinh tế Khảo sát Viện Hải dương học Nha Trang (Nguyễn Hữu Phụng cs., 2001) cho biết cá cảnh biển rạn san hô vùng biển Nha Trang đa dạng bậc nước ta với 398 loài Theo nghiên cứu Nguyễn Nhật Thi Nguyễn Văn Quân (2004), quần đảo Trường Sa ngồi khơi tỉnh Khánh Hòa nơi có nhiều rạn san hơ với 219 lồi cá thuộc 44 họ, có 159 lồi đặc hữu Các lồi cá q như: mao tiên, bàng chài, họ cá thia ưa chuộng nước Philippines, Indonesia, Nhật Bản, Úc, có Việt Nam (Nguyễn Hữu Phụng Nguyễn Văn Long, 1994) 1.1.2 Giá trị kinh tế cá cảnh biển Mỗi năm, giới tiêu thụ khoảng 35 triệu cá cảnh biển, doanh thu đạt từ 200 - 330 triệu USD (Larkin Degner, 2001; Chapman cs., 2007) cung cấp hàng nghìn việc làm cho người dân nước phát triển Giá 51 44 Charles, Raabe L (2011), Pictorial Fish Disease Guide http://www.chucksaddiction.com/disease.html, 45 Cohen DM (1970), "How many recent fishes are there?", Proceedings of the California Academy of Sciences, 38: 341-346 46 Direkbusarakom S, Herunsalee A, Yoshimizu M, Ezura Y, Kimura T (1997), Efficacy of guava (Psidium guajava) extract against some fish and shrimp pathogenic agents Flegel TW, MacRac IH Diseases in Asian Aquaculture III Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila: 359-364 47 Dixon BA, Issvoran GS (1992), "The activity of ceftiofur sodium for Aeromonas spp isolated from ornamental fish", J Wildl Dis 28: 453-456 48 Dúgenci SK, Candan A (2003), "Isolation of Aeromonas Strains from the Intestinal Flora of Atlantic Salmon (Salmo salar L 1758)", Turk J Vet Anim Sci, 27: 1071-1075 49 Enzveiler L, Gressler G, Heckler E, Picoli S, Suyenaga ES (2011), "Evaluation of Antimicrobial Activity of Aqueous Extract of White Tea Camellia sinensis L Kuntze (1887)", Pharmacologia, (5): 131-136 50 Essbauer S, Ahne W (2001), "Viruses of Lower Vertebrates", Journal of Veterinary Medicine B, Infectious Diseases and Veterinary Public Health, 48: 403-475 51 Evans JS, Pattison E, Moris P (1986), Antimicrobial agents from plant cell culture Morris P, Scragg AH, Stafford A, Fowler MW Secondary Metabolism in Plant Cell Cultures Cambridge University Press: 47-53 52 Feinman SE (1998), "Antibiotics in animal feed, drug resistance revisited", ASM New, 64: 24-30 53 FishDoc site (2009), Fish health and water temperatures fishdoc.co.uk, http://www.fishdoc.co.uk/water/temperature.html, May 2013 54 Fleras J (1984), "An overview of the Philippines tropical fish industry", Greenfields, Manila, 14 (2): 50-61 52 55 Fryer JL, Sanders JE (1981), "Bacterial kidney disease of salmonid fish", Annu Rev Microbiol, 35: 273-298 56 Green E (2003), International trade in marine aquarium species: using the Global Marine Aquarium Database Cato J, Brown C Marine Ornamental Species: Collection, Culture, and Conservation Iowa State Press, Ames, USA: 31-48 57 Herdick RP (1998), "Relationships of the Host, Pathogen and Environment: Implications for Diseases of Cultured and Wild Fish Populations", Journal of Aquatic Animal Health, 10: 107-111 58 Hettiarachchi DC, Cheong CH (1994), "Some characteristics of Aeromonas hydrophila and Vibrio species isolated from bacterial disease outbreaks in ornamental fish culture in Sri Lanka", J Natl SciCounc Sri Lanka, 22: 361-369 59 Hoque MDM, Bari ML, Inatsu Y, Juneja VK, Kawamoto S (2007), "Antibacterial activity of guava (Psidium guajava L.) and Neem (Azadirachta indica A Juss.) extracts against foodborne pathogens and spoilage bacteria", Foodborne Pathogens and Disease, (4): 481-488 60 Huys G (2002), "Antibiotic susceptibility testing ofaquacultureassociatedbacteria with the disc diffusion method", Standard Operationg Procedure, Asiaresist 61 Indul MN, HathaII AAM, AbiroshI C, HarshaI U, VivekanandanII G (2006), "Antimicrobial activity of some of the South-Indian spices against serotypes of Escherichia coli, Salmonella, Listeria monocytogenes and Aeromonas hydrophila", Brazilian Journal of Microbiology, 37 (2): 153-158 62 Ismail M, Minhas PS, Khanum F, Sahana VM, Sowmya C (2012), "Antibacterial Activity of Leaves Extract of Guava (Psidium Guajava)", International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, (1) 53 63 Jayavignesh V, Kannan KS, Bhat AD (2011), "Biochemical characterization and cytotoxicity of the Aeromonas hydrophila isolated from Catfish", Archives of Applied Science Research, (3): 85-93 64 Jonklaas RSL (1985), "Population fluctuations in some ornamental fishes and invertebrates off Sri Lanka", Symposium on Endangered Marine Animals and Marine Parks, Cochin, India: 47 65 Justine JL, Leblanc P, Keller F, Lester RJG (2009), "Turbellarian black spot disease in bluespine unicornfish, Naso unicornis, in New Caledonia, due to the parasitic turbellarian Piscinquilinus sp", Disease of Aquatic Organisms, 85: 245-249 66 Klinger RE, Floyd RF (1996), Fungal Diseases of Fish Report to Institude of Food and Agricultural Sciences 67 Kumar A, Kumar A, Thakur P, Patil S, Payal C, Kumar A, Sharma P (2012), "Antibacterial activity of green tea (Camellia sinensis) extracts against various bacteria isolated from environmental sources", Recent Research in Science and Technology, (1) 68 Kuo TF, Chung CD (1994), "A survey of bacterial diseases from infectious aquarium fishes", Mem Coll Agric Natl Taiwan Univ, 34: 239246 69 Lamy B, Laurent F, Verdier I, Decousser JW, Lecaillon E, Marchandin H, Roger F, Tigaud S, Montclos H, Kodjo A (2010), "Accuracy of commercial systems for identifying clinical Aeromonas isolates", Diagn Microbiol Infect Dis, 67: 9-14 70 LaPatra SE, Groberg WJ, Rohovec JS, Fryer JL (1990), "Size-related susceptibility of salmonids to two strains of infectious hematopoietic necrosis virus", Transactions of the American Fisheries Society, 119: 2530 71 Larkin S, Degner R (2001), "The US wholesale market for marine ornamentals", Aquarium Sciences and Conservation, 3: 13-24 54 72 Levy SB (1998), "The challenge of antibiotic resistance", Scientific American, 278: 46-53 73 Lewbart G, Stoskopt M, Losordo T, Geyer J, Owen J, White Smith D, Law M, Altier C (1999), "Safety and efficacy of the environmental products group master flow aquarium manegement system with Aegis Microbe Shield TM", Aquaculture Engineering, 19: 93-98 74 Lewis K, Ausubel FM (2006), "Prospects for plant derived antibacterial", Nat Biotechnol, 24: 1504-1507 75 Martı´nez-Murcia AJ, Saavedra MJ, Mota VR, Maier T, Stackebrandt E, Cousin S (2008), "Aeromonas aquariorum sp nov., isolated from aquaria of ornamental fish", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58: 1169-1175 76 Mbata TI, Debiao LU, Saikia A (2008), "Antibacterial activity of the crude extract of Chinese green tea (Camellia sinensis) on Listeria monocytogenes", African Journal of Biotechnology, (10): 1571-1573 77 Minchew CD, Yarbrough JD (1977), "The occurrence of fin rot in mullet (Mugil cephalus) associated with crude oil contamination of an estuarine pond-ecosystem", Journal of Fish Biology, 10 (4): 319-323 78 Nalina T, Rahim ZHA (2007), "The Crude Aqueous Extract of Piper betle L and its Antibacterial Effect Towards Streptococcus mutans", American Journal of Biotechnology and Biochemistry, (1): 10-15 79 Noga EJ (2010), Fish disease-diagnosis and treatment John Wiley & Sons 80 Fish disease: diagnosis and treatment Wiley-Blackwell 81 Prescott LM, Harley JP, Klein AD (2005), "Drug Resistance", WCB McGraw-Hill, Microbiology 6th International Edition: 1212 82 Rahman T, Akanda MMR, Rahman MM, Chowdhury MBR (2009), "Evaluation of the efficacies of selected antibiotics and medicinal plants 55 on common bacterial fish pathogents", Journal of the Bangladesh Agricultural University, (1): 163-168 83 Ramamoorthy K, Bhuvaneswari S, Sankar G, Sakkaravarthi K (2010), "Proximate composition and carotenoid content of natural carotenoid sources and its color enhancement on marine ornametal fish Amphiprion ocellaris", World Journal of Fish and Marine Sciences, 2: 545-550 84 Reilly A, Kaeferstein F (1997), "Food safety hazards and the application of the principles of the hazard analysis and critical control point (HACCP) system for their control in aquaculture production", Aquaculture Research, 28 (10): 735-752 85 Rødsaether MC, Olafsen J, Raa J, Myhre K, Steen JB (1977), "Copper as an initiating factor of vibriosis (Vibrio anguillarum) in eel (Anguilla anguilla)", J Fish Biol, 10: 17-21 86 Saavedra MJ, Guedes-Novais S, Alves A, Rema P, Taca˜o M, Correia A, Martı´nez-Murcia AJ (2004), "Resistance to -lactam antibiotics in Aeromonas hydrophila isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)", Int Microbiol, 7: 207-211 87 Shitut S, Pandit V, Mehta BK (1999), "The antimicrobial efficiency of Piper betle Linn leaf (stalk) against human pathogenic bacteria and phytopathogenic fungi.", Cent Eur J Public Health, (3): 13-79 88 Shukla R, Satish V, Singh VK, Kumar S, Gupta S, Gavani U (2000), "Antibacterial Activity of Fresh leaves of (Piper betle Linn)", The Pharma Research, 89 Sindermann CJ (1990), Principal Diseases of Marine Fish and Shellfish Gulf Professional Publishing 90 Singleton P, Sainsbury D (1999), Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Second Edition 56 91 Snieszko SF (1973), "Recent advances in scientific knowledge and developments pertaining to diseases of fishes", Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, 17: 291-314 92 Sridevi M, Sathiraju D, Rao BK (2011), "Antibacterial activity of herbal plant extracts towards Vibrio harveyi", J Mar Biol Ass India, 53 (2): 281283 93 Syromiatnikova IP (1949), "A new turbellarian parasitic in fish and called Ichthyophaga subcutanea", Dokl Akad Nauk SSSR, 68: 805-808 94 Terry DB (2007), "Feature Article: Identifying Parasitic Diseases in Marine Aquarium Fish - A Hobbyist’s Guide to Identifying Some Common Marine Aquarium Parasites ", Advanced Aquarist, 95 The Clinical and Laboratory Standards Institute 2007 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Seventeenth informational supplement in Clinical and Laboratory Standards Institute document M100-S17 Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA 96 Tookwinas S, cs (1986), " Study on aquatic environment of seabass cage culture at Songkhla Outer Lake: investigation on the cause of sudden fish mortality", Thai Fisheries Gazette, 39 (3): 255-263 97 Vanichkul K, Areechon N, Kongkathip N, Srisapoome P, Chuchird N (2010), "Immunological and Bactericidal Effects of Turmeric (Curcuma longa Linn.) Extract in Pacific White Shrimps (Litopenaeus vannameiBoone)", Kasetsart J (Nat Sci), 44: 850-858 98 Velmurugan S, Citarasu T (2003), "Effect of Herbal Antibacterial Extracts on the Gut Floral Changes in Indian White Shrimp Fenneropenaeus indicus", Romanian Biotechnological Letters, 15: 57 99 Wabnitz C, Taylor M, Green E, Razak T (2003), "From Ocean to Aqurrium: The Global Trade in Marine Ornamental Species", UNEP World Conservation Monitoring Centre Cambridge UK: 19 100 Wallace IS, Murray AG, Gregory A, Munro ES, Raynard RS (2005), The prevalence of infectious pancreatic necrosis virus in wild marine fish from Scotland with reference to clinically infected salmon farms 101 Walsh WJ (1999), "Community-based management of West Hawaii’s aquarium collection fishery", First International Conference of Marine Ornamentals Hawaii 102 Wardlaw AC (1985), "Practical statistics for experimental biologists", John Wiley & Sons, Chichester, 8: 299-316 103 Warren JW (1983), The Nature of Fish Diseases Meyer FP, Warren JW, Carey TG A Guide to Intergrated Fish Health Management in the Great Lakes Basin Ann Arbor, Mich.: Great Lakes Fishery Commission.: 7-13 104 Witte W (1998), "Medical consequences of antibiotic use in agriculture", Science, 279: 996-997 105 Wood EM (1985), Exploitation of Coral Reef Fishes for the Aquarium Trade Report to The Marine Conservation Society 121pp 106 Collection of coral reef fish for aquaria: Global trade, conservation issues and management strategies Marine Conservation Society, UK 107 Zambare V, Bhoyte S (2009), "Antimicrobial activity of Tea (Camellia sinensis)", Internet Journal of Nutrition & Wellness, (1): 108 Ziskowski J, Murchelano R (1975), "Fin erosion in winter flounder ", Mar Pollut Bull, 6: 26-29 PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ SINH HÓA CỦA KIT API-20E Chỉ tiêu Dương tính Âm tính Vàng Khơng màu ADH (Arginine dihydrolase) Đỏ Cam LDC (Lysine decarboxylase) Đỏ Cam ODC (Ornithine decarboxylase) Đỏ Cam CIT (Citrate utilization) Xanh biển Xanh H2S (Hydrogen sulfide ) Đen Không màu Hồng Cam Nâu Cam Vòng đỏ Vòng vàng VP (Voges - Proskauer) Đỏ Không màu GEL (Gelatinase) Đen Không màu GLU (Glucose) Vàng Xanh biển MAN (Mannitol) Vàng Xanh biển INO (Inositol) Vàng Xanh biển SOR (Sorbitol) Vàng Xanh biển RHA (Rhamnose) Vàng Xanh biển SAC (Saccharose/Sucrose) Vàng Xanh biển MEL (Melibiose) Vàng Xanh biển AMY (Amygdalin) Vàng Xanh biển ARA (Arabinose) Vàng Xanh biển ONPG (Ortho-Nitrophenol test for beta-Galactosidase) URE (Urea hydrolysis) TDA (Tryptophan Deaminase) IND (Indole) PHỤ LỤC BẢNG ĐƯỜNG KÍNH VỊNG KHÁNG KHUẨN CHUẨN STT Kháng sinh Nồng độ kháng sinh Đường kính E.coli ATCC Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) 25922 R I S Amoxicilin AMX (25µg) 16-22 ≤ 11 12-14 ≥ 15 Cefadroxil CD (30µg) 17-22 ≤ 14 15-17 ≥ 18 Cefalexin CL (30µg) 16-21 ≤ 14 15-17 ≥ 18 Cefixime CFM (5µg) 23-27 ≤ 15 16-18 ≥ 19 Chloramphenicol C (30µg) 21-27 ≤ 12 13-17 ≥ 18 Doxycyclin D (30µg) 18-24 ≤ 12 13-15 ≥ 16 Kanamycin K (30µg) 17-25 ≤ 13 14-17 ≥ 18 Tetracycline TE (30µg) 18-25 ≤ 14 15-18 ≥ 19 PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐẶC TÍNH SINH LÝ VÀ SINH HĨA CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ CẢNH BIỂN VINPEARL Môi trường KIA Chủng Lên men Lên men Nồng độ muối Sinh Sinh 0% 3% 5% 6% Nhiệt độ O O 8% 10% C 42 C Glucose Lactose H2 S D1-2 + - - - + + + - - - - - Nhóm (5 chủng) D2-1 + - - - + + + - - - - - Khuẩn lạc trong, D2-12 + - - - + + + + + + - + D3-2 + - - - + + + + - - - + D3-6 + - - - + + + - - - - - Nhóm (5 chủng) D1-6 + - - - + + + - - - - + Khuẩn lạc xanh, D1-11 + - - - + + - - - - - - đường kính 1-1.5mm tròn bóng, đường kính 2-2.5mm D2-5 + - - - + + + + + + - + D3-3 + - - - + + + + + - - + D3-4 + - - - + + - - - - - - D1-7 + - - - + + + + + - - + D1-10 + - - - + + + - - - - + Nhóm (9 chủng) D1-12 + - - - + + + - - - - + Khuẩn lạc vàng, D2-6 + - - - + + + + + - - + D2-7 + - - - + + + - - - - + D2-9 + - - - + + + + - - - + D2-10 + - - - + + + + + + - + D2-11 + - - - + + + - - - - + D3-1 + - - - + + + + - - - + tròn bóng, đường kính 2-2.5mm D1-1 + - - - + + + - - - - - D1-3 + + - - + + - - - - - - D1-4 + + - - + + + - - - - - Nhóm (11 chủng) D1-5 + - - - + + + - - - - - Khuẩn lạc vàng, D1-8 + + - - + + + - - - - - D1-9 + - - - + + + - - - - - D2-2 + - - - + + + - - - - - D2-3 + - - - + + + + - - - + D2-4 + + - - + + + - - - - + D2-8 + + - - + + + + + - - + D3-5 + - - - + + + + - - - - nhăn, tâm có dạng vòng, đường kính 1.5-2mm PHỤ LỤC SƠ ĐỒ ĐỊNH DANH VI KHUẨN GRAM ÂM HÌNH QUE (THEO KHĨA PHÂN LOẠI BERGEY) + Oxidase Aeromonas, Psedomonas, Vibrio + Vibrio spp., Aeromonas spp - - Enterobacteriaceae Lên men glucose Psedomonas + Sử dụng Na để phát triển - + Aeromonas spp Vibrio spp V cholera Phát sáng + V fischeri V fluvialus V alginolyticus - Lên men + Vibrio spp khác lactose V logei - V furmissii V hydrophila V parahaemolyticus V orientalis V shigelloides V splendidius V mimicus V vulnificus + NaCl 0% - V parahaemolyticus V shigelloides (không lên men lactose) V mimicus V vulnificus (lên men lactose) PHỤ LỤC KẾT QUẢ LẬP KHÁNG SINH ĐỒ CỦA CHỦNG VI KHUẨN D1-8 VÀ D2-10 Kháng sinh Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) D1-8 Amoxicilin - AMX (25µg) D2-8 39,67 ± 1,53 Cefadroxil - CD (30µg) 19,33 ± 1,53 30,67 ± 1,53 Cefalexin - CL (30µg) 17,67 ± 1,53 34 ± 3,61 Cefixime - CFM (5µg) 21,33 ± 1,53 Chloramphenicol - C (30µg) 32,33 ± 1,53 24 ± 1,0 Doxycyclin - D (30µg) 30,67 ± 0,58 38,33 ± 3,06 Rifampicin - RA (5µg) 14,33 ± 1,15 20,33 ± 2,52 Tetracycline - TE (30µg) 32,67 ± 1,15 30,33 ± 1,53 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH [1] http://www.ipm.iastate.edu/ipm/icm/2007/7-2/cornfungicides.html [2] http://freshwatercichlids.com [3] http://fishfantasy.blogspot.com [4] http://www.fishhelpline.co.uk [5] http://www.kmle.co.kr [6] http://www.reefland.com [7] http://tnfish.org/FishDiseasesParasites.htm [8] http://forum.marinedepot.com/Topic72449-10-1.aspx [9] http://www.vetcare.gr/ARTPRES/IPNV_first_isolation_Greece.htm ... điều trị bệnh cho thủy cung Vinpearl, nghiên cứu đề tài Xác định tác nhân gây bệnh cá cảnh biển thủy cung Vinpearl Bước đầu thử nghiệm khả kháng khuẩn số thực vật tác nhân gây bệnh cho cá nhằm... vi khuẩn cá bệnh - Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa, độc lực định danh chủng vi khuẩn có khả gây bệnh - Xác định tác nhân gây bệnh - Xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết thơ từ số lồi thực. .. mục đích: Xác định tác nhân gây bệnh cho cá cảnh biển bể nuôi Vinpearland gặp cố từ đưa biện pháp trị phòng bệnh hiệu Xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết thơ từ số lồi thực vật tác động